[PDF] Analyse génétique des réponses physiologiques du tournesol

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THESE

Présentée

En vue de l

'obtention du Doctorat de l'Institut National Polytechnique de Toulouse Spécialité: Génétique et Amélioration des Plantes

Ecole doctorale :

S.E.V.A.B

par

Seifollah POORMOHAMMAD KIANI

Analyse génétique des réponses physiologiques du tournesol (Helianthus annuus L.) soumis à la sécheresse

Soutenu le 10

Mai 2007 devant le jury composé de:

Prof. Y. Henry CNRS, Paris

Rapporteur

Prof. G. Charmet INRA, Clermont-Ferrand Rapporteur

Prof. L. Gentzbittel INP/ENSAT, Toulouse Examinateur

Prof. T. Lamaze UPS, Toulouse Examinateur

Prof. C. Planchon INP/ENSAT, Toulouse Invité

Dr. P. Maury

INP/ENSAT, Toulouse Invité

Prof. P. Grieu

INP/ENSAT, Toulouse

Directeur de thèse

Prof. A. Sarrafi INP/ENSAT, Toulouse

Directeur de thèse

Ecole National Supérieure Agronomique de Toulouse (ENSAT) N° d'ordre:

Remerciements

Cet

te thèse a été réalisée dans le cadre d'une bourse accordée par le Ministère de l'Education

Nationale et de la Recherche en Iran. J'exprime ici mes remerciements pour le financement de mes études en France ainsi qu' au service de l'Education de l'Ambassade d' Iran en France.

Je tien à exprimer ma gratitude à mes responsables de thèse, Monsieur le Professeur Sarrafi et

Monsieur le Professeur Grieu, pour la confiance qu'il m'ont témoigné en me proposant ce

sujet, pour leur précieux conseils et grande disponibilité. Ces quelques années ont été pour

moi très enrichissantes, tant sur le plan professionnel que sur le plan humain. Qu'il trouve ici l'expression de toute ma reconnaissance, de ma profonde admiration et de ma respectueuse considération. Je remercie Monsieur le Professeur Gentzbittel, Directeur du laboratoire BAP, pour ses

conseils, principalement pour la partie concernant la réalisation de la carte génétique et de

l'étude de l'expression des gènes.

Je tiens également à remercier

chaleureusementMonsieur Maury, pour ses précieux conseils et sa grande disponibilité. Je remercie chaleureusement toute l'équipe du BAP (les chercheurs et les techniciens) ainsi que tous mes amis doctorants qui ont rendu mon quotidien plus agréable au cours de ces quelques années. J'exprime mes remerciements aux membres du jury, particulièrement à Mr. Henry (Directeur

de Recherche à Université Paris-Sud) et à Mr. Charmet (Directeur de Recherche à l'INRA de

Clermont-Ferrand) qui m'ont fait l'honneur de juger ma thèse en qualité de rapporteurs. J'exprime ma profonde reconnaissance à mes amis, particulièrement Darvishzadeh, pour ses aides au cours de ma thèse et Davarzani pour ses aides informatiques.

Analyse génétique

des réponses physiologiques du tournesol (Helianthus annuus L.) soumis à la sécheresse

Résumé:

Afin de progresser dans la compréhension des caractères clés impliqués dans les processus de

tolérance à la sécheresse chez le tournesol, nous avons réalisé plusieurs expérimentations, en

conditions contrôlées et au champ sur des populations de tournesol exprimant diverses sources

de variabilité génétique : des lignées recombinantes (RILs) et des mutants. La variabilité

génétique pour la tolérance à la sécheresse, à travers l'étude des relations hydriques et de

caractères agronomiques, a été étudiée.

Dans un premier temps, nous avons construit une carte génétique intégrée et à haute densité en

utilisant une population de LIRs issue du croisement entre deux génotypes PAC2×RHA266.

Les QTLs contrôlant les caractères associés à l'état hydrique des plantes (teneur en eau

relative, potentiel hydrique et ses composantes) et à l'ajustement osmotique (AO) dans des

conditions 'irriguées' et de 'contraintes hydriques' ont été identifiés. Parmi 24 QTLs détectés

dans des conditions 'irriguées, cinq (environ 21%), ont été également détectés dans la

condition 'contrainte hydrique'. Ces QTLs sont considérés comme stables comparativement à

ceux spécifiques aux différentes conditions hydriques. Un QTL majeur pour l'AO sur le

groupe de liaison 5 est co-localisé avec les QTLs contrôlant plusieurs caractères de l'état

hydrique des plantes. Ce QTL pourrait être utilisé pour la sélection assistée par marqueurs.

Les LIRs et leurs parents ont été phenotypés en serre et au champ avec deux traitements

hydriques (irrigué et sécheresse). Le phénotypage a porté sur des caractères agronomiques

(phénologie, surface foliaire à la floraison, hauteur des plantes, sénescence, rendement et...).

