[PDF] Létat de lart en illumination pour la microscopie de fluorescence

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Yann JOLY

OPTOPRIM

yjoly@optoprim.com

La lumière est devenue un outil puissant dans l"analyse pour les sciences de la vie. De nouvelles technologies

apparaissent régulièrement sur le marché et visent à répondre à des exigences toujours plus poussées : produire

une lumière peu coûteuse, de haute intensité, uniforme, et monochromatique à travers un large spectre dans

l"ultraviolet, le visible et le proche infrarouge. Beau coup de ces sources lumineuses commerciales ont des

limitations significatives en termes de performances, comme une puissance insuffisante et instable, une dérive

spectrale et/ou une durée de vie courte, limitations qui ne peuvent être surmontées qu"au moyen d"investissements

prohibitifs. Les sources lumineuses disponibles aujourd"hui sont loin de satisfaire à toutes les exigences et le choix

de l"une

ou l"autre est souvent un compromis entre prix et performances. Un aperçu des technologies d"illumination

employées dans les sciences du vivant permet de dresser leurs atouts et limitations respectifs.L"état de l"art en illumination pour

la microscopie de fluorescenceLes lampes

Žtendu pour un large Žventail d"applica-

tion s. doute ŽtŽ la source lumineuse la plus uti- lisŽe en sciences du vivant. La technologie mature a ŽtŽ maintes fois optimisŽe pour des applications d"Žclairage variŽes. Ainsi, il est peu probable que l"on puisse encore amŽliorer sa faible efficacitŽ de collection de vie et de stabilitŽ sont Ž galement inhŽ- rents et difficiles ˆ rŽsoudre. Cette source trale de plus de 1000 nm doit tre forte- ment filtrŽe pour crŽer les bandes de 10 ou 20 nm nŽcessaires en microscopie de fluorescence. Le rendement lumineux est liwatts, et parfois trop peu suffisant pour des applications d"imagerie.

Les lampes ˆ arc (au xŽnon

ou aux halo- gŽnures mŽtalliques tel que metal-halide par exemple) permettent de contourner cette limitation. Ces lampes de puissanceŽlevŽe engendrent des niveaux d"Žclai- surtout dans l"ultraviolet et l"infrarouge. En outre, elles crŽent des charges thermiques

ŽlevŽes qui doivent t

re soigneusement gŽrŽes pour Žviter de compromettre les ou l"environnement biologique de l"Žchan- tillon. L"instabilitŽ de puissance due ˆ l"instabilitŽ de l"arc dans le temps est un considŽrablement amŽliorŽe gr‰ce ˆ sa prolifŽration dans les vidŽoprojecteurs, cependant, l"arrivŽe des diodes Žlectrolu- minescentes (LED) bas cožt et les ques- tions soulevŽes par de nombreux pays sur le risque d"utilisation du mercure, brillantes, les plus pures d"un point de vue spectral. Le laser ˆ argon fut le laser le plus utilisŽ en sciences du vivant. Toutefois, son nom-bre limitŽ de raies, son prix, son entretien, sa consommation Žlectrique ŽlevŽe et son dispara"tre au profit des nouvelles tech- nologies lasers. Actuellement, le rempla- cement des lasers ˆ argon par des lasers

Žmettant dans la mme gamme de lon-

gueurs d"onde, mais plus compacts et plus Žconomes commence ˆ tre proposŽ.Les lasers DPSS

Les lasers DPSS (

diode pumped solid state ) sont des lasers ˆ semi-conducteurs dans lesquels un milieu ˆ gain solide, par exemple un rubis ou un cristal Nd:YAG, est pompŽ ˆ l"aide d"une diode laser. Un dou- blage et/ou une conversion de la frŽ- quence principale est ensuite rŽalisŽ intra ou extra cavitŽ pour obtenir diffŽrentes frŽquences dans le spectre visible, utiles pour la plupart des applications en ima - gerie biologique. Les lasers DPSS sont plus compacts et plus faciles d"utilisation que leurs prŽdŽcesseur s, mais ont surtout sante, brillante, stable et spectralement pure. Ils nŽcessitent cependant pour

Photoniques 62

IMAGERIE BIOLOGIQUEDOSSIER

30-41-IMAGERIE BIO:LOGIQUE_GAB-TECHNI:QUE 19/11/12 13:4:1 Page30Article disponible sur le sitehttp://www.photoniques.comouhttp://dx.doi.org/10.1051/photon/20126230

la plupart, des ŽlŽments optiques extŽ- rieurs (comme des modulateurs acousto- optiques) pour pouvoir tre modulŽs ˆ frŽ- quence ŽlevŽe. Par ailleurs, bien qu"ils rŽpondent ˆ de nombreuses applications, ces lasers ne couvrent qu"une partie du spectre visible et leur prix est de loin l"in- convŽnient le plus important.

Les diodes lasers

Longtemps utilisŽes pour des applica-

tions en tŽlŽcommunications ou pour le pompage d"autres lasers, les diodes lasers apparaissent de plus en plus dans les applications de sciences du vivant. Elles couvrent, elles aussi, une partie limitŽe du

DPSS (

voir tableau 1 ) : les deux technolo- gies permettent d"imager les fluoro- phores les plus communŽment utilisŽs en microscopie de fluorescence. Leur qualitŽ de faisceau et leurs puissances sont sou- vent infŽrieures ˆ celles des lasers DPSS, mais elles ont l"avantage de pouvoir tre

Bien que moins chers que les lasers DPSS,

les diodes laser prŽsentent des tarifs Žle- vŽs, surtout pour des applications nŽces- sitant de couvrir un large spectre.

