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25 oct 2012 · B Optimisation de la fraction des clones codants dans la banque de restriction, ont valu le prix Nobel de Médecine et de Physiologie à aléatoires dans un fragment d'ADN bien défini (Mohan and Banerjee, 2008) plus utilisés sont NNN, NNB, NNK ou NNS (où N = A/C/G/T, B = C/G/T, K = G/T et S =

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2 2 2 Clonage des fragments 1, 2 et 3 de l'enhancin de ChfuGV La famille Baculoviridae comprend des virus à ADN double brin, circulaire et La carte génomique du vecteur pCR®2 1 présente le promoteur Plac, la amorces comprennent les sites de restriction Ndei (EXPF) et Smai (EXPR) en vue du

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13 jui 2007 · ADN : Acide désoxyribonucléique Le point de départ est un gène cloné dans un plasmide parallèle d'une mutation silencieuse, générant un site de restriction onze mutants sont obtenus par des amorces dégénérées (nns) μl de fragment PCR + 1 μl d'amorce Sav EcoF ou Sav BamR à 10 μM) à 

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Le gène de la streptavidine a été cloné et séquencé en 1986 Le matériel d' électrophorèse d'ADN et de protéine provient de Bio-Rad (Reinach, 5 µL de fragment purifié sont digérés par l'enzyme de restriction dont le site est apporté Pour une raison inexpliquée, un pigment vert provenant d'une purification d'un 

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Les vaccins recombinants vectorisés par des virus ADN 44 II 1 Amplification et clonage des gènes G2/G1 du virus de la FVR 1 2 4 élargie du fragment au site de l'enzyme de restriction HindIII (Flint et al , 2003) 55 Carte du monde représentant la position de la Tunisie dans le bassin méditerranéen, b Carte de  

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elles ont été utilisées pour établir la première carte de liaison du génome de la souris et ont été fonction de la taille des fragments d'ADN étudiés) contenant du Bromure d'Etidium (Bet 0,5 µg/mL) (B) Carte de restriction du gène Agouti Près d'un tiers de ces gènes ont été clonés et ne codent pas seulement

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Université de Montpellier II, Sciences et Techniques du Languedoc Université El Manar, Faculté des Sciences, Tunis THESE

Pour obtenir le grade de

Docteur de l'UniǀersitĠ de Montpellier II et de l'UniǀersitĠ El Manar, Tunis

Discipline : Virologie

Ecole doctorale : Sciences chimiques et biologiques pour la santé

Présentée et soutenue publiquement par

Saïda Emna AYARI-FAKHFAKH

des trois infections virales majeures des ruminants, la variole, la PPR et la FVR, adaptés à la situation épidémiologique des pays du Maghreb.

Le 20 Mai 2011

Composition du JURY

Pr M. BERGOIN

Pr M. MAKNI

Dr E. ALBINA

Dr A. DIALLO

Pr J. GHARBI

Dr A. GHRAM

Dr C. CETRE-SOSSAH

UMR 1231, Université de Montpellier II, France Faculté des Sciences de Tunis, Université El Manar, Tunisie

CIRAD, UMR CMAEE, Montpellier, France

Unité FAO/IAEA, Seibersdorf, Autriche

Institut Supérieur de Biotechnologie de Monastir, Tunisie

Institut Pasteur, Tunis, Tunisie

CIRAD, UMR CMAEE, Montpellier, France

Président

Co-Directeur de thèse

Co-Directeur de thèse

Rapporteur

Rapporteur

Examinateur

Examinateur

Université de Montpellier II, Sciences et Techniques du Languedoc Université El Manar, Faculté des Sciences, Tunis THESE

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Saïda Emna AYARI-FAKHFAKH

des trois infections virales majeures des ruminants, la variole, la PPR et la FVR, adaptés à la situation épidémiologique des pays du Maghreb.

Le 20 Mai 2011

Composition du JURY

Pr M. BERGOIN

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UMR 1231, Université de Montpellier II

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Co-Directeur de thèse

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Rapporteur

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Examinateur

Examinateur

1

Table des matières

Remerciements 7

Liste des abréviations 11

Liste des figures et Liste des tableaux 13

Introduction générale à la vaccinologie 22

Partie I : Synthèse bibliographique 26

Chapitre 1 : Introduction générale à la vaccinologie 27 I. Bases moléculaires et cellulaires de la réponse vaccinale 28 II. Les différents types de vaccins et leurs limites 32 II.1. Les vaccins vivants atténués 33

II.2. Les vaccins inertes 35

Chapitre 2 : Les vaccins vectorisés utilisés en vaccinologie 39 I. Les vaccins recombinants vectorisés par des virus ARN 40 I.1. Les Influenza virus en tant que vecteurs 40 I.2. Les Rubella virus en tant que vecteurs 42 I.3. Le virus de la rougeole en tant que vecteur 43 44
II. Les vaccins recombinants vectorisés par des virus ADN 44

II.1. Les adénovirus 44

II.2. Les poxvirus 47

2

III. Les capripoxvirus 52

III.1. Classification 52

III.2. Distribution géographique des capripoxviroses 53 III.3. Etiologie (Structure, Cycle viral) 55

III.3.1. Structure

III.3.2. Cycle viral

III.4. Interaction hôte-virus 61

a. Tropisme cellulaire 62 b. Réponse immunitaire induite par les capripoxvirus 65 III.5. Pouvoir pathogène et manifestation clinique 66

III.6 66

III.7. Traitement et Prophylaxie 67

III.8. Exemple particulier du vecteur capripoxvirus KS1 68 IV- La Fièvre de la Vallée du Rift 69

IV.1. Historique de la FVR 69

IV.2. Classification 70

IV.3. Epidémiologie et répartition géographique 70 IV.4. Etiologie du virus de la fièvre de la vallée du Rift 72

IV.4.1. Structure du virus

IV.4.2. Cycle viral

IV.5. Réaction immunitaire et physiopathologie 79 IV.6. Pouvoir pathogène et manifestations cliniques 82

IV.6.1.

