[PDF] Analyse des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en oeuvre

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Université Joseph Fourier / Université Pierre Mendès France / Université Stendhal / Université de Savoie / Grenoble INP

THÈSE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L"UNIVERSITÉ DE GRENOBLE

Spécialité : Physiologie Physiopathologies Pharmacologie

Arrêté ministériel : 7 août 2006

Présentée par

Zeinab GHANDOUR

Thèse dirigée par le Pr. Gilles FAURY

préparée au sein des Laboratoires -Physiopathologies Vasculaires : Interactions cellulaires, signalisation et vieillissement (INSERM-U882) - Hypoxie : Physiopathologie Cardiovasculaire et Respiratoire - HP2 (INSERM U1042) dans l"École Doctorale Chimie et Sciences du vivant

Analyse des mécanismes cellulaires

et moléculaires mis en oeuvre dans les vaisseaux sanguins par les composants des fibres élastiques.

Thèse soutenue publiquement le 20 mars 2013,

devant le jury composé de :

Pr. Christophe RIBUOT

Université Joseph Fourier - Grenoble 1, Président

Pr.Laurent DEBELLE

Université de Reims Champagne Ardennes, Rapporteur

Dr. Marie-Paule JACOB

INSERM U 698, Hôpital Bichat-Claude Bernard, Rapporteur

Pr. Gilles FAURY,

Université Joseph Fourrier - Grenoble 1, Membre

Remerciements

Je tiens à remercier en premier lieu les membres du Jury de ma thèse : Laurent DEBELLE, Marie-Paule JACOB, Christophe RIBUOT et Gilles FAURY. Je remercie Gilles FAURY d"avoir accepté de m"encadrer, pour la qualité de ses conseils scientifiques et moraux, pour le soutien et pour l"aide qu"il m"a offert aux différents moments de ma thèse, même les plus difficiles. Merci à Philippe HUBER de m"avoir accueilli dans son laboratoire LAPV, d"avoir mis à ma disposition les moyens pour accomplir mon travail de thèse, pour ses conseils scientifiques et l"aide qu"il m"a apportée même après avoir changé de laboratoire. Merci également à Patrick LEVY, Christophe RIBUOT, et Diane GODIN-RIBUOT pour l"accueil et l"aide qu"ils nous ont offerts après avoir déménagé dans leur laboratoire HP2. Un Grand Merci à tous les membres des 2 laboratoires LAPV et HP2, pour leur sympathie, leur soutien moral, leurs conseils, et leur aide précieuse de tous les jours, ainsi que pour les bons moments passés ensemble et qui m"ont permis de pouvoir accomplir pleinement mon travail de thèse. En particulier, je remercie Adeline, Mariella, Adama, Isabelle, Stéphanie, Abbass, Sandrine, Marie, Emeline et Anne pour leur soutien scientifique et leur aide technique. Je tiens à remercier aussi Christine, François et Audrey pour leur patience dans les démarches administratives et pour leur aide. Merci aussi aux différents animaliers pour leur disponibilité. Particulièrement, j"adresse mes remerciements aux membres de notre petite équipe. Merci à Boubacar et Marion pour m"avoir transmis, même à distance, leur savoir- faire. Merci à Wassim pour les conseils scientifiques, le soutien et les bons moments partagés. Merci à Justine et Marjorie ainsi qu"à Eric de m"avoir guidée à certains moments de ma thèse. Ce travail n"aurait pu aboutir sans l"aide de différentes équipes de recherche au CEA et au bâtiment Jean Roget, je tiens à remercier tous ceux qui y ont contribué. Je remercie l"Université LIBANAISE, pour la bonne formation qu"elle m"avait offerte pendant mes premières années universitaires, ainsi que pour mon financement de thèse. Ces remerciements ne seraient pas complets sans une pensée pour mes amies, Hawraa, Wafaa, Hanane, Fatima, Manar, Zeinab, Roukaya, Abir, Doha, ainsi que les différents membres de notre " équipe » libanaise à Grenoble, mes vifs remerciements pour vous toutes, je vous suis profondément reconnaissante pour avoir su m"écouter et me redonner de l"énergie dans les moments les plus critiques de mon séjour à Grenoble. Je ne peux oublier de remercier ma soeur SOUKAYNA, avec qui j"avais passé les meilleurs moments depuis que j"avais l"âge de un an jusqu"à maintenant, et qui n"a

