La Quantification Relative
quantitative PCR: a snapshot of Efficacité. PCR. • Enzyme. • Méthode de détection. • Linéarité de l'essai ... Calcul de l'Efficacité du PCR.
Guide de validation des méthodes danalyses
28 oct. 2015 7.4.3 Fonction d'étalonnage/Efficacité (PCR) . ... vue de la validation d'une méthode d'analyse quantitative par construction du profil d' ...
ÉVALUATION DE LA PERFORMANCE DU qPCR POUR LE
Mots clés : qPCR PCR quantitatif
PCR quantitative en temps réel et PCR digitale
Principes de la PCR quantitative en temps réel : notion de Cq formats de fluorescence
De lHistoire Naturelle de la QPCR A Ses Développement Actuels
PCR quantitative avec une sonde TaqMan® •Avoir une efficacité de 100% pour chacun des dosages ... calcul des résultats par comparaison des Ct.
d i Introduction au PCR en temps réel
Règlé empiriquement ou par un calcul statistique au dessus du background ( La pente de la courbe standard peut être directement corrélée à l'efficacité.
Diapositive 1
1 juin 2012 I. La PCR quantitative: principe et généralités ... efficacité (calcul de AE): réactions de Q-PCR ( en triplicats) sur des dilutions en ...
Protocole de Validation pour les kits PCR Legionella
Etude de la fonction de calibrage de l'étape PCR quantitative . Calculer l'efficacité e selon l'équation (8) (voir également l'Annexe C.3 de la norme) ...
Quoi faire avec des résultats de qPCR
Vous amplifiez une région de l'ARNm avec des oligos et une sonde fluorescente. La machine qPCR mesure l'intensité de fluorescence émise à chaque cycle. PCR.
la pcr quantitative en temps reel ou la taqman
la technique de PCR quantitative par détection en temps réel de la fluorescence il n'existe pas de modèle fiable permettant de calculer.
Absolute and Relative Quantification - Agilent Technologies
PCR efficiency • When PCR efficiency is 100 the amount of product doubles with each cycle • Lower efficiency means that the Cq is delayed and less product is made each cycle PCR efficiency E=100 lower lowest PCR efficiency • Can be expressed in three ways: 1)As a percentage: 0-100 2)As a proportion: 0-1 3)As a fold increase: 1-2
TD 4b: PCR - INRA
Equation de l’amplification de la PCR X n = X o x (1 + E x)n X n = nombre de cibles au cycle n X o = nombre initial de molécules cibles E x = efficacité de la PCR n = nombre de cycles de PCR
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Guide sur le PCR en temps réel (qPCR) Un service complet est offert par la plateforme de génomique de l’IRIC pour le qPCR incluant l’analyse de votre ARN la préparation de vos cDNA le design des essais la validation et l’analyse de vos résultats Vous pouvez aussi préparer les réactions vous-même et utiliser par
Performance Indicators
To eliminate the different measurement scales used by the analytical method based on concentration levels and fluorescence levels [34], we divided the data of all concentrations by the highest concentration data and all fluorescence data by the average value of the maximum observed target quantity (F0), so that the average value of the maximum conc...
Indicator Evaluation
In the supplementary information, the original amplification experiment data of the two data sets used in this study were obtained from Reference [28] after being processed into the readable format of the CqMAN system. We imported the data of these two data setsinto the CqMAN system to obtain the F0, Cq, and E calculated by the CqMAN, integrated th...
Biomarker Dataset Analysis
The performance indicator values determined from the concentration series included in the measurement of the 20 genes are summarized in box-and-whisker plots. The boxes range from the 25th to the 75th percentile and are divided by the median; the whiskers are set at the 5th and 95th percentile (A) Bias in the slope level, which is based on the degr...
What does a low PCR efficiency mean?
PCR efficiency • When PCR efficiency is 100%, the amount of product doubles with each cycle • Lower efficiency means that the Cq is delayed and less product is made each cycle PCR efficiency E=100% lower lowest PCR efficiency • Can be expressed in three ways: 1)As a percentage: 0-100% 2)As a proportion: 0-1 3)As a fold increase: 1-2
What are the basic principles of qPCR?
