[PDF] Les examens du sperme dans lexploration de la fertilité masculine

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Progrès en Urologie (1997), 7, 496-504

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Les examens du sperme dans l'exploration de la fertilité masculine

Geneviève GRIZARD, Clément JIMENEZ

Service de Biologie du Développement et de la Reproduction, Centre Hospitalier Universitaire, Clermont-Ferrand, France

RESUME

L'exploration biologique de la fertilité masculine est basée sur l'étude du sperme; elle permet d'appré- cier l'ensemble des évènements qui se produisent depuis le démarrage de la spermatogénèse jusqu'à l'éjaculation. Le spermogramme et le spermocyto- gramme restent les examens de première intention. Ils peuvent être complétés par des examens plus spécifiques permettant l'appréciation des fonctions du spermatozoïde impliquées dans la traversée des voies génitales féminines et dans la pénétration de l'ovocyte. Toutefois, en dehors de l'azoospermie il n'existe pas de critère absolu à partir duquel on puisse parler de sperme infécond. L'interprétation devra être faite en tenant compte de l'ensemble de ces examens qui peuvent fournir des éléments de réponse sur l'étiologie de l'infécondité et orienter le traitement. Si l'utilisation des différents moyens thérapeutiques in vivo a échoué, les patients pour- ront alors avoir recours à des techniques de pro- création médicalement assistée (PMA). Le type de PMA choisie dépendra des caractéristiques sperma- tiques et de l'aptitude fonctionnelle des spermato- zoïdes. Mots clés : Sperme, explorations, infertilité.

Progrès en Urologie (1997), 7, 496-504.

Une étude épidémiologique récente a rapporté que la femme seule est responsable de 34% des infécondités du couple, l'homme seul l'est dans 20% des cas, les deux partenaires dans 38% des cas et aucune cause n'a été retrouvée dans 8% des cas [1]. L'exploration bio- logique de la fertilité masculine est basée sur l'étude du sperme; elle permet d'apprécier l'ensemble des évènements qui se sont produits dans l'appareil géni-

tal masculin depuis le démarrage de la spermatogénè-se jusqu'à l'éjaculation. Cet examen peut être complé-

té par des explorations plus spécifiques portant sur l'appréciation des différentes fonctions du spermato- zoïde impliquées dans la traversée des voies génitales féminines et dans les différentes étapes de la féconda- tion.

BASES PHYSIOLOGIQUES

La spermatogénèse est le processus de diff é r e n c i a t i o n cellulaire, qui à partir de cellules germinales souches donne naissance aux spermatozoïdes. Elle peut être divi- sée en trois phases distinctes. Au cours de la première phase, les spermatogonies se multiplient par des mitoses somatiques normales. Ces divisions permettent le renou- vellement des spermatogonies mais aussi la diff é r e n c i a- tion de ces cellules en spermatocytes I. La deuxième phase, qui correspond à la méïose, va permettre la trans- formation des spermatocytes I (cellules diploïdes) en spermatides (cellules haploïdes). Elle se divise en deux étapes: une mitose réductionnelle qui correspond à une réduction du matériel génétique de moitié et donnant les spermatocytes II suivie d'une mitose équationnelle. La méïose présente de nombreuses anomalies. C'est ainsi que 25% des cellules germinales dégénèrent entre le stade spermatocyte I et le stade spermatide. Cette dégé- nérescence augmenterait avec l'âge [2]. Dans la dernière phase qui constitue la spermiogénèse, le spermatide subit une série de transformations morphologiques profondes pour finalement donner naissance au spermatozoïde (Figure 1). La durée complète de la spermatogénèse est de 74 jours. Au terme de la spermatogénèse, le gamète possède toutes ses structures morphologiques indispen- sables à la fécondation. Toutefois, le spermatozoïde tes- ticulaire subit, aussi bien dans les voies génitales mascu- lines que dans les voies génitales féminines, de nom- breuses modifications physiologiques et biochimiques. Elles sont nécessaires au gamète masculin pour l'accom- plissement des étapes précoces de la fécondation: recon- naissance et pénétration de la zone pellucide, fusion ovo- cytaire (Figure 2). Au cours du transit épididymaire, les spermatozoïdes subissent une maturation progressive se traduisant par une acquisition de la mobilité fléchante, une condensa- tion de la chromatine et des remaniements membra- naires permettant la reconnaissance et les interactions avec l'ovocyte. Au moment de l'éjaculation, les sper- matozoïdes sont mélangés avec les sécrétions des glandes génitales annexes notamment celles de la pros- tate et des vésicules séminales. Ces fluides contiennent Manuscrit reçu le 11 mars 1995, accepté : avril 1995. Adresse pour correspondance : Dr.G .Grizard, Service de Biologie du Développement et de la Reproduction, Hôtel Dieu, CHU, Bd. Léon Malfreyt

