[PDF] Guide de lutilisateur – PCR en temps réel – LC480

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Responsable:PhilipeLampron

LocalBͲ312;poste5560

P P CC

RReenntteemmppssrrééeell

LLiigghhttCCyycclleerr44

88
00

Guidedel'utilisateur

Départementdebiochimie

UniversitédeMontréal

Tabledesmatières

1. Présentationdel'instrumentetIntroductionsurlabaseduPCRentempsréel

a. ComposantesduLightCycler480etprincipesdebase b. StratégiesetapplicationsutiliséespourlePCRentempsréel

2. Miseenmarchedel'instrumentetdel'ordinateur

3. Utilisationdulogicieldel'instrument

a. Informationssurlabasededonnées b. Créationducompteutilisateur c. Entréedesparamètresexpérimentaux(unaperçu) d. Analyseparquantificationabsolue(unaperçu) e. Créationd'unrapportd'expériencecomplet f. Exportation/Importationdefichiers

4. Exempled'expérienceenSYBRGreen(Source:Roche)

5. Consignes

6. Matérielssupplémentaires:

a. FeuilletsdetravailSYBRGreenetSonded'hydrolyse(UPL)b. Plandeplaque96puits. 2

Présentationdel'instrument

1. ComposantesduLightCycler480etprincipesdebase

l'utilisationdesfluorophores.

THERMOCYCLEUR

SYSTÈMEOPTIQUE

LampeauXénon

CaméraCCD

5filtresd'excitation:

450,483,523,558,615nm

6filtresdedétection:

500,533,568,610,640,670nm

ÉlémentsPeltier

ThermaͲBase

TM

Chambrede

refroidissementBlocͲplaque

PrincipedebaseduPCRentempsréel

et surlamesureencontinuedesonproduit. est .L'obtentiondelacinétiquecomplète

PCRenpointfinal

Source:Wikipédia

3

Quantification

HybProbeProbes483533/610

533/640

533/670FluoͲLightCycler

RED 610

FluoͲLightCycler

RED640

FluoͲCy5Quantification

SNPAnalysis

HydrolysisProbes450

483
523
558
558

615500

533
568
610
640

670LightCycler

CYAN500

FAM

VIC/HEX

LightCycler

RED610

LightCycler

RED640

Cy5Quantification

Universal

SimpleProbe

Probes483533FluoresceinSNPAnalysis

4 5 2 . Miseenmarchedel'instrumentetdel'ordinateur o Codedelumièredel'instrument:

Allumezl'ordinateuretl'écran,

CTRL+ALT+DELpourouvrirunesession

o Username:operator o Password:LC480(respectezlacasse)

Votresessionestmaintenantouverte

o Sinon,activezleraccourcicorrespondantdansledossierExor4Basede données. 3 . Utilisationdulogicieldel'instrument

1. Informationssurlabasededonnées

départementutilisantleLightCycler480.

ElleportelenomdeXDMS_T

Initialisationdel'instrument

plaqueàl'intérieur

Plaqueestenchargement

àl'intérieur

Instrumentenfonction

Boutondechargementdelaplaque

2 . Créationducompteutilisateur données. o Lorsd'unepremièreouverturepourlacréationd'uncompte:

Nomd'utilisateur:admin

Logonto:XDMS_T(nomdefamilleduprofesseur)

Cliquezsur

Interfacedulogiciel:

6 7

Interfacedesactionsglobales:

Interfacedesmodules:

ButtonFunction

fenêtreprincipale.

Sortie

Déconnexiondel'utilisateur

AfficheécranOverview

OuvreNavigator

Enregistrel'expérience encours

Exportel'expérience encours

Fermel'expérience encours

Imprimeobjet sélectionné

Tools:Gérer lesutilisateurs,état delabase dedonnée,instrument, rapport deconfiguration etformats dedétection

Aide:contient le Manueldel'utilisateur

Ensuite,allezdanslasectionTools

8

FenêtreOverview

Pour programmer une nouvelle expérience :

1 . SélectionnezNewExperiment

2. Sélectionnezl'icônepourunenouvelleexpérienceavecleLightCycler480etcliquez

3. DanslasectionSetupdel'ongletPrograms,spécifiezlesparamètrespourchacunedes

catégoriessuivantes: o

DetectionFormat

o o

PlateID,(optionnel)

o

ReactionVolume

4 . Choisissezunformatdedétection(ex:SYBRGreenI)etmodifiezlesparamètrespour

5. Sélectionnezunvolumeréactionnelfinalenʅl.L'échelledevolumerecommandéepour

9

6. DanslasectionProgramsandTemperatureTargets,cliquezpourajouterdesétapes

premier cycle,

7. Alternativement,ilestpossibled'appliqueruntemplateexpérimentalpréalablement

enregistré: lesparamètresdésirés.