The basic principles of qPCR are discussed on this page, and the mechanisms of the common detection chemistries are described in Quantitative PCR and Digital PCR Detection Methods. When performing qPCR, a fluorescent reporter dye is used as an indirect measure of the amount of nucleic acid present during each amplification cycle.
How does a threshold line affect CQ PCR efficiency?
Cycle threshold Placement of threshold line affects Cq PCR efficiency • When PCR efficiency is 100%, the amount of product doubles with each cycle • Lower efficiency means that the Cq is delayed and less product is made each cycle PCR efficiency E=100% lower lowest PCR efficiency
What is the difference between qPCR and conventional PCR?
Since the products are detected as the reaction proceeds, qPCR has a much wider dynamic range of analysis than conventional, end-point PCR; from a single copy to around 10 11 copies are detectable within a single run.
Juin 2012
ATELIER EPIGENETIQUE
Utilisation de la Q-PCR pour analyser des données de ChIP ou de MeDIPEmmanuèle Mouchel-Vielh
I. La PCR quantitative: principe et généralités II. Interprétation des résultats de Q-PCR pour les expériences de ChIP et de MeDIPX0 copies de la séquence cible au départ
Xn copies de la séquence cible à la fin
n cycles de PCRLa technique de PCR
Equation de la PCR:
Xn=X0AEn
AE͗ efficacitĠ d'amplification 0фAEф2; n: nombre de cyclesSi AE=2, Xn= X02n
9Phase 1: amplification exponentielle mais
produit non détectable9Phase 2: amplification exponentielle
9Phase 3: amplification, phase " log-linéaire »
9Phase 4͗ phase de plateau, plus d'amplification
(saturation) ¾PCR classique (en point final): on regarde les produits au plateau (non quantitatif) ¾PCR quantitative: on quantifie les produits pendant tout le déroulement de la PCR (quantitatif dans la phase exponentielle) Rn n 1 2 3 4CT = valeur du cycle à partir
duquel le produit devient détectableEquation de la PCR, courbe primaire, CT
+ concentré - concentré T est faible
Pour AE=2, une différence de 1 CT
Propriétés générales de la PCR quantitative (= en temps réel)9 Quantification absolue ou relative
9 Trğs nombreuses applications (gĠnotypage, Ġtude de l'edžpression des gğnes, chIP...)
9Pour avoir la meilleur efficacité possible: amplicons de petite taille (70 à 250/300 bp)
9 Principe général de détection: utilisation d'un (ou plusieurs) fluorochromes:
9 Principe des appareils de Q-PCR: un thermocycleur couplé à un fluorimètre qui mesure
la fluorescence émise à chaque cycle (fluorimètre= laser pour exciter les fluorochromes+ système de détection de la fluorescence émise)9Etablissement de la courbe primaire de PCR : émission de fluorescence=f(n).
(de manière absolue ou relative) la quantité X0 prĠsente au dĠpart dans l'Ġchantillon.