63003 Clermont-Ferrand Cedex.

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de nombreuses substances responsables, en particulier du phénomène de coagulation-liquéfaction du sperme. Toutefois, compte tenu du temps de contact relative- ment court, le rôle des sécrétions prostatiques et sémi- nales sur l'activité fonctionnelle du gamète reste enco- re assez mal défini. Dans l'éjaculat, le spermatozoïde bien que possédant les potentialités nécessaires, ne peut pas exprimer sa fécondance. Il l'acquiert dans les voies génitales fémi- nines. Il subit une série de modifications, notamment au niveau membranaire, qualifiée de capacitation. Cette dernière est un préalable nécessaire à la réaction acrosomique et ne peut s'effectuer qu'après élimina- tion du liquide séminal qui normalement se comporte comme un milieu décapacitant. Cette élimination se fait en partie au moment de la traversée de la glaire cer- vicale. In vitro, la capacitation se fait après séparation des spermatozoïdes du liquide séminal et traitement par un milieu approprié. Le déplacement du spermatozoïde à travers les voies génitales féminines est assuré par les battements flagel- laires qui lui confèrent un mouvement particulier capable de s'adapter au micro-environnement lui permettant ainsi de progresser jusqu'au site de fécondation. L'interaction (reconnaissance et adhésion) entre le spermatozoïde et la zone pellucide qui entoure l'ovo- cyte se fait par l'intermédiaire de protéines spécifiques (Figure 2). Après la fixation à la zone pellucide. le spermatozoïde effectue la réaction acrosomique [3]. Cette réaction est caractérisée par la fusion ponctuelle des membranes plasmique et acrosomique externes conduisant à la formation de vésicules constituées de ces deux membranes. Ces vésicules se dispersent pro- gressivement et le contenu de l'acrosome est libéré, laissant exposée la membrane acrosomique interne impliquée dans la reconnaissance de la membrane ovo- cytaire. Après la traversée de la zone pellucide facilitée par les enzymes hydrolytiques acrosomiaux et une force propulsive importante induite par les battements flagellaires, le spermatozoïde pénètre dans l'espace périvitellin puis entre en contact avec la membrane ovocytaire. La fusion entre les 2 gamètes se produit au niveau du segment équatorial et de la cape post-acro- somique. Le noyau du spermatozoïde subit ensuite des modifications (dissolution de l'enveloppe nucléaire, décondensation de la chromatine), le transformant en pronoyau mâle.

EXPLORATIONS

Le spermogramme et le spermocytogramme consti-

tuent encore actuellement des examens de base per- mettant d'apprécier les caractéristiques du sperme.

