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L"Institut des Sciences et Industries du Vivant et de l"Environnement (Agro Paris Tech) est un Grand Etablissement dépendant du

Ministère de l"Agriculture et de la Pêche, composé de l"INA PG, de l"ENGREF et de l"ENSIA (décret n° 2006-1592 du 13 décembre 2006) i

N° /__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/

THÈSE

pour obtenir le grade de

Docteur

de l"Institut des Sciences et Industries du Vivant et de l"Environnement (Agro Paris Tech)

Spécialité : Sciences de l"aliment

présentée et soutenue publiquement par

Sophie CHERIOT

le 11 décembre 2007

ROLE DES PRODUITS DE LA REACTION DE MAILLARD DANS

L"INHIBITION DE L"OXYDATION ENZYMATIQUE

DES PHENOLS ET DES LIPIDES

Directeur de thèse : Jacques NICOLAS

Travail réalisé au Cnam, UMR 1211, Chaire de Biochimie Industrielle et Agro-alimentaire, F-75141 Paris

Devant le jury :

M. Pierre GIAMPAOLI, Professeur, ENSIA Président Mme Claude GENOT, Directrice de recherches, INRA Rapporteur M. Michel GIRARDIN, Professeur, INPL - ENSAIA Rapporteur M. Philippe MORAS, Ingénieur, CTIFL Examinateur M. Jacque NICOLAS, Professeur, Cnam Examinateur

Mme Catherine BILLAUD, Ingénieur de recherches

, Cnam Invitée i

TABLE DES MATIERES

Remerciements (et excuses)................................................................................................................v

Abstract .............................................................................................................................................viii

Liste des figures...................................................................................................................................ix

Liste des tableaux...............................................................................................................................xv

Liste des équations.......................................................................................................................... xviii

Liste des publications et communications..........................................................................................xix

Participations à des congrès.........................................................................................................xix

Liste des abréviations........................................................................................................................xxi

Introduction.............................................................................................................................................. 1

Travaux antérieurs................................................................................................................................... 4

1. La réaction de Maillard................................................................................................................4

1.1. Découverte et redécouverte de la réaction de Maillard......................................................5

1.2. Chimie de la réaction de Maillard.......................................................................................6

1.3. Les produits de chauffage du glucose seul et de la cystéine seule..................................17

1.4. Formation d"arômes par la réaction de Maillard...............................................................20

1.5. Propriétés anti-oxydantes des produits de la réaction de Maillard (PRM)........................22

1.6. Effets immunologiques et toxicologiques des produits de la réaction de Maillard (PRM).29

2. Le brunissement enzymatique des fruits et légumes................................................................33

2.1. Aspects économiques du brunissement enzymatique......................................................33

ii

2.2. Rôle physiologique des polyphénoloxydases (PPO)........................................................34

2.3. Caractéristiques réactionnelles et structurales des polyphénoloxydases.........................35

2.4. Prévention du brunissement enzymatique .......................................................................43

3. L"oxydation enzymatique des lipides.........................................................................................53

3.1. Les étapes de l"oxydation aérobie des lipides catalysée par la lipoxygénase (LOX)........54

3.2. Le site actif et la spécificité d"oxydation de la LOX...........................................................55

3.3. La spécificité de substrat de la LOX et les réactions enzymatiques catalysées...............59

3.4. Rôles physiologiques de l"oxydation lipidique catalysée par la LOX dans les végétaux...59

3.5. Effets de l"oxydation enzymatique des lipides dans les aliments......................................61

3.6. Prévention de l"oxydation enzymatique des lipides dans les aliments..............................64

Objectifs de l"étude ................................................................................................................................ 66

Matériels et méthodes............................................................................................................................ 68

1. Matériel biologique....................................................................................................................68

2. Produits chimiques et préparation des produits inhibiteurs.......................................................69

2.1. Introduction à la méthodologie des plans d"expériences..................................................69

2.2. Formation des produits inhibiteurs de l"activité PPO........................................................70

2.3. Préparation des produits dont l"activité mutagène a été testée par le test d"Ames...........74

2.4. Optimisation de la préparation des PRM inhibiteurs de l"activité LOX..............................75

3. Caracterisation des systèmes enzymatiques............................................................................78

3.1. Mesure des activités enzymatiques..................................................................................78

3.2. Dosage des protéines ......................................................................................................81

3.3. Détermination des masses moléculaires..........................................................................81

3.4. L"électrophorèse...............................................................................................................83

4. Méthodes d"extraction et de purification des enzymes..............................................................84

4.1. Extraction et purification de la PPO d"aubergine et de pomme........................................84

4.2. Extraction et purification de la PPO de pomme de terre...................................................84

4.3. Extraction et purification de la lipoxygénase de farine de fève.........................................86

5. Caracterisation des composés inhibiteurs.................................................................................88

iii

5.1. Dosage des thiols par la méthode d"Ellman.....................................................................88

5.2. Détermination des propriétés spectrales d"échantillons inhibiteurs..................................89

5.3. Méthodes chromatographiques appliquées aux composés inhibiteurs ............................90

6. Méthodes de mesure du pouvoir antioxydant ...........................................................................97

