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Numéro National de Thèse : 2015SACLS241 THESE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE PARIS-SACLAY PREPAREE A L
'UNIVERSITE PARIS-SUD ECOLE DOCTORALE N°577 Structure et Dynamique des Systèmes Vivants Spécialité de doctorat : Sciences de la Vie et de la Santé Par
Mme Camille CIBOT Etude du surenroulement diffusible de l'ADN chromosomique chez la bactérie Escherichia Coli Thèse présentée et soutenue à Gif-sur-Yvette, le 16 décembre 2015 Composition du Jury :
Mme RIMSKY Sylvie Directrice de Recherche - CNRS (ENS Cachan) Rapportrice Mr BOUET Jean-Yves Directeur de Recherche - CNRS (Université Toulouse III -
Paul Sabatier) Rapporteur Mr JUNIER Ivan Chargé de Recherche - CNRS (Université Grenoble - Alpes) Examinateur Mr CONFALONIERI Fabrice Professeur - Université Paris-Sud (Paris XI) Examinateur et Président du jury Mr DEVAUX Frédéric Professeur - Université Pierre et Marie Curie (Paris VI) Examinateur Mr BOCCARD Frédéric Directeur de Recherche - CNRS (Université Paris - Saclay) Directeur de thèse
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Introduction
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7Chapitre1L'organisationduchromosomebactérien:delamoléculed'ADNàl'orientationdunucléoïdedanslacelluleL'absencedemembranenucléairequicompacteetprotègelematérielgénétiqueestl'unedescaractéristiquesdéfinissantlesprocaryotes.Alaplacedunoyau,lesprocaryotesontuncomplexemacromoléculaireappelénucléoïde,oùl'ADNetlesmoléculesfonctionnellementassociéesysontlocalisées.Lacompactionduchromosomecirculaireyestimposéeparunecombinaisondefacteurs,comprenantl'encombrementmoléculaire(deVries, 2010),ladynamiquedupolymèred'ADN(Pelletieretal.,2008),lesurenroulementdel'ADN(HatfieldandBenham,2002;TraversandMuskhelishvili,2005)etl'interactiondel'ADNavecd'autresmoléculestelleslesprotéinesarchitectes(DillonandDorman,2010;Luijsterburgetal.,2008;Touzainetal.,2011).Onreprésentesouventlaforcedecompactiond'unsystèmeparlacomparaisondesdimensionsdeson"contenant»etdeson"contenu».Durantlaphaseexponentielle,lacelluledelabactériemodèleàGram-négatifEscherichiacolimesureraitenviron2μmdelongsur1μmdediamètre.Parcomparaison,l'opéronlac,comportantlesgènesdestructurelacZ,lacYetlacA(codantlaβ-galactosidase,lalactoseperméaseetlagalactosideO-acétyltransféraserespectivement),mesureàpeuprès1,7μmdelongueursanscondensati on.L'un iquechromosomecirculaire d'E.coliK-12de4,6 39kb,d ontonestimequ'ilcontient4288gènescodantdesprotéines(Blattneretal.,1997),mesurelui-mêmeenvi ron1,7mmdecir conférenc eets'ilétaitcomplè tementouve rt,auraitundiamètrede0,5mm,soit500foisceluid'unecelluled'E.coli.Cettefortecompactionnedoitcependantpasentraverledéroulementcorrectetrégulierdesfonctionscellulairesainsiquel'adaptationrapideauxconditionsdel'environnement.Cettecompactionfonctionnelledunucléoïdeestpermiseparl'organisationàdifférenteséchelles,formantchezE.coliunestructurevisibleàl'éche lledunanomètreetunesu per structurevisibleàl'échelledu micromètre(Kimetal.,2004).1) Lastructuredel'ADNLacaractérisationbiochimiquedel'ADNadémarrépardesanalyseschimiquesayantrecoursàdiversestechniquesd'hydrolyse.En1871,JohannFriedrichMiescherisoledansdesnoyauxpurifiésdeleucocytes, unenouvellesubstancecomposée decarbone,d'hydrogène, d'oxygène,d'azote,etdesoufre,présentantunratiophosphore/azotesingulier,etcorrespondantàunenouvellemolécule or ganiquetrèsacide,co ntenant22,5%d'acide
8Figure1:représentationdel'enchaînementnucléotidiqusousformesemi-développéecomposantl'ADNsuivantl'orientation5'-3'.Unebaseazotéeestsoitpyrimidique(avecuncycleazoté:cytosineouthymine)soitpurique(avecdeuxcyclesazotés:adénineouguanine).LenucléosideestunebaseassociéeparuneliaisonN-osidiqueàunsucre,led ésoxyr ibosepour l'ADN.Lenucléotide(mo no-phosphate)estunnucléosideliéàungroupementphosphateaucarbone5'dunucléoside.Laliaisonphosphodiesterreliedeuxnucléoti desparl'attaquenucléophiledug roupementpho sphated'unpremiernucléotidetriphosphate,augroupementOHducarbone3'd'unsecondnucléotide.LiaisonN-osidiqueLiaisonPhosphodiester