8. DanslabarreModule,cliquezSampleEditorpourdéfinirlesinformationsdechaque

danslasectionAide

9. DanslabarreModule,cliquezSubsetEditorpourdéfinirlessousͲgroupesfacilitantla

tâche celle Aide 10 . PréparezlaplaqueetchargezͲladansl'instrumentàl'aideduboutonsituésurledevant de 11

. CliquezsurStartRun.LeboutonStartRunestseulementdisponiblesilaplaqueaétéchargéedansl'instrument.

cliquezsur+10cycles. 10 d)Analyse:Quantificationabsolue

1. Lorsquel'expérienceestterminée,sélectionnezlemodule

2. Lafenêtre"Createnewanalysis"apparaît.

3. Sélectionnez:

i. AnalysisType 11 ii . Subset ii i. Program iv.Renommezcetteanalyse. 12

4. Unefenêtred'analyses'ouvrira:

5.

6. SivousavezentrédespointspourunecourbestandarddanslasectionSample

13

7. Enutilisantlesboutonsdumenuenbasàdroite,ilestpossiblede:

i. decouleurs. ii . Appliquerunfichierdecompensationdecouleurlorsd'étudeen multiplex(infosavancées).

Lacompensationdecouleurestdependante

couleurbaisse. ii i. AppliquerunecourbeStandardenprovenancedelaRUNactuelleou archivée. 14

1. Pourgénéreretvérifierlescourbesdemelting,créezunenouvellefenêtre

2. 15

1. Pournaviguerd'uneanalyseàl'autre,utiliserlemenudéroulant.

Boutons

- pouraccéderàl'Overviewdesfenêtresd'analysepourcetteexpérience.

Ͳpourenleverunefenêtred'analyse.

Ͳpourrenommerunefenêtred'analyse.

*Si 16

1. Pourgénérerunrapportd'expérience,lesdonnéesdel'expériencedoivent

être

2. Aprèsavoirenregistrél'expérience,lebouton danslemenuModules

estactivé.

3. Ilestdoncpossibledesélectionnerlesdifférentesinformationsàinclure

dans

4. Unefoislessélectionsfaites,cliquezsurpourcréerlerapport.

17 f)

Exportation/Importationdefichiers

480

SélectionnezͲledansleNavigatorou

OuvrezͲledanslafenêtreprincipale

o Parcourirpourtrouverledossierdedestinationduficheràexporter. o DanslemenudéroulantSaveastype,sélectionnezleformatdésiré(*.ixo,*.txt, or*.xml):

EntrezunnomdefichieretcliquezSave.

18

Importationdefichiers

vousdésirezimporter. o PourleLightCycler480,leformatseratoujoursle.ixo importédanslafenêtreprincipale. o Poursélectionnerplusieursfichiersàlafois,maintenezlatoucheCTRL enfoncéeencliquantsurchaquefichier. significatifencliquantsur 19

MonitoringPCRwiththeSYBRGreenIDye

DNA The

LightCycler

®480System: ThefollowingarethebasicstepsofDNAdetectionbySYBRGreenIduringrealͲtimePCRonthe

LightCycler®480System:

A 21
34
20

1. Programming

LogintoLightCycler

480Software

CreateaNewExperiment

RunProtocolforprogrammingtheexperiment

Data foronlinedatadisplay

RunNotesoptional

ProgramͲSetup

DetectionFormat:SYBRGreenI

Customize: IntegrationMode:Dynamic

ReactionVolume:20µl

ProgramͲProgramsandTemperatureTargets

ProgramNameCyclesAnalysisMode

PreͲincubation1None

Amplification40Quantification

MeltingCurve1MeltingCurves

Cooling

1None

PreͲincubation

Target(°C)Acquisition

ModeHold

°C)

95

None00:05:004.4

Amplification

Target(°C)Acquisition

ModeHold

°C)

95

None00:00:104.4

55

None00:00:152.2

72

Single00:00:08(ex)

Base#/254.4

MeltingCurve

95

None0000:05

65

None00:01:00

95

Continuous10

Cooling

Target(°C)Acquisition

ModeHold

°C)

40

None00:01:001.5

21
22

2. SubsetEditor

MWPworksheetbelowisanexample.

