REPLICATION DE LADN
toute division cellulaire. Elle se produit exactement au cours de la phase S (synthèse) de l'interphase chez les cellules eucaryotes.
La réplication dADN-Biologie Moléculaire-Dahmani.pdf
chez les procaryotes. (9 ADN polymérases chez les eucaryotes). ? La polymérase alpha/primase. Cette polymérase est impliqué dans l
REPLICATION DE LADN
La réplication de l'ADN dans les cellules eucaryotes et procaryotes se déroule selon un mécanisme identique. Elle est cependant beaucoup plus complexe chez
III/ LA RÉPLICATION DE LADN CHEZ LES EUCARYOTES
- Dans les cellules eucaryotes la réplication de l'ADN se produit pendant la phase S du cycle cellulaire. - Le cycle cellulaire est régulé par une série de "
REPLICATION DE LADN
toute division cellulaire. Elle se produit exactement au cours de la phase S (synthèse) de l'interphase chez les cellules eucaryotes.
Partie 2: Expression génétique
VI – La réplication chez les Eucaryotes Synthèse de plusieurs molécules d'ADN à partir d'une ... Réplication de l'ADN circulaire: structure thêta.
La réplication de lADN chez leuryarchaea Pyrococcus Abyssi : mise
LA REPLICATION DE L'ADN : V. Coupure de l'ADN par des enzymes de restriction :. ... sur les métabolismes de l'ADN montrent que chez les eucaryotes
REPLICATION DE LADN
La réplication de l'ADN dans les cellules eucaryotes et procaryotes se déroule selon un mécanisme identique. Elle est cependant beaucoup plus complexe chez
CHAPITRE 2 BIOLOGIE MOLECULAIRE Mme OUNIS.pdf
Chez les eucaryotes: - L'ADN polymérase? : Synthèse les amorce mixte ARN/ADN de 25 à30 nucléotides à l'origine de la réplication sur le
Faculté de Médecine-Sétif1 Dr Saffidine Karima
3'?5' dans le brin directe en respectant les règles de complémentarité (Figure 5). Figure 5 : Réplication de l'ADN chez les procaryotes
[PDF] REPLICATION DE LADN - Faculté de Médecine dOran
Outils moléculaires de la réplication VI Réplication chez les procaryotes VII Réplication chez les eucaryotes VIII Réplication de l'ADN mitochondrial
[PDF] La réplication dADN-Biologie Moléculaire-Dahmanipdf
La réplication se fait en de nombreux points d'initiation ? Elle fait intervenir un nombre d'ADN polymérases plus important que chez les procaryotes (9 ADN
[PDF] III/ LA RÉPLICATION DE LADN CHEZ LES EUCARYOTES
- Dans les cellules eucaryotes la réplication de l'ADN se produit pendant la phase S du cycle cellulaire - Le cycle cellulaire est régulé par une série de "
[PDF] Partie 2: Expression génétique - Faculté des Sciences de Rabat
IV- Fidélité de la réplication : PROOFREADING V - La réplication et la division cellulaire VI – La réplication chez les Eucaryotes
[PDF] REPLICATION DE LADN
II/ MECANISME DE LA REPLICATION : La réplication de l'ADN dans les cellules eucaryotes et procaryotes se déroule selon un mécanisme identique Elle est
[PDF] La réplication de lADN chez leuryarchaea Pyrococcus Abyssi
Production de l'ADN polymérase B ?PIP par transcription/traduction in vitro : supposé commun aux procaryotes (Bacteria et Archaea) et aux eucaryotes
[PDF] Réplication de lADN
Un analogue de ce collier existe aussi chez les eucaryotes (PCNA) Page 8 Les principales polymérases eucaryotes (A bien connaître : polymérases et )
[PDF] Réplication et Réparation de lADN - Master Prépa Santé
7 nov 2018 · Chez les procaryotes organisme unicellulaire sans noyau l'ADN est en général présent sous la forme d'un seul chromosome circulaire
[PDF] 1 La réplication de lADN
Dans le cas de la reproduction conforme la division cellulaire est une mitose (détaillée elle aussi dans le chapitre suivant) qui permet de constituer deux
Comment se fait la réplication de l'ADN chez les eucaryotes ?