cessé d"être à mes côtés, même quand elle était très occupée. Merci pour ton

soutien, tes conseils et tes cadeaux, et pour le bon séjour passé ensemble à Grenoble. J"ai du mal à arriver à ce moment où on doit se séparer physiquement. Pour mes frères Mouhamad Housein et Abbass, pour mes soeurs Hiba, Amina, Soumaya et Batoul, vous avez été toujours là, vous m"avez offert le soutien le plus remarquable, j"espère pouvoir vous le rendre un jour. Je pense à mes nièces et neveux, en particulier Fatima,Mariam, Nour et Zeinab : soyez protégées et guidées vers la droite ligne et ayez le meilleur destin dans la vie. Je ne peux terminer sans remercier mes deux parents, pour qui les mots ne sauraient pas exprimer et expliquer le grand merci que je vous dois, et à qui je dédie ce travail. À ceux qui m"ont incitée à suivre les chemins de la connaissance

À Papa, À Maman,

À la mémoire de notre père miséricordieux... 1

Table des matières

1. Introduction Bibliographique ............................................................................................................................................ 8

1.1. Le système vasculaire- Les artères ........................................................................................................................ 9

1.1.1. Système cardio-vasculaire et évolution des espèces ............................................................................ 9

1.1.2. Le coeur .................................................................................................................................................................... 9

1.1.3. Les vaisseaux sanguins : structure générale ......................................................................................... 10

1.1.3.1. Intima ........................................................................................................................................................... 10

1.1.3.2. Média ............................................................................................................................................................ 11

1.1.3.3. Adventice .................................................................................................................................................... 11

1.1.4. Les différents vaisseaux sanguins des mammifères .......................................................................... 12

1.1.5. Les artères : ......................................................................................................................................................... 14

1.1.5.1. Structure des artères : .......................................................................................................................... 15

1.1.5.2. Fonction principale des artères- Rôle mécanique ..................................................................... 15

1.1.5.3. Relation structure fonction des composants artériels ............................................................ 15

1.2. Les composants vasculaires................................................................................................................................... 17

1.2.1. Les cellules vasculaires .................................................................................................................................. 17

1.2.1.1. Cellules endothéliales ........................................................................................................................... 17

1.2.1.1.1. Histologie................................................................................................................................................ 17

1.2.1.1.2. Rôles ......................................................................................................................................................... 17

(a) Régir les échanges sang-tissu : perméabilité vasculaire......................................................... 18

(b) Rôle dans l'angiogenèse ....................................................................................................................... 19

(c) Rôle dans l'hémostase ........................................................................................................................... 19

(d) La synthèse de molécules vasoactives ........................................................................................... 20

i. Le NO ............................................................................................................................................................ 20

ii. La prostacycline: ..................................................................................................................................... 21

iii. L'EDHF ......................................................................................................................................................... 21

iv. Les endothélines ..................................................................................................................................... 21

1.2.1.2. Cellules musculaires lisses vasculaires .......................................................................................... 22

1.2.1.2.1. Histologie................................................................................................................................................ 22

1.2.1.2.2. Rôles des CMLV .................................................................................................................................... 23

(a) Phénotype contractile : ......................................................................................................................... 23

(b) Phénotypes prolifératif et secrétoire .............................................................................................. 24

1.2.1.3. Les fibroblastes ........................................................................................................................................ 25

1.2.2. La matrice extracellulaire ............................................................................................................................. 26

1.2.2.1. Les fibres élastiques .............................................................................................................................. 26