Les lasers blancs ou super-continuum

arrivŽes sur le marchŽ de la biologie. Les lasers super-continuum sont formŽs ˆ un effet d"optique non linŽaire conduisant

ˆ l"Žmission d"un laser blanc, ˆ spectre

large, couvrant la gamme de longueurs d"onde allant d"environ 400 ˆ 2500 nm (figure 1). Bien que son manque d"Žmis- che ultraviolet puisse tre une limitation pour certaines applications, les lasers super-continuum blancs rŽunissent les principaux avan- tages des lampes blanches et des lasers

DPSS ou diodes : le faisceau dŽlivre un

spectre large, puissant, brillant, stable et spatialement uniforme. Ici encore, l"incon- www.photoniques.com

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DILASE 250

DILASE 650

DILASE 750

UV-KUB 1

UV-KUB 2

K-ILU 1

K-ILU 2

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Photoniques 62

DOSSIE

R

IMAGERIE BIOLOGIQUE

Liste non exhaustive des lasers compacts les

plus communément utilisés en imagerie de fluorescence.

Tableau 1

Longueur d"onde (en nm)Type de laser

355DPSS

375Diode

405Diode

445Diode

457DPSS

473DPSS ou diode

488Diode

491DPSS

515DPSS ou diode

532DPSS

553DPSS

561DPSS

594DPSS

637Diode

642Diode

660DPSS ou diode

705Diode

730Diode

785Diode

Figure 1.Exemple de spectres de lasers super-continuum blancs (Fianium).

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Les diodes électroluminescentes

Elles offrent de loin la meilleure option

de source lumineuse ˆ moindre cožt. Elles sont dŽsormais disponibles dans une gamme de longueurs d"onde relativement

Žtendue et permettent des vitesses de

commutation on/off apprŽciables dans beaucoup d"applications. Cependant, reste large (40 ˆ 50 nm) et nŽcessitent donc d"tre filtrŽes. En outre, de par leur technologie, leur Žmission est vert et le jaune, ce qui peut tre une limitation pour certaines applica- tions en sciences du vivant. Parce que l"intensitŽ lumineuse suffi- sante ne peut tre obtenue ˆ partir d"unitŽs individuelles, des matrices de LED sont souvent employŽes, formitŽ et de stabilitŽ. Leur princi- pal avantage, un cožt unitaire fai- ble, est souvent annulŽ par le cožt et la complexitŽ des composants supplŽmentaires nŽcessaires pour la mise en forme du faisceau.

Les tubes luminescents

DŽveloppŽe par la sociŽtŽ

Lumencor, c"est probablement

ayant fait ses preuves dans l"excita- tion lumineuse pour les sciences du vivant ( figure 2 gŽnŽrŽe par un tube luminescent excitŽ par un faisceau d"Žlectrons, des LED ou des lampes UV. Le tube constituŽ de matŽ- de luminescence et le temps de prŽchauf- fage du tube quasi nul offrent la possibilitŽ de commutations on/off rapides.

La gŽomŽtrie de ce type de tube permet

des rendements lumineux importants, comparables ˆ ceux des lasers DPSS visi- bles les plus puissants disponibles sur le marchŽ. Par ailleurs, le prix Žtant bien infŽ- composŽ de tubes luminescents et de bon compŽtiteur sur le marchŽ des sciences de la vie (figure 3).

Comparaison des différents systèmes

La microscopie de fluorescence

devient de plus en plus exigeante quant aux sources d"excitation qui doivent contribuer ˆ amŽliorer le rapport signal sur bruit, diminuer la photo-toxicitŽ et le blanchisse- ment, augmenter la vitesse d"ac- quisition et allonger la durŽe de vie de ses Žquipements tout en dimi- nuant leur cožt. Certaines techno- logies ne semblent alors plus tre tout ˆ fait adaptŽes.

ˆ arc dont l"Žmission de chaleur et

frarouge pose des questions de photo-toxicitŽ, pourraient ne plus satisfaire les exigences actuelles de l"imagerie de fluorescence. Les autres sources, LEDs, lasers, tubes lumi- nescents, se disputent la course au meil- leur candidat : dans le cas des LEDs, la puis- sance est encore parfois trop faible ; le cožt des lasers, surtout pour des applications multi-longueurs d"onde, est parfois exor- bitant. Cependant ces trois technologies prŽsentent un avantage crucial face aux lampes plus classiques : la possibilitŽ d"ajuster finement la puissance Žmise et courtes, voire mme synchronisŽes avec le dispositif de dŽtection, permet de trouver le compromis idŽal entre illumi nation, photo-toxicitŽ et blanchissement. Le ta - bleau 2dresse le bilan des atouts et limita- tions de chaque technologie. Comparaison des différentes technologies d"illumination en imagerie de fluorescence.Tableau 2 32

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DOSSIE

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IMAGERIE BIOLOGIQUE

TechnologiesSpectre utilePuissanceUniformitéRéponse temporelleÉmission de chaleurTemps de viePrix

Lampe à arcÉlevéMoyenneFaibleFaibleÉlevéeFaibleMoyen Laser DPSSMoyenÉlevéeÉlevéeFaibleFaibleMoyenÉlevé Diode laserMoyenMoyenneÉlevéeÉlevéeFaibleMoyenÉlevé Laser blancÉlevéÉlevéeÉlevéeÉlevéeFaibleMoyenÉlevé Tube luminescentÉlevéÉlevéeÉlevéeÉlevéeFaibleÉlevéMoyen

Figure 3.Comparaison des puissances spectrales

relatives des sources à arc et des systèmes hybrides comportant un tube luminescent et des LED filtrées (Lumencor).Figure 2.Schéma d"un tube luminescent (module

Light Pipe de Lumencor).

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