6.1. Mesure du pouvoir réducteur et antiradicalaire par le test DPPH° ...................................97

6.2. Mesure du pouvoir antiradicalaire par le test AAPH°.......................................................98

6.3. Mesure du pouvoir chélateur du cuivre en utilisant le tétraméthylmurexide (TMM)........ 100

7. Le test d"Ames pour mesurer l"activité mutagéne et antioxydante des PRM........................... 103

7.1. Les souches bactériennes utilisées................................................................................ 103

7.2. Mesure de la mutagénicité des PRM.............................................................................. 105

8. Mesure de la couleur et application des PRM pour inhiber le brunissement enzymatique...... 109

Résultats et discussion........................................................................................................................ 110

1. Caractérisation des systèmes enzymatiques.......................................................................... 110

1.1. La PPO de pomme de terre ........................................................................................... 110

1.2. La LOX de farine de fève ............................................................................................... 121

2. Action des PRM et du mélange sur l"activité PPO et le brunissement enzymatique............... 125

2.1. Mesure du pouvoir inhibiteur, dosage des réactants résiduels et du HMF dans les PRM

125

2.2. Etude des composés inhibiteurs dans des mélanges composé carbonylé / cystéine

chauffée : formation, stabilité, fractionnement et analyses des produits néoformés....................131

2.3. Cinétique d"inhibition des PPO par des mélanges HMF ou furfural / cystéine chauffée -

comparaison avec les PRM......................................................................................................... 163

2.4. Propriétés antioxydantes du mélange cystéine chauffée / HMF et des PRM inhibiteurs de

l"activité PPO............................................................................................................................... 169

2.5. Propriétés mutagènes du mélange cystéine chauffée / HMF et du PRM comparées à

celles des réactifs........................................................................................................................ 173

2.6. Mise en oeuvre des PRM et des mélanges pour inhiber le brunissement enzymatique. 180

3. Action des PRM sur l"oxydation enzymatique des lipides ....................................................... 187

3.1. Optimisation de l"inhibition de l"oxydation enzymatique des lipides................................ 187

iv

3.2. Effet direct et cinétique d"inhibition de l"activité LOX de farine de fève par les PRMopt2. 201

3.3. Mode d"inhibition de l"activité LOX par les PRM

opt2........................................................ 204

3.4. Stabilité du PRM au cours du stockage dans différentes conditions.............................. 207

Conclusions générales et perspectives................................................................................................ 209

ANNEXES............................................................................................................................................ 215

Annexe 1 : Liste des produits chimiques utilisés.............................................................................. 215

Annexe 2 : Résultats du plan d"expériences à 4 facteurs et 5 niveaux pour l"optimisation de l"inhibition

de la LOX de fève par les PRM issus de lysine (chapitre 3 - § 3.1.2.)............................................ 219

Annexe 3 : Résultats du plan d"expériences à 2 facteurs et 5 niveaux pour l"optimisation du traitement

thermique des PRM glucose (0,08 M) - lysine (0,08 M) pH ≈10, en vue de l"inhibition de la LOX de

fève (Chapitre 3 § 3.1.3.)................................................................................................................. 220

Bibliographie........................................................................................................................................ 221

Résumés des publications................................................................................................................... 241

v

Remerciements (et excuses)

C"est une habitude que de remercier au début d"un tel travail tous ceux qui, plus ou moins directement, ont contribué à le rendre possible ET agréable. Même si dans mon cas, cette liste peut sembler longue, c"est avec mon enthousiasme le plus vif et le plus

sincère que je voudrais rendre mérite à tous ceux qui à leur manière m"ont aidé à mener