9phosphorique.Illano mme"nucléine»(Mies cher,1871).En1889,Richar dAltmanndécouvrequecelle-ciestconstituéed'unefractionprotéique,etd'unesubstanceacide,l'acidenucléique(Al tmann,1889).En1896,lestravaux d'AlbrechtKosselapporte ntdesinformationsclésquantàlacompositiondel'acidenucléiquedontlesmonomèressontcaractérisés,notammentpardestechniquesd'hydrolyse:unsucre,unacidephosphoriqueetdesbasesazotées.Parmicesderniers,Kosseldistinguelastructuredespurines(adénine(A),guanine(G)),decelledespyrimidines(thymine(T),cytosine(C),uracile(U)).LestravauxdePhoebu sLevenemontrentqueles acidesnucléiquesqu idiffèrentparl'excl usivitéd'uracileenplacedelathymine,présententégalementunedifférenceencarbohydrate.En1909,Levenemetenévidencelepentoseprésentdansl'acide"thymonucléique»extraitsdestissusani maux(l'ARN)etqu'i lappelleribose,c ontractiondesinitiales deRockfellerInstituteforBiochemistryetd'ose(LeveneandJacobs,1909).Puisen1928,grâceàuntestchimiquedéveloppéparRobe rtFeulge nen1922,Leve nedémontrequel'acid e"zymonucléique»extraitdeslevuresetdestissusvégétaux(l'ADN)diffèredel'ARNparsonose,le2-désoxyribose.Ene ffet,l'h ydrolyseacideromp tlesliaisonsN-osidiquesentrepurinesetpentoses,exposantlegroupealdéhydiquedudésoxyriboseauréactifdeSchiffoufuchsinequi,ainsiréduit,devientpourpre.Leriboseneprésentantpascetaldéhyde,aucunecolorationn'estobservée.Le stravauxdePhoeb usLevenerévèlentdoncquel 'acidedésoxyribonucléiqueestconstituéd'unenchainementdenucléosidesreliéspardespontsphosphodiesters(LeveneandLondon ,1928).En1 935,onp arlealorsd'ADNou acidedésoxyribonucléique(figure1).Fred erickGriffithavaitavancée n1928l'existenced'un"principetransformant»transm ettantlavirulenced'iso latsde pneumocoquesàdespneumocoquesnonvirulents,vivantsdansunesourishôte(Griffith,1928).En1944,OswaldAvery,ColinMcLeodetMaclynMcCartyextraientl'"agenttransformant»etdéfinissentleprincipede"transformation»:lafonctiondecequ'onappelledésormaisl'ADN,estalorsmiseenévid ence(Averyetal.,1944).Ene ffet,l'ag enttransformantisolé estunacidedésoxyribonucléique;Aver yetsescollaborateu rsappo rtentlapremi èrepreuvequelaséquencenucléotidiqueconférantàl' ADN sastructureprimaire ,ser aitlesupportdel'informationgénétique.En1949,ErwinChargaffdémontrequelacompositiondel'ADNenA,T,GetCdiffèred'uneespèceàl'autremaisqueleratiod'adéninesurthymineetdeguaninesurcytosineesttoujoursprochede1.0(VischerandChargaff,1948).Ilétablitlesrèglesd'équivalencedeChargaff,mettantenexerguelathéoriedugèneencodéd'Erwin
10Figure2:structuresecondairedel'ADNbicaténairedetypeBselonlathéoriedeWatson-Crick-Franklin.A:clichédeladiffractionderayonsXsurdescristauxd'ADNdethymusdeveau,réaliséparFranklinetGosling,le2mai1952. Laforme enXo bservéeest caractéristiqued 'unestr ucturehélicoïdale .B:représentationschématiquedeladoublehéliced'ADNdetypeBforméepardeuxbrinsantiparallèlesd'aprèsWatsonetCrick,encorrespondanceavecleclichédelafigureA.LeslignesenpointilléesduplanàunedimensiondanslafigureAfigurentl'espaced'empilementdedeuxpairesdebasesconsécutivesdansleplanàdeuxdimensionsdelafigureB.
12Tableau1:principalescaractéristiquesstructuralesdesformesA,BetZdel'ADNensolution.Figure3:mo délisationmoléculairetransversale(b as)etlongitudinaleavecleurreprésentationschématique(haut)desformesmajoritairesA,BetZdeladoublehéliced'ADN.Ondistinguelesatomesdephosphateenjaune,lesatomesd'oxygènedusucreenrougeetlesatomesd'azotedesbasesenbleu.LaliaisonA-TrequiertdeuxliaisonshydrogènetandisquelaliaisonG-Cenrequierttrois.