1.2.2.1.1. L'élastine ................................................................................................................................................. 27

2

(a) Gène et structure de la tropoélastine ............................................................................................. 28

(b) Synthèse et sécrétion de la tropoélastine ..................................................................................... 29

1.2.2.1.2. Les microfibrilles ................................................................................................................................ 31

(a) Les fibrillines : .......................................................................................................................................... 31

(b) Les autres composants des microfibrilles .................................................................................... 32

1.2.2.1.3. Formation des fibres élastiques .................................................................................................... 34

1.2.2.2. Les autres composants de la matrice extracellulaire ............................................................... 36

1.2.2.2.1. Le collagène ........................................................................................................................................... 36

1.2.2.2.2. Les glycoprotéines .............................................................................................................................. 37

1.2.2.2.3. Les protéoglycanes ............................................................................................................................. 38

1.2.2.3. Dégradation de la matrice extracellulaire .................................................................................... 39

1.2.2.3.1. Les sérine-protéases .......................................................................................................................... 40

1.2.2.3.2. Les cystéine-protéases ...................................................................................................................... 40

1.2.2.3.3. Les métallo-protéinases : ................................................................................................................. 40

1.2.2.3.4. Les inhibiteurs tissulaires des MMPs : les TIMPs .................................................................. 42

1.3. Régulation de la fonction vasculaire : les interactions cellules-matrice dans les vaisseaux

sanguins ........................................................................................................................................................................................ 44

1.3.1. Rôle de cette interaction ................................................................................................................................ 44

1.3.1.1. Influence de la cellule sur la matrice .............................................................................................. 44

1.3.1.2. Influence de la matrice sur la cellule .............................................................................................. 44

1.3.1.2.1. Rôle dans le maintien d'un état différencié des cellules ..................................................... 45

1.3.1.2.2. Rôle dans le contrôle de la prolifération cellulaire ............................................................... 45

1.3.1.2.3. Rôle dans la migration cellulaire .................................................................................................. 45

1.3.1.2.4. Rôle de filtre .......................................................................................................................................... 46

1.3.2. Formation de l'interaction : liaison ligand-récepteur ....................................................................... 47

1.3.2.1. La famille des Intégrines ...................................................................................................................... 47

1.3.2.2. Les interactions fibres élastiques-cellules : rôle biologiques des fibres élastiques .... 50

1.3.2.2.1. Rôle biologique des microfibrilles ............................................................................................... 50

(a) Les récepteurs des microfibrilles ..................................................................................................... 50

(b) Biologie de cette interaction .............................................................................................................. 50

1.3.2.2.2. Rôle biologique de l'élastine ........................................................................................................... 51

(a) Récepteurs de l'élastine ....................................................................................................................... 51

i. Le complexe récepteur de l'élastine ................................................................................................ 51

ii. L'intégrine α

vβ3 ........................................................................................................................................ 52

iii. La galectine-3 ........................................................................................................................................... 53

(b) Biologie de l'interaction élastine-cellules ..................................................................................... 53

3

1.3.3. Transduction du signal dans les vaisseaux sanguins ......................................................................... 56

1.3.3.1. Signalisation médiée par les intégrines ......................................................................................... 56

1.3.3.2. La voie de signalisation calcique ...................................................................................................... 57

1.3.3.2.1. Les canaux calciques membranaires .......................................................................................... 58

1.3.3.2.2. Les canaux calciques du réticulum endoplasmique ............................................................. 59

1.3.3.2.3. Les canaux calciques mitochondriaux ........................................................................................ 60

1.3.3.3. Les acteurs cytoplasmiques - rôle du phosphatidyl-inositol biphosphate ..................... 61

1.3.3.4. Les effecteurs du complexe focal adhesion kinase (FAK) ...................................................... 62

1.3.3.5. La voie des Mitogen activated protein kinase (MAPK) ........................................................... 62

1.3.3.6. Les Rho GTPases ..................................................................................................................................... 64

1.4. Remodelage vasculaire ............................................................................................................................................ 65