Chez les eucaryotes : l'ADN polymérase ? qui dispose d'une activité primase complète, est responsable de l'initiation de la synthèse d'ADN. L'ADN est répliqué par les ADN polymérases ? et ? : ? synthétise le brin tardif et ? synthétise le brin précoce.Où se déroule la réplication chez les eucaryotes ?
Chez les eucaryotes, la réplication de l'ADN démarre en différents points d'initiation dans le génome ; elle a lieu dans la phase S du cycle cellulaire.Quelles sont les étapes de la réplication d'ADN ?
La réplication peut être divisée en trois étapes principales : l'initiation, l'élongation et la terminaison.- La réplication chez les procaryotes commence à partir d'une séquence trouvée sur le chromosome appelée origine de la réplication, c'est-à-dire le point où l'ADN s'ouvre. L'hélicase ouvre la double hélice de l'ADN, ce qui entraîne la formation de la fourche de réplication.
REMERCIEMENTS N° Ordre : 3338
de la thèse THESE présentéeDEVANT L'UNIVERSITE DE RENNES 1
pour obtenir le grade de : DOCTEUR DE L'UNIVERSITE DE RENNES 1MENTION : BIOLOGIE
parChristophe ROUILLON
Equipe d'accueil : Laboratoire de Microbiologie des environnements extrêmes, UMR 6197,IFREMER, centre de Brest
Ecole doctorale : Université de Rennes1, Vie-Agro-Santé (VAS) Composante universitaire : Sciences de la Vie et de l'EnvironnementLA REPLICATION DE L'ADN CHEZ L'EURYARCHAEA
PYROCOCCUS ABYSSI : MISE EN PLACE ET DYNAMIQUE DU
COMPLEXE
Soutenue le 19 juin 2006 devant la commission d'examen :COMPOSITION DU JURY :
Professeur Daniel BOUJARD, Université de Rennes 1 Président Professeur Patrick FORTERRE, Université d'Orsay Rapporteur Docteur Robert FUCHS, IBSM Marseille Rapporteur Docteur Jean-Paul RAFFIN, UMR6197 Plouzané Directeur de thèse Docteur Gilbert SALBERT, Université de Renne 1 Examinateur Docteur Joël QUERELLOU, UMR6197 Plouzané Examinateur 1REMERCIEMENTS
Nous sommes tous bons quand
nous donnons notre bon fond A mes collègues, amis, famille, voisins, passants...A l'océan...
MERCI !
2SOMMAIRE
SOMMAIRE
A INTRODUCTION GENERALE........................................................................ I NTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE........................................................................ L ES ARCHAEA :........................................................................I. Troisième règne du monde vivant........................................................................
............................13 II. Les grands groupes........................................................................ II I. Les thermococcales........................................................................ III.1. Le genre Pyrococcus :........................................................................ III.2. Pyrococcus abyssi........................................................................IV. Caractères communs aux archées et aux eucaryotes........................................................................
..................16V. Intérêt biotechnologique des archées thermophiles........................................................................
.....................18VI. Thermostabilité et thermophilie........................................................................
L A REPLICATION DE L'ADN : ........................................................................ I. Notion de réplisomes :........................................................................II. Le réplisome du bactériophage T4 :........................................................................
III. Le réplisome du procaryote bactérien Escherichia coli :...................................................................................26
IV. Le réplisome eucaryote : ........................................................................
V. Le réplisome archéen :.....................................................................VI. Facteurs intervenant dans la phase d'élongation : ........................................................................
....................32 VI.1. Les ADN polymérases........................................................................VI.1.1. Motifs et structures :........................................................................
V I.1.2. Interactions :........................................................................VI.2. Le facteur de réplication PCNA :........................................................................
VI.2.1. Structure :........................................................................ V I.2.2. Fonctions du PCNA :...................................................................... VI.2.3. Interactions :........................................................................VI.3. Le facteur de réplication RF-C : ........................................................................
