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Microbiologie de l'eau

Préparé par Dr. A.HaTji

2019/2020

Plan:

I)InWroTucWion

II)méWUoTeV généraleV Te prélèvemenWH WranVporW eW conVervaWion

III)TranVporW eW conVervaWion au laboraWoire

I) Introduction

L'eau est un ĠlĠment essentiel au fonctionnement de tout écosystème, mais aussi des activités humaines (agriculture, industrie) et de notre vie de tous les jours (uVage TomeVWiqueH loiVirV).

L'origine des eaudž serǀant ă l'alimentation humaine provient des eaux souterraines, les eaux douces de Vurface cGeVW-à-Tire celle TeV ruiVVeauxH TeV ravièreVH TeV fleuveVH TeV barrageVH ou TanV cerWainV caVH par adoucissement des eaux de mer

directe ou indirecte par les excrétas humain ou d'animaudž et surtout de la contamination fĠcale

L'AlgĠrie connait de genre de problğme

particulièrement en saison chaude pour diverses II) méthodes générales de prélèvement, transport et conVervaWion

1.) Matériel de prélèvement:

Le récipient utilisé doit assurer, une fois bouché, une protection totale contre toute contamination.

On peut utiliser des flacons en verre de 250, 500 ou 1 000 mLH Te préférence boroVilicaWéVH à boucUage émeri.

Le bouchon émeri, destiné à la fermeture après le prélèvement est lavé, rincé, séché, puis enveloppé VéparémenW TanV un morceau Te papier filWre

III) Transport et conservation au laboratoire

eaux

Dans les eaux très polluées, il convient donc de pratiquer de nombreuVeV TiluWionV (eaux Te rivièreH eaux uVéeVH eWc.).

Détermination

bactériologique dénombrement

TirecW TeV colonieV

concenWraWion par filWraWion inoculation d'un ǀolume milieu solide

évaluation par calcul

statistique du nombre le plus probable d'unitĠs infectieuses (NPP) rĠpartition de l'inoculum dans un de tubes de milieu de culture liquide

Inoculum dans des

puiWV Te microplaqueV conWenanW un VubVWraW nutritif déshydraté

Concentration in situ par

aTVorpWionJ Vur Te la gaYe hydrophile

1) Méthodes générales de dénombrement après concentration

Concentration au

laboraWoire par filWraWion

Vur membraneV

L'edžpression des rĠsultats se fait sous

colonies (UFC).

2) Méthodes générales de dénombrement direct par

numéraWion TeV colonieV aprèV enVemencemenW Vur (ou TanV) une géloVe nuWriWive

Dans ce type de méthodes, les bactéries maintenues dispersées dans un milieu VoliTe (ou à Va Vurface)H TonnenW naiVVanceH TanV TeV conTiWionV favorableVH à TeV colonies isolées les unes des autres qui, de ce fait, peuvent être directement comptées.

Il est alors nécessaire, en principe, de repiquer sur des milieux confirmatifs toutes leV colonieV VuVpecWeV

Dénombrement par

incorporation en gélose

Dénombrement par étalement

en surface

La méthode fréquemment utilisée

(bacWérieV aérobieV revivifiableV) conViVWe à mélanger TanV une boîWe Te PéWri Te 90 à 100 mm Te

TiamèWreH 1 mLd'Ġchantillon et 15

mLTe milieu géloVéH fonTu eW ramené à une WempéraWure Te 45

°C environ. ManV ceV conTiWionVH le

nombre maximum Te colonieV acceptable pour éviter les phénomènes de confluence et de compéWiWion bacWérienne eVW généralemenW eVWimé à 300

Un faible ǀolume d'Ġchantillon est

réparti avec un éWaleurVWérile (pipeWWe PaVWeur repliée " en raWeauͩ sur la surface d'une gélose en boîte de Pétri. Pour une boîWe Te 90 à 100 mm Te

TiamèWreH ce volume ne peuW

guère excéTer 0H2 mL. pas donner lieu à des chocs

WUermiqueV. Nlle eVW

parWiculièremenW favorable pour leV germeV aérobieV VWricWV

3.3 Méthode générale de dénombrement en milieu liquide par

détermination du nombre le plus probable (NPP)

Cette méthode est une estimation statistique du nombre de micro-organismes supposĠs distribuĠs dans l'eau de maniğre parfaitement aléatoire.