1.4.1. Vieillissement naturel : artériosclérose .................................................................................................. 65

1.4.1.1. Modifications physiologiques : artériosclérose, hypertension systolique élevée et

ischémie .......................................................................................................................................66

1.4.1.2. Modifications de la matrice extracellulaire au cours du vieillissement ........................... 67

1.4.1.2.1. Accumulation de molécules de la MEC ....................................................................................... 67

1.4.1.2.2. La glycation non enzymatique ....................................................................................................... 68

1.4.1.2.3. La calcification ...................................................................................................................................... 68

1.4.1.3. Dysfonction cellulaire lors du vieillissement .............................................................................. 70

1.4.2. Vieillissement pathologique des artères ................................................................................................. 70

1.4.2.1. Hypertension artérielle et ses conséquences .............................................................................. 70

1.4.2.1.1. Remodelage hypertrophique ......................................................................................................... 70

1.4.2.1.2. Remodelage eutrophique ................................................................................................................ 71

1.4.2.2. Athérosclérose ......................................................................................................................................... 71

1.4.2.3. Anévrisme artériel .................................................................................................................................. 72

1.4.3. Altération génétique des composants des fibres élastiques et pathologies vasculaires .... 72

1.4.3.1. Les fibrillinopathies : Le syndrome de Marfan ........................................................................... 73

1.4.3.2. Altérations de l'élastine : ..................................................................................................................... 74

1.4.3.2.1. La sténose supravalvulaire aortique ........................................................................................... 74

1.5. Présentation des objectifs de la thèse ............................................................................................................... 76

2. Expériences et résultats .................................................................................................................................................... 79

2.1. Etudes organotypiques : Mesure des tensions des anneaux de vaisseaux de rats sous l'effet des

composants des fibres élastiques : .................................................................................................................................... 80

2.2. Articles 1 et 2 : Effet des composants des fibres élastiques sur les fonctionnalités des cellules

endothéliales (HUVEC) ........................................................................................................................................................... 85

2.2.1. Introduction des articles 1 et 2 ................................................................................................................... 85

2.2.2. Article 1 ................................................................................................................................................................ 87

4

2.2.3. Article 2 .............................................................................................................................................................. 117

2.2.4. Discussion des articles 1 et 2 :................................................................................................................... 158

2.3. Article 3 : Mise au point d'un protocole de culture de cellules musculaires lisses (CMLV) à

partir d'aortes de souris ...................................................................................................................................................... 160

2.3.1. Introduction de l'article 3 : ......................................................................................................................... 160

2.3.2. Article 3 .............................................................................................................................................................. 162

2.3.3. Discussion de l'article 3 : ............................................................................................................................. 188

2.4. Etudes sur cultures de CMLV : effet des composants des fibres élastiques sur la signalisation

calcique des CMLV, effet du vieillissement et de la déficience en élastine et en fibrilline-1 ................... 190

3. Discussion ............................................................................................................................................................................. 203

3.1. Fonctions cellulaires modifiées par les composants des fibres élastiques : .................................... 205

3.2. Signalisations cellulaires déclenchées par les composants des fibres élastiques : ....................... 207

3.3. Récepteurs mis en jeu dans les interactions fibres élastiques- cellules vasculaires : ................. 208

3.4. Mise au point d'un nouveau protocole de culture de CMLV de souris : ............................................. 209

3.5. Impact de la déficience en élastine et en fibrilline-1 sur la réactivité des cellules musculaires

lisses vasculaires en culture aux composants des fibres élastiques : ............................................................... 210

3.6. Effet du vieillissement sur la réactivité des cellules musculaires lisses vasculaires : ................. 210

3.7. Différences d'interactions entre les différentes molécules étudiées :................................................ 211

3.8. Hypothèse d'explication de la différence des altérations présentes dans les syndrome de

Williams-Beuren et de Marfan : ........................................................................................................................................ 212

4. Conclusions et perspectives .......................................................................................................................................... 215