VI.3.1. Fonctions du RF-C :........................................................................ VI.3.2. Structure :........................................................................ V I.3.3. Interactions :........................................................................VI.4. Le facteur de stabilisation de l'ADN simple brin (RP-A)..............................................................................................44
VI.4.1. Fonctions du RP-A :........................................................................VI.4.2. Organisation structurale et fixation sur l'ADN simple brin :..................................................................................46
VII. Etudes effectuées sur les facteurs intervenant dans la phase d'élongation du réplisome des euryarchées :
(tableau 2)........................................................................ 3SOMMAIRE
MATERIELS ET METHODES........................................................................ PROTEINES RECOMBINANTES : CONSTRUCTIONS GENETIQUES ET MATERIEL PROTEIQUE..............................................54
I. Les ADN polymérases :........................................................................I.1. Les ADN polymérases B et D :........................................................................
I.2. Les ADN polymérases ǻPIP :........................................................................
I.2.1. Conditions utilisées pour la mutagenèse dirigée........................................................................
................................55I.2.2. Production et purification des protéines mutantes :...................................................................................................56
I.2.3. Révélation par Western Blot (figure 26) : ........................................................................
I.2.4. Production de l'ADN polymérase B ǻPIP par transcription/traduction in vitro :......................................................58
II. Les PCNAs : (30 kDa/monomère) ........................................................................
II.1. Le PCNA sauvage (PCNAwt) :........................................................................
II.2. Le PCNA(ded) : ........................................................................II.2.1. Conditions de mutagenèse dirigée (tableau 4)........................................................................
..................................60II.2.2. Contrôle et transformation en cellules d'expression ................................................................................................60
II.2.3. Production et purification de la protéine recombinante............................................................................................61
II.3. Les PCNAs phosphorylables (ph-PCNAwt et ph-PCNA(ded)) :..................................................................
...................66II.3.1. Constructi
ons génétiques........................................................................II.3.2. Production et purification de la protéine recombinante ; bilan :...............................................................................67
III. Le RF-C :........................................................................ IV. Le RP-A:........................................................................ TECHNIQUES DE CULTURE CELLULAIRE ET DE BIOLOGIE MOLECULAIRE.......................................................................69
I. Culture de Pyrococcus abyssi (souche GE5)........................................................................
................................69II. Culture
s d'E. coli et souches utilisées........................................................................
III. Conditions de PCR........................................................................III.1. PCR sur ADN génomique :........................................................................
III.2. PCR de contrôle sur clones :........................................................................
IV. Extraction de l'ADN........................................................................IV.1. Extraction de l'ADN total de P. abyssi :........................................................................
IV.1.1. Préparation
du culot bactérien........................................................................ IV.2.Extraction d'ADN plasmidique en petit volume (2 ml) et grand volume (50 ml) :........................................................72
V. Coupure de l'ADN par des enzymes de restriction :........................................................................
....................72VI. Clonage en vecteur d'expression : ........................................................................
VI.1. Linéarisation du vecteur ; création des sites de clonage :...............................................................................................72
VI.2. Préparation des inserts :........................................................................
VI.3.Ligature des inserts digérés et du vecteur linéarisé par la T4-ADN ligase :...................................................................73
VII. Transformation en cellules compétentes........................................................................
...................................73VII.1. Transformation en cellule de maintenance........................................................................
VII.2. Transformation en cellules d'expression........................................................................
VIII. Mutagenèses dirigées........................................................................
IX. Visualisation de l'
ADN sur gel d'agarose........................................................................ ..................................74X. Séque
nçage de l'ADN........................................................................ XI.Linéarisation de la matrice M13mp18 simple brin circulaire............................................................................75
TECHNIQUES DE PRODUCTION ET DE PURIFICATION DE PROTEINES RECOMBINANTES....................................................77
I. Expressions de protéines recombinantes........................................................................
......................................77I.1. Expressions en petits volumes :........................................................................
I.2. Expression en grands volumes :........................................................................