Recueil du sperme

Il est préférable que le recueil s'effectue au laboratoire, ceci pour éviter au maximum l'influence de facteurs extérieurs pouvant perturber certains paramètres sperma- tiques. Par exemple une température trop basse pendant le transport peut entraîner une chute de la mobilité. L'éjaculat est obtenu par masturbation et émis dans un récipient ayant une ouverture suffisamment large pour éviter les pertes au moment du recueil. Lorsqu'une spermoculture est prévue, des précautions particulières doivent être prises pour éviter toute contamination. Le patient doit d'abord uriner, se laver les mains et la verge avant le recueil qui doit être fait dans un flacon stérile. Un examen cytobactériologique urinaire (ECBU) sur le premier jet d'urine, avant recueil du sperme, est recommandé. Un délai d'abstinence sexuelle de 3 à 5 jours avant l'examen est conseillé. Si cette durée n'est pas respec- tée, il est important de connaître le délai exact pour interpréter les résultats puisqu'il s'agit d'un facteur de variation important, notamment en ce qui concerne le volume et le nombre de spermatozoïdes [4] (Figure 3).

Les paramètres du sperme

Immédiatement après éjaculation, le sperme est déposé dans une étuve à 37° C pour assurer sa liquéfaction Figure 1.Section longitudinale d'un spermatozoïde normal en microscopie électronique (x 5000). (environ 30 min). Au terme de celle-ci, l'examen est réalisé. Un aspect anormal, tel que hémospermie, vis- cosité forte doit être noté. pH Le pH du sperme est normalement compris entre 7,4 et

8,0. Des valeurs trop faibles peuvent être le reflet d'un

défaut de sécrétion des vésicules séminales (normale- ment alcalines) alors qu'un pH nettement alcalin peut révéler une insuffisance des sécrétions prostatiques (normalement légèrement acides).

Volume

Il traduit essentiellement les capacités sécrétoires desglandes annexes. Une hyperspermie (volume > 6 ml)

est généralement le témoin d'une hypersécrétion des vésicules séminales qui normalement forment l'essen- tiel du volume de l'éjaculat et ne doit pas être considé- rée comme pathologique. Par contre, lorsqu'il n'existe pas de problème lié au recueil (perte d'une fraction de l'éjaculat), l'hypospermie (volume < 2 ml) peut s'ex- pliquer soit par un trouble de l'éjaculation, soit par une insuffisance sécrétoire de l'une des glandes annexes pouvant être liée à une infection (prostatite, vésiculite) ou à l'absence même de vésicules séminales. Nombre de spermatozoidesIl est exprimé en concentration (millions/ml). Si aucun spermatozoïde n'est observé par la technique classique, il est nécessaire de rechercher les spermatozoïdes dans le culot de centrifugation du sperme, avant de conclure ou non à une azoospermie.

Mobilité

La mobilité appréciée au microscope optique est expri- mée en pourcentage de spermatozoïdes mobiles. Une évaluation qualitative est réalisée de façon subjective en différenciant les spermatozoïdes se déplaçant sui- vant une trajectoire sensiblement linéaire de ceux mobiles sur place ou ne progressant que très faible- ment. L'examen est réalisé dans l'heure qui suit la liquéfaction avec un suivi à 4 heures. Des systèmes d'analyse vidéomicrographique assistée par ordinateur (système CASA) permettent une mesure automatique objective. Ces appareils ont connu un essor important ces dernières années. Leur principe est basé sur l'étude des trajectoires de la tête du gamète qui sont un bon reflet de l'activité flagellaire. Après acqui- sition (enregistrement avec une fréquence de l'ordre de

40 hertz) et mémorisation des images des têtes sperma-

tiques, les données sont analysées par un logiciel spéci- fique à chaque système. L'étude d'une trajectoire peut se faire de façon précise à partir de 30 points. Une centaine de trajectoires peuvent être analysées en quelques minutes.Les paramètres couramment retenus pour l'évaluation du mouvement sont la vitesse curvilinéaire (VCL), la vitesse linéaire (VSL), l'index de linéarité (LIN), l'am- plitude du débattement latéral de la tête (ALH) et la fréquence de rotation de la tête (BCF) [5, 6]. Il existe une hétérogénéité importante des mouvements flagel- laires; 4 classes principales de trajectoires peuvent être répertoriées (Figure 4). Ces systèmes ne doivent pas a priori remplacer le sper- mogramme classique mais ils permettent de mettre en évidence certaines anomalies du mouvement non déce- lables par l'observation simple.