13ApHneutreetdanslesconditionssalinesphysiologiques,ilestadmisquelaformeBestlaformemajoritairedel'ADNinvivo.Ladoublehélicetourneàdroiteavecunpasde3,4nmetundiamètrede2nm.Ladistanceentredeuxplateauxconsécutifsdepairesdebasessuivantl'axedel'héliceestd'environ0,34nm,indiquantdonc10pairesdebasespartourd'hélice(10,4ensolution).L'axedeladoublehélicepasseprèsducentred'appariementdesbases.Ladoub lehélicemontreunpetitet ungrandsil londe 1,2nm et2,2nmdelarg eurrespectivement.Lesquelettesucre-phosphateestàl'extérieurdeladoublehéliceetportedeschargesnégativesenraisondesgroupementsphosphate.LaliaisonN-glycosideestenantietleplissementendocycliquedudésoxyriboseestmajoritairementsousformeC2'-endo.Les pairesdebas essontàl'intérieu rdelado ublehélice,r eposantperpendiculairementauplandel'axedel'hélice,s'empilantainsiparallèlementlesunessurlesautrespourformeruncoeurhydrophobe.Chaquepairedebasestournede36°(34,3°ensolution)autourdel'axedel'héliceparrapportàlapairedebasessuivante.Lesillonmajeurestaisémentaccessibleauxprotéines.LescaractéristiquesdelaformeBfontdecelle-cilaformelaplusvariableetlaplusmalléable.b) LaformeAdel'ADNCetteformeestobservéedansdesconditionsplusfaiblesd'hydratationquecellesdelaformeB,c'estàdireàforceioniqueplusélevéeoudansunmélangeéthanol-eau(Saengeretal.,1986).Cettedoublehélicedontl'axeestexcentréducentred'appariementdesbases(nonperpendiculairesàcelui-cicarinclinéesde10à20°)estdroite,maispluscourteetpluslargequelaformeB:sonpasestde2,8nmpour11pairesdebasespartourd'héliceetsondiamètreestde2,3nm.Aussi,lesplansdedeuxpairesdebasessuccessivessontdistantsd'environ0,26nm.LaliaisonN -glycosideestenantietlep lissement endocycliquedudésoxyriboseestmajoritairementsousformeC3'-endo:laconformationdessucresapparaîtainsimoinsfle xiblequedanslaf ormeB.LaformeAprésente unpetitsillo nlargeetsuperficieletungrandsillonprofondoùlesgroupesphosphatesontplusprocheslesunsdesautresquedanslaformeB,faisantapparaîtreunfortpotentielélectronégatifdanslegrandsillon,propiceàl'insertiondecations.Eneffet,lesconformationsconstruitesavecleC3'-endorequièrentdeplusfortesconcentrationsenselsparrapportauxconformationsavecleC2'-endo,pou rcontrebalancerladistanceplus courte entrelesgroup ementsphosph atechargésnégativement.UnetransitiondelaconfigurationdetypeBverscelledetypeAde
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15l'ADNmatriceausiteactifdel'ADNpolymérasedeB.subtilisseraitrequisepourfavoriserlafidélitédelapolymérase(Kieferetal.,1998).CetteformeseraitégalementmajoritairedansleshybridesADN-ARNoudanslesduplexesARN-ARN.c) LaformeZdel'ADNSonunitéderépétitionn'estpasunnucléotidecommedanslesformesAetB,maisundi-nucléotide,faisantalternerbasepuriqueetbasepyrimidique.LaconformationfaitdoncalternerrespectivementuneliaisonN-glycosideensyn,avecunplissementendocycliquedetypeC2'-exo,etuneconformationdusucreenanti,avecunplissementendocycliquesousformeC2'-endo(Wangetal.,197 9).Cette formeaétéinitialementcaractériséeenconditionssalinesélevées,de3MNaCl(PohlandJovin,1972).Laméthylationdescytosines,ainsiquelaprésenced'autrescationstelslaspermineoulaspermidineàdesconcentrationsmillimolairesstabilisentégalementce ttestructure(RichandZhang,2 003).Cette doublehélicedontl'axes'écar tesignificati vementducentre d'appariementdesbases quisontperpendiculairesàcelui-ci,tourneàgaucheetàl'inversedelaformeA,estpluslongueetplusétroitequelaformeB:elleprésenteunpasde4,5nmpour12pairesdebasespartourd'héliceetundiamètrede1,8nm.Lesillonmajeurressembleplusàunesurfaceconvexeexterne,tandisquelesillonmineurestprofondettrèsétroitdoncpeuaccessible(Wangetal.,1979).d) LaformePAllemandetsescollèguesontmisenévidenceunnouveautyped'ADN,l'ADN-P.Lorsquel'ADN-Bsubiunetensioncoupléeàunsurenroulement,ilréaliseunetransitionbrutaleoùlespairesdebasessontrompuesetsetournentàl'extérieurdeladoublehéliced'ADN(Allemandetal.,1998),cachantlesquelettesucre-phosphatequidevientinaccessibleauxenzymes.CetypedestructureaétéobservédanslebactériophagePf1,uniquementstabiliséparl'agencementdesprotéinesdel'enveloppe(LiuandDay,1994).2) L'ADNdesprocaryotesestsurenroulénégativementUnmoyeneffi cacederéduirelevolume d'unemoléculed'ADNestd'yi ntroduiredes supertours.