Q-PCR en SYBR-Green
que sous forme libreAvantages:
9Méthode la moins chère
Inconvénients:
9 Ne permet pas de faire des PCR multiplex (=amplifications de plusieurs séquences
dans le même tube)1 pic= 1 amplicon (possibilitĠ d'obserǀer les dimğres d'amorces)
Avantages et inconvénients de la Q-PCR en SYBR-GreenCourbe de fusion
Fluorescence=f(T)
Amplicon
spécifiqueDimères
dans le témoin négatifIntensité
Excitation Emission Excitation Emission
Reporter- R Quencher Q
FRET= Fluorescence Resonance Energy Transfer
99 quand R et Q sont proches: Q capte la fluorescence émise par R
9 - Q-PCR et technologie FRET: utilisation de sondes TaqMan9 Utilisation de 2 amorces et d'une sonde
TaqMan: 20 à 40nt, interne aux 2 amorces,
spécifique de la séquence à amplifier, et par un fluorochrome Q; Tm plus élevé que celui des amorces9 En cours d'Ġlongation, la sonde est lysĠe͗
séparation de R et Q9 A la fin de l'Ġtape d'Ġlongation, edžcitation de
R et mesure à émission R: pour chaque
molécule synthétisée, un R émet de la fluorescenceAvantages:
9 permet les PCR multiplex (utilisation de différents couples Q-R)
9 élimine le problème des hybridations aspécifiques
9 plus sensible que la méthode SYBR-Green
Inconvénients:
sonde TaqMan)9 Plus cher que la méthode SYBR-Green
Avantages et inconvénients de la Q-PCR en sondes TaqManEdžemples d'applications de la Y-PCR
9Analyse du niǀeau d'edžpression des gğnes, mise en Ġǀidence de variants
9Génotypage, étude de polymorphismes
9 Analyse d'edžpĠriences de ChIP ou de MeDIP
Interprétation des résultats de ChIP et MeDIP par Q-PCR9 Choix du système de fluorescence (de préférence TaqMan, mais possible aussi en
SYBR-Green)
9 Choix de la séquence à amplifier: petite taille des amplicons (50 à 150 bp)
9Choix des amorces: critères classiques (absence de structure secondaire, pas
d'appariement entre amorces, spĠcificitĠ)9 Validation des amorces͗ rĠalisation d'une courbe de calibration pour vérifier leur
efficacité (calcul de AE): réactions de Q-PCR ( en triplicats) sur des dilutions en série de préférence: non nécessaire de connaitre la concentration de la séquence matrice dans cet ADN): AE doit être proche de 2Eǀaluation de l'efficacitĠ de la PCR et dĠtermination des ǀaleurs y0 dans les échantillons
Courbe primaire: Fluorescence=f(nb de cycles)
Permet de déterminer la valeur de CT pour chaque pointCourbe standard: CT=f(Log Xo)
Etablie à partir des points de la gamme de calibration. Permet de déterminer le coefficient de corrélation r2 (doit être supérieur à 0,985) 105%)Permet de déterminer la valeur de X0 dans les échantillons, à partir de leur valeur de CT
Equation de la réaction de PCR:
AE= Amplification Efficiency 0 Xn = X0 *AE n
Pour n=CT:
XCT= X0 *AE CT
CT= Log XCT-Log X0
LogAE CT= Log X0(-1/LogAE)+ Log XCT(1/LogAE)
CT=aLog X0+b Pente a= -1/LogAE
AE= 10 ( - 1 / a )
Pour a=-3,32 AE=2
si AE=2, efficacité=100% Calculs pour les expériences de ChIP et MeDIP (1) Faire la moyenne des CT des duplicats ou triplicats Calcul du pourcentage d'input immunoprécipité par l'anticorps: comparaison des CT, en corrigeant le CT de l'input par rapport au facteur de dilution (FD= facteur de dilution de l'input): ChIP: dilution 1: 15/100 (p23); dilution 2: 20/100 (p33); total: 300/10000; FD=10000/300=33,3
MeDIP: dilution 7,5/100 (p29); FD=100/7,5=13,3 % input= AE(CTinput_corrigé - CTIP)x 100%=AECTx100 avec CTinput_corrigé=CTinput-log2(FD) Ici: Pour Hoxc8: AE=1,96~2
Pour le ChIP: Ctinput_corrigé=Ctinput-5,1
Pour le MedIP: Ctinput_corrigé=Ctinput-3,7
22)#()#(InputsdChIPsdsd