4.1. Fibres élastiques et physiologie des vaisseaux sanguins ........................................................................ 216

4.2. Fibres élastiques et cellules endothéliales .................................................................................................... 217

4.3. Fibres élastiques et cellules musculaires lisses vasculaires ................................................................... 218

4.4. Fibres élastiques et vieillissement normal et pathologique (cas du WBS et du MS) ................... 218

5. Références Bibliographiques: ....................................................................................................................................... 221

6. Annexe .................................................................................................................................................................................... 244

Résumé ........................................................................................................................................................................................... 261

Abstract .......................................................................................................................................................................................... 261

5

Liste des Figures

Figure 1: Structure générale d'un vaisseau sanguin ................................................................................................................ 10

Figure 2 : Schéma des différents types de vaisseaux sanguins................................................................................... 12

Figure 3: Variations de pression sanguine dans les vaisseaux sanguins. ............................................................. 14

Figure 4 : Fonctions endothéliales diverses régies par les molécules secrétées par les cellules

endothéliales. ................................................................................................................................................................................. 20

Figure 5 : Rôle de l'endothéline dans la vasoréactivité vasculaire et la signalisation au niveau des CE et

des CMLV vasculaires. ................................................................................................................................................................. 22

Figure 6 : Mécanismes moléculaires envisagés lors de la contraction et du relâchement des cellules

musculaires lisses .......................................................................................................................................................................... 24

Figure 7 : Mécanisme de chevauchement entre les deux phenotypes contractiles et prolifératif des

CMLV. .................................................................................................................................................................................................. 25

Figure 8 : Formation des fibres élastiques .......................................................................................................................... 27

Figure 9 : Elasticité des fibres élastiques ............................................................................................................................ 28

Figure 10 : Les différents domaines de la molécule de la tropoélastine. ............................................................... 29

Figure 11 : Différentes étapes de synthèse et de maturation de la tropoélastine. ............................................. 30

Figure 12: Les différents domaines de la molécule de Fibrilline-1. .......................................................................... 32

Figure 13: Structure des microfibrilles sous microscopie électronique ................................................................ 33

Figure 14: Distensibilité des microfibrilles.. ...................................................................................................................... 34

Figure 15: Différentes étapes de maturation des fibres élastiques . ........................................................................ 36

Figure 16: Mécanismes cellulaires mis en jeu lors du phénomène de la migration cellulaire. ..................... 46

Figure 17: Domaines de liaison moléculaires de la molécule d'intégrine. ............................................................. 48

Figure 18: Différentes conformations d'une intégrine et leurs rôles dans la signalisation cellulaire ....... 49

Figure 19: Structure de l'ERC et voies de signalisation déclenchées par son activation ................................. 52

Figure 20: Proposition de mécanisme expliquant la synergie observée entre les récepteurs de l'élastine :

ERC et intégrine αvβ3 au cours de la maturation des fibres élastiques ................................................................. 53

Figure 21 : Schéma simplifié de la signalisation cellulaire via les intégrines ou via des récepteurs de

croissance impliquant l'angiogenèse .................................................................................................................................... 56

Figure 22: Transduction du signal via les intégrines : activation des voies FAK ou MAPK ou ILK ............. 57

Figure 23: Les différentes voies d'entrée membranaire du calcium.. ...................................................................... 59

Figure 24: Les différents types de canaux calciques cellulaires ................................................................................ 61

Figure 25: Les voies de signalisation du phosphatidyl-inositol bi-phosphate (PIP2). .................................... 62

Figure 26: La voie de la MAPK. ................................................................................................................................................ 63

Figure 27: Changement de la pression pulsatile dans l'arbre vasculaire ............................................................... 67

Figure 28: Différentes modifications affectant les artères en cours du vieillissement .................................... 69

Figure 29: Représentation schématique du remodelage hypertrophique et du remodelage eutrophique

observés lors de l'hypertension artérielle .......................................................................................................................... 71