En utilisant notre carte génétique, les QTLs liés à ces caractères ont été identifiés et leurs co-

localisations avec les QTLs contrôlant l'état hydrique des plantes et l'ajustement osmotique

ont été analysées. Nous pouvons noter que certains QTLs associés à la tolérance au déficit

hydrique sont situés dans les mêmes positions que ceux associés au rendement. Par exemple, le QTL majeur identifié pour l'AO est également détecté pour le rendement par plante, la surface foliaire et le poids du capitule. Ceci indique une base génétique commune pour la tolérance à la sécheresse et les caractères associés au rendement.

Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés à l'expression de gènes impliqués,

d'une part dans la tolérance à la contrainte hydrique, et d'autre part dans les processus limitant

les dommages oxydatifs, pour quatre génotypes ayant un comportement contrasté en situation

de contrainte hydrique. L'expression des gènes étudiés a été mise en relation avec les

caractères physiologiques mesurés concernant l'état hydrique, la photosynthèse et la

photochimie étant impliquées dans les processus d'assimilation du carbone pour la croissance.

Parmi les principaux résultats, on note une différence notable de l'expression des gènes

impliqués dans l'état hydrique des différents génotypes, plus particulièrement de l'aquaporine.

L'expression du gène de l'aquaporine est corrélée au caractère hydrique RWC. Pour les

processus photochimiques, ce sont principalement les niveaux d'expression des gènes codant

pour la superoxide dismutase, la catalase et la peroxidase qui différencient les génotypes

soumis à la sécheresse.

Les marqueurs moléculaires associés à l'ajustement osmotiques et à différents caractères

agronomiques ont été identifiés chez une population de mutants M6.

Mots clés : déficit hydrique, QTL, photosynthèse, état hydrique, ajustement osmotique,

expression de gènes, tournesol.

Genetic analysis of ph

ysiological responses to drought in sunflower (Helianthus annuus L.)

Abstract

Recombinant inbred lines (RILs) coming from the cross 'PAC2×RHA266' were used to develop an integrated and high density genetic-linkage map using SSR and AFLP markers. QTLs involved in the genetic control of water status traits (RWC, Yw, Ys, Yt and YsFT) and osmotic adjustment (OA) under well-watered and water-stressed conditions were identified. Among 24 QTLs detected under well- watered conditions, 5 (about 21%) were also detected in the water-stressed treatment (stable QTLs) and the rests were specific. A major QTL for OA on linkage group 5 is overlapped with the QTLs for several water status traits.

In order to understand the response of yield and related agronomic traits to different water treatments

and growth conditions, RILs and their parents were phenotyped at greenhouse and field condition with two water treatments. Using our saturated linkage map, the QTLs controlling agronomical traits were identified and their co-location with QTLs for plant water status and osmotic adjustment were investigated. Genotypic variation for water status and gas exchange parameters under different water treatments

were studied and the differential expression of four water-stress associated genes were investigated.

The expression level of aquaporin genes in leaves of four RILs and their parents was down regulated by water stress and was associated with relative water content (RWC). Down-regulation was also

associated with genomic regions having alleles with negative effects on plant water status. Net

photosynthesis rate (Pn) and the fructose-1,6 bisphosphatase gene expression levels were associated mainly after rehydration. The genomic regions involved in genetic variability for chlorophyll fluorescence parameters were mapped in RILs and the differential expression of various antioxidant genes were investigated by

quantitative real-time RT-PCR in four selected RILs and their parental lines. Significant higher level

of POD (66-fold) was observed. The putatively drought-tolerant genotype (C100) showed the highest transcript level for SOD, CAT, PSI P700 and PSII 32 Kda Protein resulting in the maintenance of photosynthesis under water stress. QTL mapping and graphical genotyping showed that the positive or negative alleles of some QTLs such as 'NPQD.11.1' and '1-qPD.2.1' could be associated with the transcript abundance of SOD and CAT in the putatively drought-tolerant genotype (C100).

Molecular markers associated with osmotic adjustment-related traits as well as with different

agronomical traits were identified in well-watered and water-stressed plants for a population of M6 mutant lines. Key words: Water stress, QTL mapping, photosynthesis, plant water status, osmotic adjustment, gene expression, sunflower

Abréviation

1- qP :

Proportion of closed PSII traps (proportion de PSIIs réduits)

1000GW : 1000 grains weight (poids de 1000 graines)

BIO: BIOmass per plant (biomass sèche par plante)

Ci : intercellular CO

2 concentration (concentration intercellulaire en CO2)

DFM : Days from Flowering to physiological Maturity (nombre de jours entre la floraison et la maturité

physiologique) DSF : Days from Sowing to Flowering (nombre de jours entre le semis et la floraison) gs : stomatal conductance (conductance stomatique) GYP : Grain Yield per Plant (rendement exprimé par la masse des graines par plante) GYTI : Grain Yield Tolerance Index (indice de la tolérance)