16Figure4:l'ADNprocaryoteestsurenroulé.A:représentationdesdifférentesformesdel'ADNdupolyomavirus(I,IIetIII)suivant leurcoeffici entdeséd imentatio n,aveclesmicro graphesélectroniquesADNx21000,desformesI(surenroulée,encadréeennoir)etII(relâchée,encadréeengris)correspondants.Pluslavitessedesédimentationestél evée,plusl'ADNestco mpactédoncsurenroulé(d'aprèsVinogradetal,1965).B:micrographesélectroniquesduplasmidepBR322sousformerelâchée(a)etsurenroulée(b)correspondantauxformesIetIIdel'ADNdupolyomavirusrespectivement,observéesenfigureA.AFormeI(surenroulée)FormeII(relâchée)B(a)(b)
17a) Ladécouvertedusurenroulementdel'ADNLavites sedesédimentationde l'ADNétant unepropriétéphysiquesensible àladénaturationdecelui-ci,lastructuretertiairedel'ADNaétéétudiéeencomparantlesprofilsdevitessedesédimentationdediverstypesd'ADNphagiquesouplasmidiquesobtenusparultracentrifugationsurgradientsdesucrose.Lesd ifférentesc onditionsdedénaturationutilisées(CrawfordandBlack,1964;Vi nogradetal .,1965)montrentalorsl esmêmescourbesdevitessedesé dimentation-dénaturationdemolécule sd'ADNdoublebrincirculairesfermées,indiquantqueledegréderotationd'unbrinautourdel'autrenevariepas.UnecoupuresimplebrinparlaDNasedécompactel'ADNextraitdelaformeréplicativedubactério phagePhiX174(JanszandPouwel s,1965)oudupol yomavirus, égalementobservableenmicroscopieélectroniquecommesurlafigure4.Cesobservationsmettentenexerguelapropriétédelatopologiedel'ADN:Vinogradetsescollèguesproposentquecesformescompactessontsousformedoublebrinetcirculaireavecunestructuretertiaireenrouléegauche.Cesanalyses d'ADNditesinvitro, ontouvert lavoieàl'étudedu surenroulementchromosomiquebactérien.b) DelastructuresecondaireausurenroulementLesdeuxclas seslesplusr épanduesduplissemen tendocycliqu edusucrede l'acidenucléiquedécriventchacuneexclusivement,uneformed'ADNbicaténaireparleureffetsurlaconformationglobaledelamolécule.LetypeC2'-endoquiimposeunedistanceentrephosphatesde0,7nm,décrituntourd'hélicede36°,c'estàdire10pb/tour,correspondantàlastructuredel'ADN-B.SilesucreadopteuneconformationC3'-endo,avecunedistanceinter-phosphatesde0,6nm ,lastructure présenteun tourd 'hélicede31° avecunerépétitionde11à12pairesdebases,similaireàcelledel'ADN-A(Vargasonetal.,2001).Enfait,laconformationdesélémentsdestructuredelamoléculed'ADNinflueprofondémentsurlesparamètresstructurauxdel'hélicemono-etbicaténaire:l'empilementdesbasesdéfinitladistanceentrebases,leurappariementdonnelerayondelamoléculedoublebrinetlac onformationdusucrei mposela distanceentrelesgroupeme ntsphosphated'unmêmebrin.Cesparamètressontétroitementliésetcontribuentàl'obtentiond'unetorsionspécifiqueparladoublehéliced 'ADN.Aus si,dan sunemoléculed'ADN doublebrindelongueurdonnée,cesparamètresdéfinissentTw,lenombredetoursd'hélicesdel'ADNounombrederévolutionsqu'unbrinfaitautourdel'autre.
18AFigure5:la molécule d'ADNferméeestunobjet topologique.A:photoreprésenta ntunrubandeMoëbius.Latopologieconsisteenl'étudedesdéformationspartransformationscontinues.LerubandeMoëbiusestunexempled'objetd'étudedelatopologie,commelamoléculed'ADNquiestunestructureferméepouvantsedéformerdefaçoncontinuesansruptureetréassemblagedebrins.B:représentationschématiquedelatopologiedel'ADN,définiepardeuxparamètres,lenombredetoursd'hélicesTwetlenombredesupertoursWr,dontlasommedéfinitlenombretotaldelienstopologiquesLkquinevariepaspuisquelamoléculeestfermée.LesfiguresaetbcorrespondentàunétatrelâchépuisqueWr=0.Enblamoléculeprésentedesplisblancsquifigurenttroistoursd'hélices,tellesdeuxmoléculesd'ADNenroulées(Tw=3).Enc,dete,lamoléculeestsurenrouléepuisqueWr≠0.CommeLknevariepas,ladéformationdeTwtransformeWr:alorsqueTwdiminue,Wraugmente.SiTwdevaitaugmenter,Wrdiminuerait.Lesplisblancs(b)ontdisparu(e),maislastructuren'estpasplanecommeen(a),elleestsurenroulée:c'estl'effettopologique.BFormerelâchéeFormesurenroulée