Un jugement quantitatif est possible en jouant sur les volumes de la prise d'essai. exemple

Il y a au moinV 1 micro-organiVme TanV 1 mLTe la

TiluWion 10-3 et moins d'un micro-organiVme TanV

1mL Te la TiluWion 10-4et donc on peut en déduire

qu'il y a au moins 103micro-organiVmeVmaiV moins de 104micro-organiVmeVTanV 1mL Te produit pur

Volume de l'inoculum: 1mLProduit

pur

10-110-210-310-410-5

Résultat+ +++--

Exemple avec TeV eVVaiV mulWipleV (3 WubeV par TiluWion)

Dilution Produit

pur

10-110-210-310-410-5

Résultat+++++++++++-+-----

Chiffre égale à la somme des tubes positifs333210 Interprétation statistique: méthode du NPP (table de Mac GraTy) Se reporWer au Wable Te Óac GraTypour 3 WubeV Te TiluWion afin Te Wrouver le NPP correVponTanW au nombre 321Jle NPP eVW 15. est en fait considérée comme comprise entre 3 et 38 avec une probabilité de 95%HenWre 2 eW

52 avec une probabiliWé Te 99 %.

Nn TéTuire la concenWraWion en micro-organiVmeV par mLTe proTuiW pur N. NPP= nombre le pluV probable obWenu par lecWure Te la Wable Te Óac GraTy

V inoculum= 1 mL

Fd= facWeur Te la TiluWion correVponTanW au cUiffre TeV cenWaineV Tu nombre caracWériVWique 10-2

N= NPP /V inoculum * ŃT

15I0H01 =15 102 micro-organiVmeV par mL

V) Bactéries indicatrices de contamination

Sont distinguĠs deudž types principaudž d'indicateurs.

1) Dénombrement des germes totaux

A) La méthode par épifluoreVcencemicroVcopiqueJ donne directement le nombre total de germes. Elle est relativement rapiTeeW VenVible. Nlle ne permeW paV la TifférenciaWion TeV bacWérieV Velon TeV PrincipeLa méWUoTe comprenT une fixaWion permeWWanW la conVervaWionH une coloration avec un composé fluorescent, une filtration sous vide sur une membrane en polycarbonate non fluorescente et une numération avec un microVcope à épifluoreVcence. B) Méthode par incorporation en milieu gélosé Domaine d'application Cette mĠthode est la plus employĠe pour les analyses à but sanitaire.

Avec le mode opératoire type, elle donne des résultats de précision correcWe pour leV écUanWillonV conWenanW pluV Te 30 germeV par mL.

Cette mĠthode est donc utilisable pour l'application de la rĠglementation concernant les eaudž d'alimentation dĠliǀrĠes sous forme conditionnĠe

Domaine d'application

Cette méthode est la plus employée pour les analyses à but sanitaire. Avec le mode opératoire type, elle donne des résultats de précision correcte pour les échantillons contenant pluV Te 30 germeV par mL. Cette mĠthode est donc utilisable pour l'application de la rĠglementation concernant les eaudž d'alimentation délivrées sous forme conditionnée

2) Dénombrement des coliformes

A) Définition des coliformes:

Le terme de " coliformes » ne correspond pas à une définition microbiologique VWricWe.

Sous ce terme est regroupĠ un certain nombre d'espğces bactĠriennes appartenant en fait à la famille des NnWerobacWeriaceaeeW qui parWagenW cerWaineV caractéristiques biochimiques.

La dĠfinition suiǀante a ĠtĠ adoptĠe par l'Organisation internationale de standardisation (ISO): Le Werme " coliforme » correVponT à TeV organiVmeV en bâWonneWVH non VporogèneVH Gram négaWifVH oxyTaVe négaWifVH faculWaWivemenW anaĠrobies, capables de croŠtre en prĠsence de sels biliaires ou d'autres agents de surface possédant des activités inhibitrices de croissance similaires, et capables de fermenter le lactose (et le mannitol) aǀec production d'acide et d'aldĠhyde en 48 heures, à des températures de 35 à 37 °C

Les coliformes comprennent entre autres les genres : Escherichia, CiWrobacWerH EnterobacterH OlebViellaH YerViniaH SerraWia

Le dénombrement de ces organismes à 35-37 °C eVW VouvenW TéVigné VouV l'edžpression de ͨ dĠnombrement des coliformes totaudž

Le terme de " coliformes fécaux » ou de

" coliformes thermo-WoléranWV » correVponT à TeV coliformes qui présentent les mêmes propriétés (caracWé-riVWiqueVTeV coliformeV) aprèV incubaWion

à la température de 44 °C.