Calculs pour les expériences de ChIP et MeDIP (2) Pour chaque ChIP, calculer la déviation standard du pourcentage d'input: 222)#(.....)2#()1#(nsdsdsdsd
Pour n expériences répétées:
Addendum: méthodes de calcul pour la Q-RTPCR en quantification relative Q-RT-PCR avec quantification relative
Echantillons:
1 condition contrôle et 1 condition expérimentale
DĠtermination du taudž d'edžpression du gène cible C Edžtraction d'ARN
Synthğse d'ADNc
Expérience de PCR
(amplification de C et d'un gène de référence R dont l'edžpression est constante) Analyse des rĠsultats͗ comparaison du niǀeau d'edžpression de C dans les 2 conditions expérimentales: normalisation par rapport ă l'edžpression du gğne de rĠfĠrence; choix de la méthode de calcul pour traiter les données
Quelques méthodes de calcul pour la quantification relative (1) Méthode 2-CT (Livak et al., Methods 2001, 402-408): calcul direct sur les valeurs de CT, en présumant que les efficacités du gène cible et du gène de référence sont toutes les 2 égales à 100% (AE=2)
CT=CT gène cible-CT gène de référence
CT=(CT)condition contrôle-(CT)condition expérimentale Calcul de 2-CT:
Si 2-CT >1, gène sur-exprimé dans la condition expérimentale par rapport à la condition contrôle
Si 2-CT <1, gène sous-exprimé dans la condition expérimentale par rapport à la condition contrôle
Méthode à éviter si les efficacités ne sont pas identiques et égales à 100%: si efficacité cible-efficacité référence=0,03, erreur de 209% efficacité référence-efficacité cible=0,03, erreur de 47% Quelques méthodes de calcul pour la quantification relative (2) Méthode de Pfaffl (Pfaffl., NAR 2001): calcul direct sur les valeurs de CT, en tenant compte des efficacités
du gène cible et du gène de référence, qui ne doivent pas forcément être identiques et égales à 100%
CT cible=CT condition contrôle-CT condition expérimentale CT référence=CT condition contrôle-CT condition expérimentale Ratio (expérimental/contrôle)=
(AEcible)CT cible (AEréférence)CT référence Exemple:
AEcible= 1,9; AEréférence= 1,97
échantillon CT
cible CT réf CT cible CT référence Ratio
Contrôle
37,01 18,83 0 0 1
Expé 1 29,43 18,59 7,58 0,24 110,2
Expé 2 34,43 18,59 2,58 0,24 4,4
-A partir des courbes de calibration, détermination de Log(X0) dans les échantillons étudiés (condition contrôle
et expérimentale) pour le gène cible et le gène de référence. expérimentale): Norm=X0(gène cible)/X0(gène référence) Ratio= Norm(expé)/Norm(contrôle):
Si R>1, gène sur-exprimé dans la condition expérimentale par rapport à la condition contrôle;
Si R<1, gène sous-exprimé dans la condition expérimentale par rapport à la condition contrôle
Quelques méthodes de calculs pour la quantification relative (3) Quantification par la méthode de la courbe de calibration (ABI, user bulletin n2): calcul des quantités X0 à partir des CT et de la courbe standard échantillon CT cible CT réf X0 cible X0 référence Norm Ratio
Contrôle
37,01 18,83 1,4. 10-3 346 4,05. 10-6 1
Expé 1 29,43 18,59 1,8. 10-1 417 4,32. 10-4 106,7 Expé 2 34,43 18,59 7,2. 10-3 417 1,73. 10-5 4,3 Exemple précédent:
AEcible= 1,9; AEréférence= 1,97
quotesdbs_dbs33.pdfusesText_39
Xn = X0 *AE n
Pour n=CT:
XCT= X0 *AE CT
CT= Log XCT-Log X0
LogAECT= Log X0(-1/LogAE)+ Log XCT(1/LogAE)
CT=aLog X0+b Pente a= -1/LogAE
AE= 10 ( - 1 / a )
Pour a=-3,32 AE=2
si AE=2, efficacité=100% Calculs pour les expériences de ChIP et MeDIP (1) Faire la moyenne des CT des duplicats ou triplicats Calcul du pourcentage d'input immunoprécipité par l'anticorps: comparaison des CT, en corrigeant le CT de l'input par rapport au facteur de dilution (FD= facteur de dilution de l'input): ChIP: dilution 1: 15/100 (p23); dilution 2: 20/100 (p33); total: 300/10000;FD=10000/300=33,3