Vitalité

Elle reflète le pourcentage de spermatozoïdes vivants, elle trouve son intérêt dans les cas où la mobilité est faible.

Cellules rondes

Les cellules épithéliales de l'urètre, les cellules germi- nales immatures et les leucocytes sont regroupés sous ce terme de "cellules rondes». Dans les cas où ce nombre est élevé, les polynucléaires, témoins d'un foyer infectieux, doivent être précisément recherchés en utilisant des colorations spécifiques basées le plus souvent sur la révélation histochimique de la peroxy- dase [7].

Le spermocytogramme

Il consiste à rechercher les atypies morphologiques des spermatozoïdes en microscopie optique. La plupart des laboratoires utilisent la classification de DAVID[8]. Elle distingue les anomalies de la tête, de la pièce inter- médiaire et du flagelle et permet aussi de mettre en évi- dence les associations d'atypies au niveau d'une même cellule. Le nombre moyen d'anomalies par spermato- zoïde peut être évalué en calculant l'index d'anomalies multiples (IAM). La valeur prédictive de ce paramètre

a été démontrée; au-dessus d'une valeur seuil de 1,6,les chances de survenue d'une grossesse dans les trois

ans sont réduites [9]. Une étude ultrastructurale de la cellule spermatique peut être envisagée : • dans les cas d'infertilité de longue durée, d'échecs de 498
Tableau 1. Valeurs de référence définies par l'OMS.

ParamètresNormesParamètresNormes

Volume³ 2 mlmorphologie normale³ 30%

Nombre³ 20 x 106/ml

spermatozoïdesou ³ 40 x 106/éjaculat vitalité³ 75‰

Mobilité³ 50% et au moins

25% de mobiliténombre de leucocytes< 1 x 106

499
Figure 2. Séquence des évènements précoces de la fécondation.

Membrane pellucide

Espace

périvitellin

Fusion des membranes

cytoplasmiques

Décondensation

nucléaire

Destruction du flagelle

Réaction corticale se produisant

au moment de la fusion des membranes cytoplasmiques

PRONOYAU MALE

Liaison du spermatozoïde

intact à la membrane pellucide

Spermatozoïde ayant subi

la réaction acrosomique et pénétrant dans la membrane pellucide fécondation in vitro pour lesquels le diagnostic d'infer- tilité masculine n'a pas été établi de manière évidente par les spermogrammes classiques, • dans les cas d'asthénozoospermies sévères ou d'ano- malies sévères du mouvement. Toutefois, cet examen en microscopie électronique est très spécialisé, l'interprétation en est souvent difficile et la technologie relativement lourde et coûteuse; aussi il doit être limité.

Interprétation

Compte tenu des variations intra et inter-individuelles très importantes, il est difficile d'établir des normes. Les valeurs de référence définies par l'OMS sont rap- portées dans le Tableau 1 [10].

3is en dehors de l'azoospermie confirmée au moins sur

trois prélèvements, il n'est pas possible de conclure de façon définitive quant à la fertilité ou la stérilité d'un patient.