19Eneffet,lorsquel'onparled'"unADN»,onévoqueenréalitédeuxmoléculessimplebrind'ADNs'enroulantl 'uneautourd el'autre.Dece fait,ces brinssontliésdèsq ueleurs extrémitéssontjointesoufix ées.Untel systèmepeutêtreanalysé d'unpoi ntdevuetopologique.Latopologieconsisteenl 'étude desdéformationsspatialespar destransformationscontinues,c'estàdiresans ru ptureetréassembl agedesstruc tures(correspondantsauxbrinsdansnotresystème).L'étattopologiqued'unetellemoléculepeutêtredécritparl'équationsuivante(White,1969):Lk=Tw+WroùLkestlenombred'enlacements,c'estàdirelenombretotaldefoisoùlesdeuxbrinsduduplexd'ADNfermésecroisent.Parconvention,Lkestunentier,positifdansunehélicedroite,etnégatifdanslaconfigurationopposée,c'estàdiredansunehélicegauche.Lknevariepastantquelastructureestfermée.D'aprèscetteformule,dansunADNbicaténaireplan,Lkvautle nombrede toursd'h élicesT wetWr=0;lamo lécule estalorsdite"relâchée».Or,silastructuren'admetpasdevariationdeLk,lamoindredéformationinduisantunevariationdeTw,créeunetensionmécaniquequidéplacel'équilibre.Leretourdusystèmeàl'équilibresefaitparlaformationd'unestructuretertiaire,unesuperhélice,quipossède unsensderotationinvers eàcelui deladoublehélice .Autrementdit,lavariationdeTwestgéométriquementcompenséeparlavariationdeWr,lenombredefoisoùleduplexs'enroulesurlui-même,ounombredesupertours.Cettepropriététopologiquedel'ADNinduitqueLkpeuts'exprimersousdifférentescombinaisonsdeTwetdeWretnevariequesileduplexd'ADNsubituneruptureetunréassemblagedesbrins.Detellesréactionssontpromuesparlesenzymesinduisantdeschangementsdetopologiedel'ADN.Danscecas,Lkchanged'unnombreentierd'unités.En1963,Cairnsapporte,parautoradiographie,lapreuvequelechromosomebactérientoutentierestunemoléculed'ADNdoublebrincirculaire,doncfermée(Cairns,1963).Dèslors,onpeutparlerdetopologieduchromosomebactérien(figure5).c) Lechromosomeestsurenroulé"négativement»D'aprèsVinograd,l'ADNcontientdessupertoursd'héliceinvariantsgauchedoncpositifscarmaintenusparl'équilibredesforcesengendréesparlastructureWatson-Crick(Vinogradetal.,1965).Dansunsystème"fermé»,noncontraintmaisoùunniveaustandarddesurenroulement
20Figure6:l'ADNprocaryoteestsurenroulénégativement.A:représentationschématiquedel'effetdel'intercalationdubromured'éthidium(BET)surlatorsiondel'ADNbicaténaire.LeBETs'intercaleentredeuxpairesdebasesconsécutives,diminuantl'anglederotationdeladoublehéliced'ADNde26°parsiteoccupé.Ladiminution continued eTwdénaturel'ADN.B:représentationschématiquedel'effetde l'intercalationcroissanteduBETsurlatopologieglobaledel'ADNSV40intactdeaàc.Lareprésentationducoefficientdesédimentationdel'ADNSV40surenrouléenfonctiondelaquantitédeBETintercalémontreunpro filbiphasiquesymétri quedelasédimentationde l'ADNsurenroulédedépart,caractérisant latopologiedel'ADNdel'étataàc(d'aprèsBaueretVinograd,1968).C:représentationschématiquedel'effetdel'intercalationduBETsurlatopologiedel'ADNsurenroulé.LeprofilbiphasiqueobtenuenBs'expliqueparladiminutioncontinuedeTwdroit(figureA)quimèneàladiminutiondeWrdroit(doncnégatif)jusqu'àunétatrelâchéoùlavitessedesédimentationdel'ADNestminimale,suividugaindeWrgauche(doncposit if).Silasaturat iondeladoublehéliced'ADN enmoléculeintercalantemène ausurenroulementpositifdecelle-ci,c'estquesadensitédesurenroulementdedépartétaitnégative(d'aprèsSinden,2013).BCoefficientdesédimentation(S) [Moléculed'intercalantliée/résidu] σ,supertours/10pairesdebasesτ,Supertours/ADNSV40 ABETintercaléTorsion:10°Torsion:36°HélicedroiteSuperhélicedroite.ADNsurenroulé(-)Superhélicegauche.ADNsurenroulé(+)CADNRelâché