MeDIP: dilution 7,5/100 (p29); FD=100/7,5=13,3 % input= AE(CTinput_corrigé - CTIP)x 100%=AECTx100 avec CTinput_corrigé=CTinput-log2(FD)Ici: Pour Hoxc8: AE=1,96~2
Pour le ChIP: Ctinput_corrigé=Ctinput-5,1
Pour le MedIP: Ctinput_corrigé=Ctinput-3,7
22)#()#(InputsdChIPsdsd
Calculs pour les expériences de ChIP et MeDIP (2) Pour chaque ChIP, calculer la déviation standard du pourcentage d'input:222)#(.....)2#()1#(nsdsdsdsd
Pour n expériences répétées:
Addendum: méthodes de calcul pour la Q-RTPCR en quantification relativeQ-RT-PCR avec quantification relative
Echantillons:
1 condition contrôle et 1 condition expérimentale
DĠtermination du taudž d'edžpression du gène cible CEdžtraction d'ARN
Synthğse d'ADNc
Expérience de PCR
(amplification de C et d'un gène de référence R dont l'edžpression est constante) Analyse des rĠsultats͗ comparaison du niǀeau d'edžpression de C dans les 2 conditions expérimentales: normalisation par rapportă l'edžpression du gğne de rĠfĠrence; choix de la méthode de calcul pour traiter les données
Quelques méthodes de calcul pour la quantification relative (1) Méthode 2-CT (Livak et al., Methods 2001, 402-408): calcul direct sur les valeurs de CT, enprésumant que les efficacités du gène cible et du gène de référence sont toutes les 2 égales à 100% (AE=2)
CT=CT gène cible-CT gène de référence
CT=(CT)condition contrôle-(CT)condition expérimentaleCalcul de 2-CT:
Si 2-CT >1, gène sur-exprimé dans la condition expérimentale par rapport à la condition contrôle
Si 2-CT <1, gène sous-exprimé dans la condition expérimentale par rapport à la condition contrôle
Méthode à éviter si les efficacités ne sont pas identiques et égales à 100%: si efficacité cible-efficacité référence=0,03, erreur de 209% efficacité référence-efficacité cible=0,03, erreur de 47% Quelques méthodes de calcul pour la quantification relative (2)Méthode de Pfaffl (Pfaffl., NAR 2001): calcul direct sur les valeurs de CT, en tenant compte des efficacités
du gène cible et du gène de référence, qui ne doivent pas forcément être identiques et égales à 100%
CT cible=CT condition contrôle-CT condition expérimentale CT référence=CT condition contrôle-CT condition expérimentaleRatio (expérimental/contrôle)=
(AEcible)CT cible (AEréférence)CT référenceExemple:
AEcible= 1,9; AEréférence= 1,97
échantillon CT
cibleCT réf CT cible CT référence Ratio
Contrôle
37,01 18,83 0 0 1
Expé 1 29,43 18,59 7,58 0,24 110,2
Expé 2 34,43 18,59 2,58 0,24 4,4
-A partir des courbes de calibration, détermination de Log(X0) dans les échantillons étudiés (condition contrôle
et expérimentale) pour le gène cible et le gène de référence. expérimentale): Norm=X0(gène cible)/X0(gène référence)Ratio= Norm(expé)/Norm(contrôle):
Si R>1, gène sur-exprimé dans la condition expérimentale par rapport à la condition contrôle;
Si R<1, gène sous-exprimé dans la condition expérimentale par rapport à la condition contrôle
Quelques méthodes de calculs pour la quantification relative (3) Quantification par la méthode de la courbe de calibration (ABI, user bulletin n2): calcul des quantités X0 à partir des CT et de la courbe standard échantillon CT cible CT réf X0 cible X0 référenceNorm Ratio
Contrôle
37,01 18,83 1,4. 10-3 346 4,05. 10-6 1
Expé 1 29,43 18,59 1,8. 10-1 417 4,32. 10-4 106,7 Expé 2 34,43 18,59 7,2. 10-3 417 1,73. 10-5 4,3Exemple précédent:
AEcible= 1,9; AEréférence= 1,97
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