Figure 30: Effet de la rTE , des MF et de PF14 sur la tension des anneaux d'aorte de rat. ............................. 84

Figure 31: Activation de la voie de signalisation calcique des CMLV de souris C57Bl6 âgées de 6-8mois

sous l'effet de rTE, kE, MF et PF14. ...................................................................................................................................... 193

Figure 32: Effet de l'âge sur la réponse calcique des CMLV sous rTE, kE, MF et PF14 . ................................. 197

Figure 33: Réponse calcique obtenue après exposition à la rTE, la kE, les MF et PF14 des CMLV isolées

de souris C57Bl6, Eln+/-, Fbn-1 +/mg∆ âgées de 6 mois. .......................................................................................... 201

6

Liste des Tableaux

Tableau 1 : Récapitulatif des principales fonctions régies par l'endothélium ..................................................... 18

Tableau 2 : Les principales familles de molécules de la MEC autres que l'élastine. .......................................... 39

Tableau 3: Protéinases détectables dans les vaisseaux et les cellules inflammatoires. ................................... 42

Tableau 4: Les effets biologiques de l'élastine sur quelques types cellulaires . .................................................. 55

Tableau 5: Principales différences entre l'athérosclérose et l'artériosclérose . .................................................. 72

7

Abréviations

Ach: Acétylcholine

AP-1 : " Activator Protein-1 »

BMP : " Bone Morphogenetic Factor »

CE : Cellules Endothéliales

DAG: Diacylglycérol

EBP: " Elastin Binding Protein »

ECE : Enzyme de Conversion des Endothélines

ERC : " Elastin Receptor Complex »

ELR : " Elastin- Laminin Receptor »

ERK : " Extracellular signal-Regulated Kinase »

ET- (1, 2, 3) : Endothéline- (1, 2, 3)

ET- (A, B) : Récepteur à l'endothéline (A, B)

FAK: " Focal Adhesion Kinase»

FGF: " Fibroblast Growth Factor »

FN: Fibronectine

FT : Facteur tissulaire

GAG: Glycosaminoglycanes

HUVECs: " Human Umbilical Vein Endothelial Cells »

ILK: " Integrin-Linked Kinase »

IP3: Inositol tri-Phosphate

kE : kappa-élastine

LOX: " Lysyl Oxidase »

LOXL: " Lysyl Oxidase Like »

LTBP : " Latent TGF-β Binding Protein »

MAGP : " Microfibrillar Associated GlycoProtein »

MEC : Matrice Extracellulaire

MF : Microfibrilles Aortiques Bovines

MMP: " Matrix Metalloproteinase » MS: " Marfan Syndrome » Neu-1 : Neuraminidase-1 NO : Monoxyde d'azote NOS : " NO Synthase » PAI : " Plasminogen Activator Inhibitor » PDGFR: "Platlet derived growth factor receptor" PE: Phénylephrine PG: Protéoglycanes PGI2 : Prostacylcine PI3K : Phosphatidylinositol-3 Kinase PIP2: Phosphatidyl-Inositol bi-Phosphate PKA : Protéine Kinase A PMCA: " Plasma Membrane calcium ATPase » PPCA : " Protective Protein/Cathepsin A » rTE : Tropoélastine Recombinate RyR: " Ryanodine Receptor » SERCA: Sarco/Endoplasmic Reticulum Calcium-ATPase

SLRPs: Small Leucine-Rich Repeat Proteoglycans

SVAS: Sténose Aortique Supravalvulaire

TE: Tropoélastine

TIMP: " Tissue Inhibitor of MetalloProteinase » t-PA : " Tissue Plasminogen Activator »

TSP: Thrombospondine

VEGF : " Vascular Endothelial Growth Factor »

VEGF-R: Récepteur au VEGF

VSMCs, CMLV : Cellules musculaires lisses Vasculaires vWF : Facteur Von- Willebrand

WBS : " Williams Beuren Syndrome »

8

1)Introduction

Bibliographique

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