21estmaintenu,ons'intéresseàlavariationdunombred'enlacementsdécritparlarelationΔLk=ΔTw+ΔWr.LorsqueLkdiminue(ΔLk<0),l'énergi elibredéfavorablequiluies tassociéeestminimiséepar laformatio ndesurenroulement(ΔWr>0)et/oud 'unediminutiondelatorsion(ΔTw<0).Parconvention,onditqueΔTw>0traduitlesensderotationdel'héliceADN-B,c'estàdireunerotationàdroite.Danscecas,ΔWr>0décritunerotationgauchedelasuperhélice,etΔWr<0décritunerotationdroitedelasuperhélice.L'utilisationd'unintercalantdel'ADNapermisdevaliderlaprédictiondusens(ousigne)dusurenroulementénoncéeplushaut.Lebromured'éthidiumestunemoléculequis'intercaleentredeuxpairesdebasessuccessivesdelamoléculed'ADN,unemoléculequidénaturedoncladoubleh éliceendiminuantl 'anglede torsionde26°p arbaseoc cupée,cequ iaugmenteladistanceentrelesdeuxpairesdebasesde0,34nm(Wang,1974)(figure6A).L'intercalationdequantitécroissantedecolorantdiminuedonclenombredetoursd'hélicesdroits(ΔTw<0)etcettedénaturationprovoqueunchangementcontinuetréversibledunombredesupertoursW r.BaueretVinograd propo sentuneéquationmodélisan tlavariationdunombredeliensenfonctiondelafixationdel'intercalantsurl'ADNduvirussimien40(SV40)affectantsavitessedesédimentation(BauerandVinograd,1968)(figure6B).LavariationdunombredeliensestnégativeΔLk<0.Eneffet,sachantqueΔTw<0aucoursdel'expérience,silasaturationenintercalantmèneàWr>0,audépartWr<0.Lesurenroulementdel'ADNestdoncnégatif,cequivaàl'encontredelathéoriedeVinograd(figure6C).Cesrésultatss ontenaccordavecles profilsbip hasiquesd evitessedesédimentation,longtempsrestésinexpliqués:avec ladénaturation, ladim inutiondelavitessedesédimentationindiqueunepertedesupertoursnégatifsatteignantunevaleurminimalequicorrespondàunétatnonsurenroulé,etsuivied'uneaugmentationdevitessedesédimentation,signed'ungaindesupertourspositifs.Delamêmefaçon,Wangmontrequel'ADNd esbactériophagesλb2b5c,PhiX174,λcI85 7etduplasmide15 d'E.coli,présententunsurenroulementnégatifdontilquantifielenombredeliens(Wang,1969a,1969b).En1972,WorceletBurgianalysentdelamêmefaçonlerepliementd'unnucléoïdeentierisoléd'E.colietconfirmentlesrésultatsobtenusinvitro,àsavoirquelechromosomebactérienmontreunestructure tertiairesurenrouléenégativement.Bienquethermodynamiquement,l'étattopologiqueleplusstableestlerelâchement,l'ADNextraitdelaplupartdesorganismesprocaryotesprésenteundéficitennombredeliens(ΔLk<0),c'estàdireunsurenroulementnégatif(Wang,1969b;WorcelandBurgi,1972).
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23Afindecomparerlesurenroulementdemoléculesd'ADNdedifférentestailles,uneautremesuredusurenroulementaétédéterminée:ladensitédesupertoursσdel'ADN,c'est-à-direlenombredesuperhélicespartourdedoublehéliced'ADN:σ=τ/β,oùτestlenombredesuperhélices(nombrederotation del'axedeladoublehéli cedansl'espaceouentortillement)etβlenombredetoursd'hélice(nombredepairesdebasesdiviséparlepasdel'hélice)(GlaubigerandHearst,1967).Lechangementd'étatdesurenroulementdel'ADNpeutaussiêtredéfinip arladifférencespéci fiqued'e ntrelac ementoudensitédesurenroulementσ,indépendantedelalongueurdel'ADN,décritparl'équationσ=ΔLk/Lk0,oùLk0correspondaunombred'enlacementsdel'ADNlorsqu'ilestrelâché,c'estàdireoùWr0=0,doncLk0=Tw0(Vologodskiietal.,1992).SiΔTw=0(siletourd'hélicenevariepas)alorsΔLk=ΔWretladensitédesurenroulementdel'ADNestdécritparσ=ΔWr/Lk0.ChezE.coli,lavaleurmoyennedeladensitédesurenroulementduchromosomepour10,4pbestdeσ=-0.06.L'étattopologiq uedel 'ADNd'ar chaeathermophilesdan ssonensemblen'es tpasentièrementélucidé:ilaétépr opo séqu'il soitrelâchéou surenroul épositivement(Charbonnieretal.,1992;Herzeletal.,1999),alorsquel'ADNd'archaeamésophilesestsurenroulénégativement(CharbonnierandForterre,1994;Musgraveetal.,2000).d) Organisationdusurenroulement:lesmicrodomainesEn1971,StoningtonetPettijohnanalysent,parultracentrifugationsurgradientdesucrose,l'ADNradiomarquénatifextraitdecellulesd'E.colienphaseexponentielledecroissance.L'ADNchromosomiqu elibéréestassociéàdesprotéin es (majoritairemen tdesARNpolymérases)etàdesARNmnaissantsliésàdesribosomes.Lafaibleviscositéetlavitessedesédimentationobservéessuggèrentquelechromosomepossèdeuneconformationtrèscompacte.Cettestructureestalorsdépliéelorsqu'elleestchaufféeettraitéeàlaRNase,indiquantqu'uncomposantA RNestimpliquédans sastabilisation(StoningtonandPettijohn,1971).ParuntraitementàlaDNaseI,WorceletBurgiestimentlenombredecoupuresimplebrin,capablesderelâchercomplètementlechromosome.UntraitementàlaRNaseInedépliequantàluiqu'unefractionduchromosome,lescellulesenréplicationétantplussensiblesautraitementquelescellulesencarence.Apartirdecesdonnées,WorceletBurgiconstruisentunmodèleoùlechromosomeestcomposéd'unensembledebouclessurenroulées,maintenuesparl'interactionavecuncoeurdetyperibosomal(ARN