à bien cette thèse. Je désire alors exprimer ma profonde gratitude : - Au Professeur Jacques NICOLAS pour avoir accepté d"encadrer ce travail depuis le DEA, de m"avoir dirigée patiemment et pour son soutien pendant la rédaction de cette thèse, - Au Professeur Pierre GIAMPAOLI qui m"a honoré en acceptant d"être Président de ce jury, mais également pour tous ses conseils toujours pertinents et ses encouragements. - A Mme Claude GENOT et M. Michel GIRARDIN pour avoir accepté d"évaluer mon travail et d"être rapporteurs de ma thèse. - A M. Philippe MORAS pour avoir accepté d"être examinateur dans ce jury... et pour m"avoir orienté vers la polyphénoloxydase d"aubergine... Je voudrais également exprimer toute ma gratitude envers le Dr. Catherine BILLAUD pour ses conseils particulièrement précieux, sa disponibilité mais surtout pour sa rigueur scientifique qui m"a permis de faire progresser rapidement ce travail et qui, je l"espère a quelque peu déteint sur ma personnalité. Ce fut un plaisir de travailler avec toi ! J"ai eu la chance au cours de ma thèse de pouvoir participer à une mission scientifique de trois mois financée par le COST Action 927. Je remercie vivement le Pr. Karl-Heinz ich an Herrn Prof. Dr. Karl-Heinz WAGNER richten, der mir im Laufe meinder J"adresse mes chaleureux remerciements aux personnes du département de Sciences de l"Aliment et plus particulièrement à l"équipe CSNAAC, à Mmes Marie-Noëlle MAILLARD et Barbara REGA, à M. Pierre GIAMPAOLI et Mlles Muriel MAIRE et Claire ORDONNAUD qui ont conjugué gentillesse et aide apportée à mon travail lors des expériences de mesure de pouvoir antioxydant et des analyses en chromatographie gazeuse. Merci pour vos encouragements et votre sympathie.

Merci à Mlle Céline NIQUET et M. Frédéric TESSIER pour m"avoir initiée à la

chromatographie liquide couplée au spectromètre de masse et pour leur aide en chimie vi organique, ... mais c"est aussi pour leur soutien et leur amitié que je souhaite les remercier. Merci à M. Jean-Paul MONIN du laboratoire de génie analytique du Cnam, pour sa disponibilité et son aide précieuse dans la réalisation et l"analyse des spectres en infra- rouge. Je ne saurais oublier les stagiaires : Stephan, Céline, Anna, Magali, Aline, Claire, Omar, Sofiane, Julie, Sophie, Olivier, Fanny, Jean-Pierre, Massoud, Virginie, Greg, Stéphane, Valérie, Molobaly, Jennifer, Elodie, Thomas, Julie, Alexandra, Lydia, Faten, Véronique et Véronique. Merci pour votre soutien et les chaleureux moments partagés ... (pardon à celles ou ceux que j"oublie de citer ici...) Je dois et j"adresse un remerciement tout particulier, avec toute mon affection et ma reconnaissance, à TOUS mes collègues de la chaire de biochimie industrielle et agro-

alimentaire : (dans le désordre ...) Rebeca, Stéphane, Loïc et l"autre Loïc, Gabrielle,

Sylvie, Lala, Frédérique, Marie-Line, Michèle, Aline, Ysilda, Simon, Potus, Laure,

Christelle, Yin-Nai, Jérôme et Elise. Merci pour tous les agréables moments passés

ensemble au travail et en dehors. A l"accueil chaleureux que vous m"avez fait lors de mon arrivée en DEA et au soutien que vous m"avez apporté tout au long de ma thèse, dans les " hauts » mais surtout dans les " bas ».

Je vous exprime toute mon amitié.

Par ailleurs, ayant travaillé sur des composés soufrés, dont la puanteur n"a d"égal que la

ténacité, je tiens à présenter mes excuses les plus sincères en raisons des gênes

olfactives occasionnées par certains composés (furfurylthiol et sulfure d"ammonium principalement) auprès de toutes les personnes (en particulier Loïc LOUARME), qui ont eu la (mal ?)chance de partager paillasses et laboratoires.... Un dernier mot pour ma famille et pour David, pour leur patience et leur soutien, pour leur compréhension (surtout vers la fin), pour m"avoir supporté, et avoir supporté mes absences à répétition au cours de ces quatre années !!! vii

RESUME

La recherche de substituts aux antioxydants alimentaires synthétiques (sulfites, BHA : di-tertio-

butylhydroxyanisol et BHT : di-tertio-butyl-hydroxytoluène) utilisés contre l"oxydation des phénols et des

lipides est actuellement très active en raison des effets allergènes et toxiques de ces additifs.

Il a été montré que les produits de la réaction de Maillard (PRM) formés lors du chauffage de la cystéine

et du glucose en milieu acide, sont de très puissants inhibiteurs du brunissement enzymatique des fruits

et légumes du à l"oxydation des phénols catalysée par les polyphénoloxydases (PPO) en présence

d"oxygène. Afin de pouvoir caractériser les composés inhibiteurs des PRM, ces systèmes modèles ont

été simplifiés en un mélange de composés néoformés à partir de la réaction entre le HMF et la cystéine

chauffée ou le sulfure d"ammonium. Ce mélange s"est révélé être environ trois fois plus efficace que les

PRM pour inactiver la PPO de différentes origines végétales. La réaction de formation des composés

inhibiteurs a été étudiée et une comparaison des pouvoirs antioxydants (tests AAPH° et DPPH°) et

chélateurs du cuivre (test TMM) a été réalisée. Aux concentrations suffisantes pour prévenir le

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