Examens complémentaires

Recherche des anticorps anti-spermatozoïdes

Des anticorps dirigés contre le spermatozoïde peuvent être présents dans le sang périphérique et/ou dans le tractus génital. Dans le sperme, ils peuvent se trouver à l'état libre dans le liquide séminal et/ou liés aux anti- gènes de surface sur les spermatozoïdes. La présence de tels anticorps peut être suspectée chez les patients pour lesquel, il existe une notion de lésion de la paroi des voies génitales dans les antécédents, devant une agglutination spontanée des spermatozoïdes dans l'éjaculat ou dans les cas de non pénétration des spermatozoïdes dans la glaire cervicale. Les deux méthodes les plus couramment employées pour le dépistage des anticorps fixés sur les spermatozoïdes utilisent soit la technique des immunobilles (billes de polyacrylamide couplées à des anticorps anti-IgA ou anti-IgG) soit un test d'agglutination mixte anti-globuli- ne (Martest). Ces méthodes sont spécifiques, sensibles et permettent de préciser la classe des anticorps [11]. Si

40% des spermatozoïdes mobiles ou davantage sont por-

teurs d'anticorps, l'infertilité immunologique est pro- bable; entre 10 et 40%, elle peut être suspectée. La pré- sence d'anticorps de type IgA serait de plus mauvais pro- nostic que celle de la catégorie IgG [12]. La recherche d'anticorps dans le sérum et le liquide

séminal doit être envisagée lorsque la recherche direc-te sur les spermatozoïdes n'est pas possible faute d'un

nombre suffisant de spermatozoïdes mobiles.

Spermoculture

Si une recherche complète de germes (germes aérobies,mycoplasmes, exceptionnellement germes anaérobies,

clamydiae, gonocoque...) est envisagée, celle-ci se fera au laboratoire de bactériologie puisque le laboratoire de spermiologie, habituellement ne réalise pas ces exa- mens. Selon les auteurs, le seuil de positivité est variable, une spermoculture peut être considérée comme positive pour une concentration comprise entre 500
Figure 4. Les différents types de trajectoires des spermato- zoïdes (Analyse avec Speed-sperm ATS 40, J.C.Diffusion

France).

VCL : vitesse curvilinéaire, VSL : vitesse linéaire, ALH : amplitude du débattement latéral de la tête. - classe 1 : spermatozoïde progressif ondulant. - classe 2 : spermatozoïde hyperactivé (VCL/VSL augmenté). - classe 3 : spermatozoïde bloqué, présentant des arrêts fré- quents (VCL, VSL diminuées, VCL/VSL normal). Figure 3. Influence de la durée d'abstinence sexuelle sur le volume (v) et le nombre total de spermatozoïdes dans l'éjacu- lat (N).D'après Schwartz et al. (4).

103et 104germes commensaux par ml [13, 14] et/ou en

présence de germes pathogènes spécifiques quelle que soit leur concentration.

Biochimie du liquide séminal

Des marqueurs biochimiques spécifiques peuvent être dosés dans le liquide séminal pour apprécier la contri- bution des différentes glandes dans la formation de l'éjaculat. Les plus couramment mesurés sont l'alpha

glucosidase et la L-carnitine pour l'épididyme, l'acidecitrique, les phosphatases acides ou le zinc pour la

prostate et le fructose pour les vésicules séminales [15].

La mesure de ces marqueurs apporte des renseigne-

ments importants dans les azoospermies puisqu'elle permet dans certains cas d'en préciser l'origine (sécré- toire ou excrétoire) et éventuellement de localiser le niveau de l'occlusion. C'est ainsi que la réduction des taux d'alpha glucosidase ou de carnitine traduit une occlusion au niveau de l'épididyme. Une chute des taux des marqueurs épididymaires avec absence de fructose le plus souvent associée à de fortes concentrations de marqueurs prostatiques est caractéristique d'une agéné- sie épididymo-déférentielle. En dehors des azoospermies, ces marqueurs spécifiques permettent aussi d'apprécier l'activité fonctionnelle des différentes glandes et peuvent participer au diagnostic d'un processus inflammatoire [16, 17].

Interaction glaire-sperme

Le comportement des spermatozoïdes dans la glaire cervicale peut être apprécié soit in vivo par le test post- coïtal (TPC) ou test de Huhner, soit in vitro par le test de pénétration croisé [18, 19].