24Figure7:le chromoso med'E.coliestor ganiséendomainesdesure nroulemen t.A:mi crographeélectroniqued'unchromosomeisolédecellulesd'E.colienphaseexponentielledecroissanceprésentant141±3bouc lesémanantd'unnoyau central(d'aprèsKavenoffetBowen,1976).B:re présentationschématiquedel'organisationduchromosomed'E.colienmicrodomainessurenroulés(d'aprèsHigginsetal,1996).BA2µm
26Figure8:représentationschématiquedelaprésencedesprincipalesNAPsenfonctiondelaphasedecroissance.CertainesNAPssontspécifi quesdelaphaseexponentielledecr oissance, tellesFi s,ouspécifiquesdelaphasestationnairecommeDpsouCbpA.D'autres,commeH-NSouHUsontexpriméestoutaulongdelacroissance(d'aprèsSobetzko,2012).PhasedecroissanceAbondancerelativedesNAPsExponentielle(début)Exponentielle(milieu/fin)LatenceStationnaireTransition
27Cetteconnaissanceainfluencél'étudedesprotéinesportantdesfonctionsanalogueschezlesbactéries,menantàlesappelerprotéines"histone-like»(DormanandDeighan,2003;DrlicaandRouviere-Yaniv,1987).Ellessontdésormai scollectivem entappeléesNucleoidAssociatedProteins(NAPs),reflétantleurlocalisationcellulairesansimpliquerdesimilaritédestructur eavecleshistones.Lavar iabilitéfoncti onnelledes protéinesarchitectesassociéesàl'ADNsemblecommunémentnécessaireauxprocaryotesetauxeucaryotes.Eneffet,leseucaryotesprésententpeudevariantsd'histonemaiscesdernierspossèdentunequeuesujetteàdemultiplescombinaisonsdemodificationspost-traductionnelles,celaleurpermettantd'êtrefixéspardesacteursphysiologiquesvariés.Al'inverse,lesprocaryotesn'ontpasdemodificationspost-traductionnellesmaismontrentunegrandediversitédeNAPs.OndifférenciedeuxgroupesdeNAPs.LepremiergrouperassemblelesNAPsausensstrict:desprotéinesabondantes,defaiblepoidsmoléculaireetquel'onsupposeagircommecomposantsarchitecturauxauseinduchromosomebactérienalorsappelénucléoïde.Deplus,cesprotéinespouvantmodulerl'expressiondugénome,ellessontimpliquéesdanslemétabolisme(Graingeretal.,2006)etmodulentsouventleurpropreexpression.D'aprèscettedéfinition,E.colipossèdeaumoinsdouzedecesNAPs(AzamandIshihama,1999;Dorman,2013).Le secondgroupe estconstitu édelagrandemajoritédes protéines restantes,moin sabondantesetquisefixen ttransitoir ementàl'ADN.Ene ffet,E.colicontientaumoins240différentesprotéinesquiselientàl'ADN(Robisonetal.,1998).LesmembresdugroupedesNAPssontnombreuxetdiversesmaissontétudiésdefaçonassezinégale.LaplupartdesNAPsfixentlaformeBdel'ADNavecunefaiblespécificitéetladéformentlocalement.Lecalculdelaconstantededissociationapparente(Kd)dechaqueNAPpourunesonded'ADNspécifiqueounonspécifique,apermisdedéterminerl'ordred'affinitédefixationàl'ADNdesdifférentesNAPsabordées:HU>IHF>Lrp>CbpB>Fis>H-NS>StpA>CbpA>IciA>Hfq/Dps(AzamandIshihama,1999).Commelesnucléosomes,ils'avèrequelesNAPssontimpliquéessimultanémentdansdifférentsprocessuscellulaires,commelatranscription,laréplication,larecombinaison,laréparation,laségrégation,etc.D'autrepart,lesNAPsprésententdifférentsprofilsd'expressionaucoursdesphasesdecroissance(AliAzametal.,1999)(figure8).Celapermetàlacelluled'adapterl'organisationdesonchromosomesuivantlacroissanceetderégulerprécisémentl'expressiondesonrépertoiredegènesdefaçonspatio-temporelle(Sobetzkoetal.,2012).Ilestencoredifficile