4SOMMAIRE
I.3. Expression par un système de transcription/traduction in vitro........................................................................
................77II. Visualisation des protéines sur gel de polyacrylamide dénaturant (SDS-PAGE) ...............................................78
II.1. Préparation de
s échantillons :........................................................................ II.2. Migration :........................................................................II.3. Révélation et séchage des gels : ........................................................................
III. Pur
IV. Dosage des protéines : ........................................................................
V.Obtention de séquences peptidiques........................................................................
V.1. Séquençage N-terminal par la méthode d'Edman :........................................................................
.................................80V.2. Spectrométrie de masse........................................................................
VI. Analyse par chromatographie en phase liquide à haute pression......................................................................80
VII. Test d'activité des ADN polymérases :........................................................................
......................................81VII.1. Matrice d'ADN utilisée :........................................................................
VII.2. Réaction :........................................................................ V II.3. Comptage : ........................................................................ METHODES DE BIOCHIMIE FONCTIONNELLE ET INTERACTIONS........................................................................
..............82I. Chargement du PCNA par réaction de pontage au glutaraldéhyde :...................................................................82
I.1. Principe (figure 39) :........................................................................I.2. Phosphorylation du PCNA :........................................................................
I.3. Préparation de la matrice d'ADN amorcée :........................................................................
I.4. Chargement et visualisation du complexe ADN/PCNA :........................................................................
.........................83I.4.1. Réaction de chargement........................................................................
I.4.2. Electrophorèse et révélation........................................................................
II. Synthèse d'ADN in vitro : (figure 40)........................................................................
II.1. Matrice
d'ADN amorcé :........................................................................II.2. Réaction d'élongation : ........................................................................
II.3. Gel alcalin :........................................................................II.3.1. Préparation du gel :........................................................................
II.3.2. La migration :........................................................................II.3.3. Séchage et révélation :........................................................................
II.3.4
. Marqueur de taille........................................................................III. Interactions des protéines
avec un ADN simple brin amorcé ............................................................................86
III.1. Visualisation pa
r western blot :........................................................................III.1.1. principe (figure 41)........................................................................
III.1.2. Matrice d'ADN utilisée........................................................................
III.1.3. Utilisation de billes magnétiques streptavidinées ...................................................................................................87
III.1.4. Ajout des protéines :........................................................................
III.1.5. Western Blot et révélation par anticorps :........................................................................
III.2. Résonance plasmonique de surface :........................................................................
III.2.1. Principe de la résonance plasmonique de surface...................................................................................................88
III.2.2. Principe de fonctionnement de l'appareillage utilisé (Biacore X) ..........................................................................89
III.2.3. Expériences réalisées........................................................................
I. Et ude du chargement du PCNA :........................................................................I.1. Le PCNA de P. abyssi se charge sur l'ADN en absence de RF-C :........................................................................
..........92I.2. Importance de la structure trimérique du PCNA........................................................................
I.2.1. Obtention d'un PCNA mutant incapable de former un trimère :...............................................................................94
5SOMMAIRE
I.2.2. Le PCNA(ded) ne forme pas de trimère en solution :................................................................................................96
I.2.3. Le marquage du PCNA(ded) est plus efficace que celui du PCNA sauvage.............................................................97
I.2.4. Le PCNA(ded) n'interagit pas avec l'ADN........................................................................
I.3. Stoechiométrie fonctionnelle du RF-C........................................................................
I.4. Quantification de l'inte
nsité du signal de chargement......................................................................................................99
I.5. Le RF-C est-il un facteur de déchargement ?........................................................................
I.6. Stabilité du complexe PCNA/ADN :........................................................................
I.7. L'ADN polymérase B stimule le chargement du PCNA........................................................................
........................104I.8. Visualisation d'un complexe fonctionnel ........................................................................
I.8.1. Elongation de l'amorce par l'ADN polymérase B........................................................................
...........................106I.8.2. Importance de la nature de l'amorce ........................................................................
II. Etude de la synthèse d'ADN par les ADN polymérases B et D en présence des facteurs accessoires ..............108
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