HW: Head Weight (masse du capitule)

LAD : Leaf Area Duration (durée de surface foliaire verte en post floraison LAF : Leaf Area at Flowering (surface foliaire à la floraison) LN : Leaf Number (le nombre de feuilles par plante) NPQ : Non-Photochemical Quenching (quenching non-photochimique) OA : osmotic adjustment (ajustement osmotique 'AO')

PH : Plant Height (hauteur de la plante)

Pn : net photosynthesis (photosynthèse nette)

PSII : photosystem II (photosystème II)

RWC : relative water content (teneur en eau relative)

Tr : transpiration (transpiration)

FP : potential photochemical efficiency of PSII (efficience photochimique potentielle des PSIIs)

FPSII : actual efficiency of PSII electron transport (rendement quantique du transport des électrons)

Y s : osmotic potential (potentiel osmotique) Y sFT : osmotic potential at full turgor (potentiel osmotique à pleine turgescence) Y t : turgor potential (potentiel de turgescence) Y w : leaf water potential (potentiel hydrique foliaire)

SOMMAIRE pages

INTRODUCTION : CONTEXTE DE L'ETUDE ET PRESENTATION DES

1. Production et intérêt de la culture du tournesol...............................................................1

2. Nécessité d'augmenter la production : objectif finalisé...................................................1

3. Un des principaux facteurs limitant la production: la sécheresse estivale.....................2

4. Définition du sujet de thèse ........................................................................

........................3 CHAPITRE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE..........................................................5 1.1.

Le tournesol (Helianthus annuus L.)........................................................................

.6 1.2.

Croissance du tournesol et cycle de développement.................................................6

Période 'semis - début floraison'........................................................................

..................6

Période 'floraison-maturité'........................................................................

..........................6 1.3.

Sélection variétale chez le tournesol ........................................................................

..7 1.4. Marquage moléculaire, carte génétique et identification des QTLs.......................8 1.5.

Effets de la sécheresse et stratégies d'adaptation...................................................11

1.5.1. Effets de la sécheresse........................................................................

.................11

1.5.1.1. Effets de la sécheresse sur la production.....................................................11

1.5.1.2. Effets de la sécheresse sur la surface assimilatrice......................................12

1.5.1.3. Effets de la sécheresse sur l'activité photosynthétique ...............................12

1.5.2. Mécanismes d'adaptation à la sécheresse............................................................13

1.5.2.1. Eviter la sécheresse ........................................................................

.............14

1.5.2.2. Tolérer la sécheresse........................................................................

............16

1.5.3. Les mécanismes moléculaires de la tolérance à la sécheresse.............................16

1.5.3.1. Des gènes et leurs produits induits par le stress hydrique...........................16

1.5.3.1.1. Protéines du groupe des 'LEA' (Late-Embryogenesis-Abundant proteines)

1.5.3.1.2. Les Aquaporines........................................................................

...............17

1.5.3.1.3. Les protéines de transfert de lipides.........................................................18

1.5.3.1.4. Protection des structures photosynthétiques ............................................18

1.5.3.1.5. Le stress oxydatif ........................................................................

.............19

1.5.3.1.6. Accumulation d'osmolytes et de sucres solubles.....................................19

1.5.3.2. Activation transcriptionnelle des gènes.......................................................20

1.5.3.3. Amélioration de la tolérance à la déshydratation par la transformation

génétique ........................................................................ 1.6. Étude génétique des caractères physiologiques de tolérance au déficit hydrique et

recherche de marqueurs moléculaires........................................................................

.........23

1.6.1. Recherche de marqueurs par l'approche QTL et gènes candidats.......................23

1.6.2. Étude du polymorphisme de marqueurs moléculaires et relation avec la tolérance

au stress ........................................................................

1.6.3. Étude des mécanismes moléculaires de réponse au stress...................................24

CHAPITRE II : MATERIELS ET METHODES......................................................26 2.1. Matériel végétal ........................................................................ .................................27

2.1.1. La population des lignées recombinantes (RILs)................................................2

7

2.1.2. La population des mutants (M6) ........................................................................

.27 2.2. Conditions de culture........................................................................ ........................27

2.2.1. Conditions de culture pour les LIRs....................................................................27

2.2.1.1. Culture en conditions contrôlées (serre)......................................................27

2.2.1.2. Culture en conditions naturelles (champ)....................................................28

2.2.2. Conditions de culture pour les mutants...............................................................28

2.2.2.1. Culture en conditions contrôlées (serre)......................................................28

2.2.2.2. Culture en conditions naturelles (toit roulant).............................................28

2.2.3. Contrainte hydrique en serre pour LIRs ..............................................................2

9

2.2.4. Contrainte hydrique en champ pour LIRs ...........................................................29

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