[PDF] Comprendre les nanosciences - 5.1a – Voir le vivant aux échelles

Copyright©2017,MOOCNano,COMUEUniversitéParisSaclay&UniversitéParis-Sud MOOC:Comprendrelesnanosciences 5.1a - Voir le vivant aux échelles nanométriques Les processus élémentaires se déroulent dans le vivant à l'échelle moléculaire. Ils impliquent un grand nombre de ces molécules qui, à un instant donné du processus se trouvent dans une phase différente. Si l'on veut étudier et comprendre ce processus, il est nécessaire, il peut être utile en tout cas, de l'étudier à l'échelle de la molécule individuelle. Nous allons v oir que par des techniques de microscopie de fluoresce nce, il est possible de résoudre des processus tels que les déplacements moléculaires à une échelle nanométrique. Nous utiliserons comme exemple le transport intracellulaire, qui fonctionne à l'aide de moteurs moléculaires qui transportent des cargos sur des structures telles que les microtubules. Ce sont des structures de taille nanométrique, 4 nanomètres pour leur diamètre, et que l'on peut observer aussi par des techniques très avancées de microscopie électronique, qui présentent bien l'assemblage cargo-moteur-microtubule. Alors, les techniques de l'optique sont limitées par les lois de la diffraction, et, malgré cette limitation, on va voir qu'on peut quand même observer des déplacements aussi petits que le pas de ce type de moteur. L'image d'une source ponctuelle par un microscope est, effectivement, limitée par la tache de diffraction. Et la d imension de cette tache de diffraction dépend de l'ouverture num érique de l'objec tif et de l'indice de réfraction, et dans cet exemple où la longueur d'onde est dans le rouge, la limite de diffraction impose un rayon d'Airy de 280 nm. Donc une tache de diffraction va avoir une dimension qui est deux fois ce diamètre, c'est-à-dire environ 570 nm, sur un détecteur. L'on peut ajuster cette tache de diffraction à l'aide d'une gaussienne dont l'écart-type vaut environ le rayon d'Airy divisé par trois. C'est un ajustement pour une image donnée. Simplement, si l'on reproduit cette imagerie plusieurs fois, pour vérifier si on obtient toujours le même résultat, on se rend compte qu'en fait le maximum de cette gaussienne va bouger. Et finalement c'est ce déplacement-là qui nous renseigne sur la précision avec laquelle on peut localiser la source ponctuelle. On peut quantifier cette précision de localisation à l'aide de ce qu'on va appeler l'écart standard sur la moyenne, que l'on note sigma. Il est possible de calculer théoriquement cette erreur standard sur la position de la moyenne de l'émetteur, en considérant que chaque photon issu de l'émetteur, qui donc normalement provient de cette source ponctuelle, finalement tombe dans une tache qui stati stiquement est décrite par une gauss ienne. Aussi les lois d e la statistique permettent de calculer l'erreur st andard sur la position, simpl ement en divisant l'écart-type de la gaussienne, s, par le nombre de photons détectés, le nombre de fois où on répète la mesure, dont on prend la racine carrée. Donc s sur racine de N, qui dans notre exemple, nous donne une erreur standard sur la position de seulement 3 nm, c'est-à-dire cent fois moins que la limite de diffraction. On voit donc qu'il est effectivement possible de local iser une so urce ponctuelle avec une précision très en-dessous de la limite imposée par l'optique ondulatoire. Munis de cette précision de localisation, on va donc pouvoir étudier le déplacement, par exemple, on va donc pouvoir étudier la position de molécules telles que les colorants organiques qui sont très utilisés dans le domaine de la biologie, du biomarquage. Ici on a choisi deux exemples, la cyanine 3 et la cyanine 5, qui diffèrent par la longueur de la chaine de méthines qui relie les deux hétérocycles, et cette simple différence suffit à expliquer le spectre de fluorescence qui pour l'une est dans le vert et pour l'autre dans le rouge. On voit donc qu'avec des colorants de ce type on peut couvrir le spectre visible et faire du multiplexage et étudier plusieurs processus en parallèle. Alors, certes, c'e st un avantage, mais l'i nconvénient que p résentent ces émetteurs, c'est de scin tiller et de "blanchir", d'être photodégradés, définitivement, à l'issue de l'émission d'environ 10 000 à un million de photons par molécule.