IV.6.2.

86
3

IV.7. Traitement et prophylaxie 88

IV.8. Contrôle de la maladie 90

V. La Peste des Petits Ruminants 92

V.1 Historique de la PPR 92

V.2 Classification et répartition géographique 93

V.3. Etiologie du virus de la PPR 94

V.3.1 Structure du virus

V.3.2. Cycle viral

V.4. Physiopathologie 97

V.4.1 Interactions virus et cellules

V.4.2 Eléments de pathogénie

V.5. Pouvoir pathogène et manifestations cliniques 99 de la PPR 101

V.7. Traitement et prophylaxie 102

Cadre et Objectifs 104

Partie II : Enquête séroépidémiologique PPR et FVR en Tunisie 107

1. Matériel et Méthodes 108

2. Résultats 111

4

Partie III : Développement de vaccins capripoxvirus recombinants exprimant différents gènes du

virus de la FVR et de la PPR in vivo Chapitre 1 - Elaboration et validation des constructions plasmidiques in vitro 113

1. Matériel et méthodes 116

1.1. Virus et cellules

1.2. Construction des plasmides de transfert 117

1.2.1. Le plasmide de transfert pKSCATpSGPT

1.2.2. Amplification et clonage du gène H du virus de la PPR

1.2.3.Amplification et clonage des gènes G2/G1 du virus de la FVR

1.2.4. Clonage du marqueur de sélection la généticine GNT ou G418

1.3. Elaboration des capripoxvirus recombinants FVR 122

in vitro des capripoxvirus recombinants FVR

1.3.2. Transfection, purification et production des capripoxvirus recombinants FVR

1.3.3. Vérification de la présence des gènes insérés, par PCR

1.3.4. Vérificatio

1.4. Production et titrage des capripoxvirus recombinants 135

2. Résultats

2.1. Vérification des constructions plasmidiques 136

141

2.2.1. Expression in vitro

2.2.2. Obtention des capripoxvirus recombinants FVR

2.2.2.1. Analyse par immunofluorescence

2.2.2.2. Evaluation par PCR de la pureté

2.3. Purification des capripoxvirus recombinants 146

2.3.1. Exemple du simple recombinant capripoxvirus FVR élaboré à partir du

pKSCATPSgpt-NSmG2 et du KS1

2.3.2. Exemple du bouble recombinant le capripoxvirus FVR-PPR obtenu à partir du

pKSCATPSGPT-NSmG2FVR-HPPR 5

Chapitre 2 -

in vivo avec la construction capripoxvirus simple recombinant FVR

1. Modèle souris MBT/Pas : Immunisations avec la construction vaccinale simple recombinant

NSmGN 151

1.1. Matériel et méthodes 153

153

1.1.2. Méthodes 156

1.1.2.1. Evaluation de la réponse immunitaire de type humorale 156

A - -FVR par neutralisation virale

B- -capripoxvirus par immunofluorescence

1.1.2.2. Evaluation de la réponse immunitaire de type cellulaire 157

1.1.2.3. Evaluation de la protection 161

1.2. Résultats 162

1.2.1. Evaluation de la réponse humorale 162

1.2.1.1. Détection des anticorps anti-capripoxvirus par immunofluorescence

1.2.1.2. Détection des anticorps anti-FVR par SNT

1.2.2. Evaluation de la réponse cellulaire 164

1.2.2.1. Etude de la lymphoprolifération

1.2.2.1.Evaluation des réponses cytokines

1.2.3.Evaluation de la protection 166

1.3. Conclusion 168

6

2/ Modèle caprin

recombinant NSmGN du virus FVR 170

1.1. Matériel et méthodes 170

171

1.1.2. Méthodes 172

1.1.2.1. Evaluation de la réponse immunitaire de type humorale 172

A- Recherche d'anticorps anti-capripoxvirus par immunofluorescence B - Recherche d'anticorps anti-FVR par neutralisation virale C - Recherche d'anticorps anti-HPPR par ELISA de compétition et neutralisation virale

1.1.2.2. Evaluation de la réponse immunitaire de type cellulaire 173

1.2. Résultats 177

1.2.1. Evaluation de la réponse humorale 177

1.2.1.1.Détection des anticorps anti-capripoxvirus par immunofluorescence

1.2.1.2. Détection des anticorps anti- PPR par ELISA de compétition et SNT

1.2.1.3.- Détection des anticorps anti-RVF par SNT

1.2.2. Evaluation de la réponse cellulaire par étude de la lymphoprolifération 180

1.2.2.1. Etude de la lymphoprolifération

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