L ghtCycler 480 Control Kit: Absolute Quantification with Hydrolysis Probes al Control Red 610 (558-610)

123456789101112

AA BB CC DD EE FF GG HH

123456789101112

S6 1 e 6

A 1 e 3S5 1 e 5

B 2 e 3S4 1 e 4

S2 1 e 3

S1 1 e 2

NTC i

Filter Combination: Target FAM (483-533), Intern

LightCycler480SYBRGreenMasterkit

3. SampleEditor

information.

Concentrationforstandardsamples

Subset: Userdefinedname

AnalysisModule:General

Detectionformats:SYBRGreenI

SYBR Green I

23

Subset: Userdefinedname

AnalysisModule:AbsoluteQuantification

Detectionformats:SYBRGreenI

SampleTypeasStandardandedittherespective

Concentration.

Apply: Usethisbuttonandgoonwithdefiningthenextstandard dilution.

SYBR Green I

24

4. Pipetting

Component 1 Reaction l for _10_ Reactions

Water, PCR grade (vial 2, colorless cap) 9,8 l 98 l

PCR primer mix (100 nM) 0,2 l 2 l

Master Mix, 2 x conc. (vial 1, green cap) 10 l 100 l

TOTAL VOLUME OF MIX 18 l 18 l

Template Volume 2 l 2 l

TOTAL REACTION VOLUME 20 l 20 l

CentrifugetheMWPat1500gfor2minutes.

5. StartRun

6 . Analysis

AbsoluteQuantification

o AnalysisType:AbsoluteQuantification o Subset:SubsetfromPart3. o Program:PCR 25
26
prémunirdecedroit; o

Pourinfosurlaformation:

Courriel:p.lampron@umontreal.ca

pouvoir s'enservir; o

Marcheàsuivrepourlaréservation:

Allezsurlesitewebsuivant:

Login:realtime

Password:pcr2008

2 e

Login:nomdevotrelabo(ex:desgroseillers)

2 e

Password:voirPhilipeLampron

Sélectionneruneplagehoraire

dans l'ongletParticipantsetenregistrez.

Laréservations'effectueselonlepremier

arrivé/premierservi manipulationdelaplaqued'échantillons;

Conseild'utilisationdesplaques96puits:

o

Sivousn'utilisezpastoutelaplaquepourune

scellant. Dans cecas,faitesattentionauxcontaminants** o n'estpasencoursd'utilisation; données, o dernières; cléUSBpoureffectuercettesauvegarde; o

MERCIDERESPECTERSESCONSIGNES!

27

6.Matérielssupplémentaires:

A)WorkSheetspourSYBRGreenetSondes

d'hydrolyse B)

Plandeplaque96puits

PAGESSUIVANTES

28

LightCycler

480 Worksheet - 96 well block

- SYBR Green I Master -

File Name:

______________________________ Date: __________________

User: ___________________________________

Detection Format Profile: __________________ Volume: _______________

Program

Program Names Cycles Analysis Mode

Pre-incubation

1 None

Amplification

Quantification

Melting Curve 1 Melting Curves

Cooling

1 None

Temperature Targets

Target (C)

Acquisition

Mode Hold (hh:mm:ss)

Ramp Rate

(C/s)

Acquisitions

(per C)

Pre-incubation

95

None 00:05:00 * 4.4 -

Amplification

None 4.4 -

None 2.2 -

Single 4.4 -

Melting Curve

None -

None -

Continuous - 5-10

Cooling

40

None 00:00:10 1.5

* If high polymerase activity is required, the pre-incubation program can be extended to 10 minutes.

Component 1 Reaction l for ____ Reactions

Water, PCR grade (vial 2, colorless cap) l

PCR primer mix l

Master Mix, 2 x conc. (vial 1, green cap) l

TOTAL VOLUME OF MIX l

Template Volume l

TOTAL REACTION VOLUME l

29

LightCycler

480 Worksheet - 96 well block

- Probes Master with Hydrolysis Probes-

File Name:

______________________________ Date: __________________

User: ___________________________________

Detection Format Profile: __________________ Volume: _______________ Excitation Channels used: 450 483 523 558 615 Emission Channels used: 500 533 568 610 640 670

Program

Program Names Cycles Analysis Mode

Pre-incubation

1 None

Amplification

Quantification

Cooling

1 None

Temperature Targets

Target (C)

Acquisition

Mode Hold (hh:mm:ss)

Ramp Rate

(C/s)

Acquisitions

(per C)

Pre-incubation

95

None 00:05:00 * 4.4 -

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