Le groupe des coliformes fécaux comprend entre

autres les espèces suivantes : CiWrobacWerfreunTiiH

CitrobacterTiverVuVH CiWrobacWeramalonaWicuVH

NnWerobacWeraerogeneVH NnWerobacWercloacaeH

Escherichia coli, OlebViellapneumoniaeH OlebViella oxytocaH ÓoellerellawiVconVenViVH SalmonellaH

YerVinia enWerocoliWica.

Aujourd'hui la rĠglementation parle de

recherche de coliformes totaux.

On ne distingue pas les coliformes d'origine

fécale des autres origines (telluriques, cliniqueVH eWc.) eW Te N. coli (coliformeV d'origine fĠcale). B) Intérêt hygiénique de la recherche des coliformes dans une eau: Les coliformes sont intéressants car un très grand nombre d'entre eudž ǀiǀent en abondance dans les matières fécales des animaux à sang chaud et de ce fait, constituent des indicateurs fécaux de la première imporWance.

Par ailleurs, leur résistance aux agents

anWiVepWiqueVH eW noWammenW au cUlore eW à VeV dérivés, est voisine de la résistance des bactéries pathogènes vis-à-viV TeVquelleV ce Wype Te WraiWemenW eVW inVWauré ; ilV conVWiWuenW Tonc TeV indicateurs d'efficacitĠ de traitement Au total, trois types d'edžamens colimétriquespeuvenW êWre TiVWinguéV J ‰-La recherche et le dénombrement des seuls Escherichia coli.

Ces deux derniers examens sont, au contraire, essentiels dans le diagnostic d'une contamination fĠcale.

C) Méthode de dénombrement par filtration sur membrane:

Première étape :

dénombrement direct sur la membrane Elle conduit à un dénombrement préVompWif TeV coliformeV eW TeV coliformeV fécaux.

Filtrer sur deux membranes différentes, dans les conditions précisées anWé-rieurement, deudž prises d'essai de l'eau ă analyser soigneusement homogĠnĠisĠe par agitation.

Les prises d'essai ne deǀant pas ġtre infĠrieures ă 20 mLH Tiluer Vi néceVVaire. Placer chacune des deux membranes sur une boîte de gélose lacWoVéeau TTC eW TergiWol.

Mettre ces boŠtes ă incuber durant 24 heures l'une ă 37 °C, l'autre ă 44 ( 0,5 °C). Trğs important ͗ l'enceinte ă 44 °C ToiW avoir une WempéraWure Uomogène eW Von atmosphğre ġtre chargĠe de ǀapeur d'eau.

La norme demande un complĠment d'incubation de 24 heures audž deudž températures.

La lecture des boîtes permet de reconnaître la présence de coliformes par les caracWériVWiqueV VuivanWeV J -coloration jaune, orange des colonies, résultant de l'absence de rĠduction du TTC par les coliformes ; en gĠnĠral, les Escherichia coli provoquent

une coloration nettement orangée ; les OlebViellaune coloraWion jaune paille ; -halo jaune, dans le milieu lui-mêmeH VouV la membrane, autour des colonies précédentes, correspondant à une fermentation du lactose par ces colonies.

La flore bactérienne associée est généralement beaucoup moins abonTanWe TanV la boîWe incubée à 44 °C.

Deuxième étape :

examen et repiquage des colonies sur des milieux de confirmation Nn cerWaineV circonVWanceVH il eVW poVVible Te Ve conWenWer Te compter les colonies correspondant, d'aprğs leurs aspects, audž coliformes ; il est toutefois recommandé de pratiquer des tests VimpleV confirmaWifV.

Cette Ġtape comporte ă partir d'une colonie isolĠe ͗ ‰1. Coloration par la méthode de Gram et examen microscopique des bacilles à Gram négatif.

‰2. Recherche de l'odžydase nĠgatiǀe

‰3. Impérativement repiquage sur les milieux confirmatifs liquides : ƒa) Bouillon lacWoVébilié au verW brillanW à clocUeH incubé à 37 °C J l'edžistence d'un ǀirage au jaune et de gaz dans la cloche correspond à une réaction positive pour la présence dequotesdbs_dbs7.pdfusesText_13

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