Le test de Huhner

C'est un examen qui devrait être prescrit d'emblée dansl'exploration de l'infécondité du couple. I1 permet de

s'assurer qu'il n'y a pas de dysfonctionnement sexuel et d'évaluer la qualité de pénétration des spermato- zoïdes dans la glaire. C'est un test simple mais dont les conditions de réali- sation doivent être rigoureuses. I1 doit être réalisé en période préovulatoire, si nécessaire après optimalisa- tion de la glaire par les oestrogènes, 10 à 12h après un rapport sexuel.

L'interprétation reste très subjective, elle prend encompte un nombre moyen des spermatozoïdes mobiles

par champ et la qualité de leur mouvement. Quels que soit les résultats, ce test ne dispense pas d'un spermo- gramme.

Tests de pénétration in vitro

Il consiste à mettre en contact dans des tubes capillaires les spermatozoïdes avec la glaire cervicale prélevée en période préovulatoire. Ce test peut être complété par

des tests croisés; pour cela, le sperme du patient et laglaire de la patiente sont testés entre eux mais aussi

avec des spermes et des glaires témoins.

L'interprétation du test tient compte de la pénétrationdes spermatozoides, de leur mobilité après 1h et 4h de

contact et de leur orientation dans la glaire. Si le test est de mauvaise qualité (pénétration très faible ou absente, immobilisation des spermatozoïdes dans la glaire), la part relative des facteurs masculins et féminins pourra être évaluée en prenant en compte les résultats obtenus avec le sperme et la glaire témoins. Appréciation du pouvoir fécondant des spermato- zoïdes Une meilleure approche du pouvoir fécondant des sper- matozoïdes peut être faite en utilisant des tests fonc- tionnels plus spécifiques.

Evaluation du statut acrosomique

Outre la microscopie électronique difficile à utiliser en routine, plusieurs techniques ont été décrites pour apprécier le statut acrosomique. En dehors de la triple coloration de Talbot, difficile d'interprétation, plu- sieurs tests utilisant des marqueurs fluorescents diffé- rents (lectines, anticorps poly ou monoclonaux dirigés contre divers déterminants de l'acrosome) se sont développés ces dernières années (Figure 5) [20, 21]. Normalement le taux de réaction acrosomique (RA) spontanée au moment de l'éjaculation est faible (<10%). A cette mesure statique, on peut associer une exploration dynamique permettant d'apprécier la popu- lation de spermatozoïdes susceptibles d'effectuer leur RA en présence de divers inducteurs physiologiques ou non (ionophores calciques). Selon la technique utilisée la population inductible représentée par la différence entre le taux de RA induite et le taux de RA spontanée varie de 10% à 40%. I1 existe une variabilité impor- 501
Figure 5. Marquage des spermatozoïdes en immunofluores- cence en utilisant un anticorps spécifique dirigé contre un antigène de la membrane interne de l'acrosome [21].Les sper- matozoïdes fluorescents ont effectué leur réaction acroso- mique. tante dans la réalisation et l'interprétation de ces tests; cependant un pourcentage de RA spontanée trop élevé ou un faible taux de RA inductible est de mauvais pro- nostic pour l'activité fécondante du sperme. Investigation de la fonction fusiogène du spermatozoïde Les spermatozoïdes humains capacités peuvent se lier et pénétrer des ovocytes dépellucidés de hamster puis décondenser leur noyau pour former des pronoyaux mâles.Cette propriété a été utilisée pour développer un test fonctionnel (hamster-test) permettant d'appréhender le pouvoir fécondant du spermatozoïde (capacité à effec- tuer sa RA, à fusionner avec l'ovocyte et à décondenser sa chromatine). La réalisation de ce test est lourde (nécessité d'un nombre minimum de 40 ovocytes, d'un sperme témoin comme étalon interne, de capaciter les spermes dans des conditions standardisées) et elle demande une grande expérience.quotesdbs_dbs33.pdfusesText_39

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