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Qu'est-ce que la PCR en temps réel ?
Qu’est-ce que la PCR en temps réel (qPCR) ? La réaction en chaîne par polymérase en temps réel (qPCR) est le processus permettant de suivre les progrès de la PCR tout au long de la réaction (c’est-à-dire en temps réel). Les données sont donc collectées tout au long du processus de la PCR, plutôt qu’à la fin de la PCR.
Comment évaluer l’efficacité d’une réaction de PCR en temps réel ?
Tableau 1. Évaluation de l’efficacité de la PCR en temps réel. L’efficacité, la valeur R 2, la précision et la sensibilité sont utilisées pour déterminer l’efficacité d’une réaction de PCR en comparant les différentes conditions de réaction. Pour une évaluation rigoureuse, tous les facteurs énumérés au tableau 1 doivent être évalués ensemble.
Quelle est l’efficacité de la PCR ?
L’efficacité de la PCR dépend du dosage, de l’efficacité du Master Mix et de la qualité de l’échantillon. En général, une efficacité entre 90 et 110 % est considérée comme étant acceptable.
Pourquoi les données sont-elles collectées tout au long du processus de la PCR ?
Les données sont donc collectées tout au long du processus de la PCR, plutôt qu’à la fin de la PCR. Cela révolutionne complètement la façon d’aborder l’évaluation quantitative par PCR de l’ADN et de l’ARN.
ParPhilipe Lampron,M.Sc.
Résumé
Fondements
duPCRentemps réel qPCRFondements
du PCR en temps réel qPCRThéorie duPCRentempsréel
Typesdechimies
Méthode dequantification
d élAcquisition
d er su l tats optimauxDesignexpérimental
Optimisation
etvalidationOptimisation
et validationQu'est que lePCRentempsréel?
Détection
de l amplification d un produit basée sur laDétection
de lamplification dun produit basée sur la fluorescence durant une réaction de PCR Mesure la quantité initial d'un acide nucléique en déterminant le nombre de cycle requis pour atteindre un niveau déterminé de produit Le PCR traditionnel (end point) est utilisé pour amplifierl ADN et l analyse au point terminal de la réaction sera lADN et lanalyse au point terminal de la réaction sera utilisée pour distinguer des produits.PCR:Theorie vs.Realité
L'augmentation exponentielle du
produit est limitée;L'atteinte d'unplateauest incontournableAugmentation
théorique eLePCRtraditionnel (endpoint)
n'est pasapproprié pourla tifi tiRealité
gADNCible quan tifi ca ti onLePCRentempsréel permet laquantification
durant laphase Log quantification durant la phase exponentielle del'amplification #Cycle Analyse desdonnées:Ajuster leseuil deréférenceLe seuil de référence (threshold line) est une valeur de fluorescence à laquelle lescourbes sont comparées
Règlé empiriquement ou par un calcul statistique au dessus du background (méthode de la dérivée seconde)Analyse desdonnées:Déterminer leCp
(crossingpoint) •Le Cp = nombre de cycles requis pour qu'une réaction defluorescence atteigne le seuil de référence T fluorescence atteigne le seuil de référence T •Corrèle fortement avec le nombre de copie de départ 10 8 10 6 10 2 10 4 TAnalyse desdonnées:Déterminer leCp
(crossingpoint) LeCpest linéaire aveclelogdunombre decopie initiale Lapente delacourbe standardpeut être directement corrélée àl'efficacité delaréaction :Efficiency()=[10
(Ͳ1/slope) ]-1 L l t332Effi i100%
L orsque l apen t e=Ͳ 3 32Effi c i ency= 100%
Typesdequantification
Absolue
Détermine
une quantité initiale d un acideDétermine
une quantité initiale dun acide nucléique cibleRequiert une courbe standard
14500 copies
Relative
Détermine
la différence (en nombre de 2.5 14500copies
Détermine
la différence (en nombre de fois)d'une quantité initiale d'acides nucléiques entrelesdifférents échantillonsPerformée avecou sanscourbe standard
11.52Utilisée pourl'analyse del'expression de
gènes avecungène cible normalisé parun gène deréférence 00.5Normal Treatment A Treatment B
Quantificationabsolue
10 8 10 6 10 2 10 4 TTQuantificationabsolue
Quantificationabsolue
10 8 10 6 10 2 10 4 TQuantificationabsolue
10 5 copies/puitQuantificationrelative
Avec courbe standard Avec courbe standard Quantités utilisées pourmesurer ladifférence (ennombre defois)d'unacide nucléique cible etd'unacide nucléiqueréférence Ratiodugène cible sur gène deréférence utilisé pournormalisernormaliserAveclaméthode comparativedeLivak (2
ͲCtou Cp
Ct ou Cp est utilisé pour mesurer la différence en quantité Ct ou Cp est utilisé pour mesurer la différence en quantité d'unacide nucléique cible entrelesdifférents échantillonsQuantificationrelative
Quantificationrelative
Ctl Cp = 21.3 = 1.5ng / tube 1
A Cp = 22.8 = 0.5ng / tube 0.33
B Cp = 19.3 = 6.0ng / tube 4
TQuantificationrelative:Résultats
7Expression
56Expression
normalisée234012
Considérations enquantificationrelative
L expression des gènes de référence doitêtre
Lexpression
des gènes de référence doitêtre
constante entrelesdifférents échantillons Efficacité deréaction delacible etdelaréférencedoiventêtre
calculée doiventêtre
calculéeMéthode quirequiert une validation
Leschimies enPCRentempsréelé
lfl Bas es sur l a fl uorescence Aprèsl'absorbance decertaines longueurs d'ondes delalumière( excitation ),le fluorophoreémet
dela lumière une longueur excitation le fluorophoreémet
de la lumière une longueur d'onde plusgrande (émission) Lafluorescenceest proportionnelle auproduit amplifié2chimies couramment utilisées:
SYBR GI SYBR G reen ISondes TaqMan
Chimie SYBRGreenI
Avantages
L'expérience nerequiert que desamorces
Analyse decourbe demeltingpostͲamplification
Dé t
Dé savan t ages Potentiel decontributionàlafluorescenceprovenant deproduits non spécifiques primer r dimers produits non spécifiques primer r dimersPasdemultiplexpossible
SYBRGreenI
LafluorescenceenSYBRGreenI(SGI)
l l' dbl b augmente l orsque l' AND d ou bl e b rin est produitLorsque l'ADNdb s'accumule aucoursdela
réaction plusdeSGIselieà O O O O de laquotesdbs_dbs28.pdfusesText_34[PDF] pcr en temps réel pdf
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