Copyright©2017,MOOCNano,COMUEUniversitéParisSaclay&UniversitéParis-Sud MOOC:ComprendrelesnanosciencesPour pallier à ce défaut, d'autres systèmes ont été inventés, comme les nanocristaux semiconducteurs, appelés en anglais quantum dots, qui sont constitués en fait d'un coeur d'un alliage, ici par exemple, de cadmium et de sélénium, dans lequel sont piégés les porteurs de charge, des excitons, des paires électron-trou, et autour duquel on construit, on fait croitre une coquille pour stabiliser la luminescence. La coquille ici est en sulfure de zinc. La propriété importante de ce type de structure, c'est d'avoir un spectre de luminescence qui est celui d'un émetteur unique, et dont la fluorescence dépend uniquement du diamètre du coeur. Effectivement la mécanique quantique permet de démontrer que les niveaux d'énergie des excitons à l'intérieur du coeur dépendent de l'écart entre la bande de valence et la bande de conduction, et cet écart dépend de la taille du coeur. Donc on peut ainsi couvrir la gamme totale du visible, avec des particules dont la dimension de coeur est de 3 nm, pour le bleu, à environ 5 nm pour le rouge. Donc ces émetteurs sont aussi très versatiles, ils permettent aussi du multiplexage, mais ils ont encore le défaut de scintillement, comme on peut le voir ici quand on les dépose sur une lame de verre et qu'on les éclaire en continu. Ici c'est un film en temps réel, on voit que l'interruption de luminescence est totale pour beaucoup d'entre eux, la quasi-totalité, et de manière complètement aléatoire. Alors pour résoudre ce problème avec des nanoparticules, on peut, au lieu de mettre un seul émetteur, en mettre plusieurs à l'intérieur de la nanoparticule, on peut avec cette approche on peut imaginer lisser le problème du scintillement. Deux exemples sont présentés ici, celui du défaut azote-lacune, à l'intérieur d'une matrice de diamant. C'est un défaut qui non seulement ne scintille pas à l'échelle individuelle, ce qui est mieux que le quantum dot, mais qui peut être aus si concentré dans une nanoparticule de tail le aussi petite que 30 nm . E t on voit ai nsi qu'effectivement, en concentrant les émetteurs, on obtient une émission plus intense. L'autre avantage évidemment , c'est que compte tenu de l'absence de scintill ement, la particule va êt re parfaitement stable, sa luminescence va être parfaitement stable au cours du temps, et le film que l'on a vu précédemment pour les q-dots et avec beaucoup de scintillement, ici ne présente plus ce type de défaut. D'autres particules ont également été utilisées, par exemple l'europium comme émetteur dans un oxyde comme le vanadate d'yttrium. Ce sont également des toutes petites particules, qui émettent également dans le rouge, et qui contiennent beaucoup plus d'émetteurs que les nanodiamants fluorescents, environ 10 000 par particule. Donc là on a deux exemples de possibilités de particules. Alors, ces particules peuvent, ou ces colorants que j'ai mentionné précédemment, doivent être attachés aux biomolécules d'intérêt, ou doivent être incorporés dans le système biologique d'intérêt, pour faire un suivi du processus, et ceci doit être fait à des concentrations qui doivent être assez faibles pour que chaque molécule soit observée une molécule à la fois, et donc cela signifie que deux molécules, deux émetteurs doivent être distants d'au moins la tache de diffraction, enfin le rayon d'Airy de la tache de diffraction pour respecter le critère de Rayleigh. Pour ce faire , il faut diluer l'échantillo n pour n' avoir qu'un se ul émetteur dans un volum e d'i ntérêt. On peut considérer l'exemple d'une i llumination par réflex ion totale, où l'onde d'illumination ne s'étend que sur un e longueur d'onde environ, ce volume est d'environ 20 x 10-18 litre, 20 femtolitres, c'est un tout petit volume, et on veut dans ce volume, pour pouvoir faire une observation en molécules individuelles, ou en émetteur unique, une seule particule. Le calcul conduit à une concentration de seulement 80 nanomoles par litre. On est en fait en dessous des concentrations physiologiques, qui sont de l'ordre de la micromole, mais il est possible dans certaines conditions de pouvoir se rapprocher des concentrations physiologiques comme je le signalerai en conclusion. Maintenant revenons à notre problème précédent, celui du suivi du transport intracellulaire. Dans l'expérience réalisée il y quelques années, les chercheurs avaient incorporé le marqueur quantum dots à l'intérieur du cargo. Ils suivaient ce cargo avec une résolution de 3 nanomètres, même meilleure que 3 nm, grâce à l'efficacité de collection de leur système, et ils ont pu reconstruire des trajectoires de ces cargos, ici la trajectoire présentée étant verte, qu'ils ont ensuite lissée avec un filtre non-linéaire qui garde les déplacements de grande amplitude, et après ce traitement de données, ils ont construit l'histogramme du pas du déplacement entre deux images consécutives. Cet histogramme présente un pic à zéro, donc pas de déplacement entre deux images,

Copyright©2017,MOOCNano,COMUEUniversitéParisSaclay&UniversitéParis-Sud MOOC:Comprendrelesnanosciencespuis un pic à 8 nm, qui représente finalem ent le pas d'un déplacement du moteur, et un pi c à 16 nm, qui correspond à un déplacement plus rapide que ne peut le résoudre la cadence d'acquisition. On voit que la présence d'un pic à 8 et d'un pic à 16 confirme le déplacement par pas du moteur et montre aussi que les techniques opti ques permettent de résoudre les déplacements à l'échel le nanométrique, permettent d'observer le vivant à l'échelle nanométrique. Alors, comme je vous l'ai signalé juste peu de temps avant, ces techniques ne se limitent pas à l'observation de molécules individuelles à des faibles concentrations. Si l'on ajoute un ajoute un contrôle photochimique de la luminescence de ces molécules, il est possible d'utiliser des concentrations plus fortes, et alors de résoudre des structures à l'échelle nanométrique par des techniques de microscopie en molécule unique assez similaires aux techniques que je viens de décrire. François Treussart