28Figure9:représentationschématiquedesdifférentseffetsdecondensationdel'ADNparlesNAPs.OnpeutclasserlesNAPssuivantleureffetdefixationl'ADN,telsl'enroulement(A)pardesprotéinescommeLrp,lacourbure(D)pardesprotéinescommeIHF,HUetFis,lepontage(C)pardesprotéinescommeH-NS,StpA,MatPetSe qA,lafilamentation(B)pardesprotéinescommeDnaAetSeqAetenfinlaformati ond'agrégats(E)pardesprotéinescommeCbpADpsetHfQ(d'aprèsStavansetOppenheim,2006).Figure10:enroulementdel'ADNparLrp.A:représentationdelastructureducristald'unoctamèredeLrpliéàuneséquenceADNcontenanttroissitesdefixationLrp(bleu,vertetrouge)del'opéronpapchezE.coli,etsonmodèledefixationàl'ADNparenroulement(vuetransversale).B:modèledefixationd'uncristaldedeuxoctamères(vertetbleu)deLrpàl'ADNdeprofilchezBacillussubtilis(vuelongitudinale).Lafixationcoopérativedesoctamèresenroulel'ADNtelunnucléosomeeucaryote(d'aprèsThawetal,2006).BA
29aujourd'huid'établirlerôleprécisdechaqueNAPsurlerepliementdugénomepuisquedesphénotypesmutantsdecelles-cisonthautementpléïotropiques,lesconséquencesdeleurliaisonétanttrèsdiverses.Néanmoins,onpeutclasserlesNAPssuivantleureffetdefixationàl'ADN(figure9),mêmesilafaçondontcesprotéinesorganisentlechromosome,au-delàdelasimpledistorsionlocaledel'ADN,n'estpastotalementrésolue.Lescontactsprotéine-protéineetl'espacementrégulierdeleursitedefixationsurl'ADNpourraientdonnerlieuàdessupertour sd'ADNouàdesboucles, telleslesfibresdelachr omatineeucaryote.QuelquesunesdecesNAPs sontprésentées ci-dessous,enfoncti ondesconséquenceslocalesdeleurliaisonàl'ADN.a) Enroulementdel'ADNBienquemoins fréquentesq uechezleseucaryo tes,lesprotéinesarchitecturales quienroulentl'ADNtelleslenucléosomeeucaryotesontaussiprésenteschezlesbactéries.Parexempl e,lesmembresdelafamille Lrp/AsnC(Leucine-responsiveregulatoryprotein/asparaginesynthaseCgeneproduct)sontconservéschezdifférentesbactéries.LaprotéineLrpestunbaromètrephysiologiquepuisqu'ils'agitd'uneprotéinederégulationrépondantàlaleucine(Platkoetal.,1990).Ellepossèdedemultiplessitesdefixationdontl'alignementdesséquencesapermisdedéfinirunconsensusdégénéréde15pb(AzamandIshihama,1999;Cuietal.,1995).LaprotéineLrps'oligomérisesousformededisque,lesitedefixation àl'ADNétantlocaliséd ans lapartieN-terminale,disposéàlasurface delaprotéine.Celaimpliquel'en roulementde l'ADNà180°autourd'unoctamè reoud'unhexadécamère,enaccordaveclesprofilsdefixationàl'ADN(delosRiosandPerona,2007;WangandCalvo,1993).Enabsencedeleucine,deuxoctamèresdeLrppeuvents'associerenunhexadécamèrecapabled'enroulerpresquedeuxtoursd'ADN(ChenandCalvo,2002),formantainsiuncom plexequirappel lelenu cléosomeeucaryoteetpromouvantlacompactiondel'ADN.IlaainsiétérapportéchezB.subtilisqueLrpseraitcapabledeponterl'ADN(Tapiasetal.,2000) (figure10).Cespropriété sinfluentsurlastructured uchromosomemaiségalementsurlatranscription:ilinfluencel'expressiondesARNstables,tellecelledel'opérondel'ARNr,qu'ilréprimeparcoopérationavecH-NS(Puletal.,2007).Legènelrpsembleêtrepositivementcontrôléparl'alarmoneppGppàlaréponsestringente,defaçonindirecte(Landgrafetal.,1996).Celaestenaccordavecl'abondancemaximaledeLrpenfindephaseexponentielle(2500molécules)suividesadiminutiondèsl'entréeen
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31phasestationnaire(AliAzametal.,1999).CecitraduitunediminutiondubesoinenARNstablestelslesARNrqu'ilréprime,etautrescomposantsdelamachineriedetraduction.D'autrepart,sonniveaud'expressionestdeuxàquatrefoisplusélevéenmilieucarencéqu'enmilieurich e,suggérantqu'ilrégu leraitpositivementdes gènesinduitsencasdecarence.Cefacteurrégulepositivementounégativementprèsde10%desgèneschezE.coli,etsonactivitépeutêtreinhibéeouinaffectéeparlaleucine,suivantlaciblerégulée(Choetal.,2008a).b) Courburedel'ADNAl'instardesnucléosomeschezleseucaryotes,lesprotéinesquicourbentl'ADNsonttrèsrépandueschezlesprocaryotesetjouentunrôleprépondérantdansl'organisationdelachromatine.LesexempleslesplusétudiéssontlesmembresdelafamilleHU/IHF(SwingerandRice,2004).IHF(IntegrativHostFactor)aété identifié commelefacteurdel'hôte facilitantlarecombinaisonintégrativeduphagelambdache zE.coli(CraigandNash,198 4),dont l'intégrationestfacilitéeparlaformationd'uneboucled'ADNspécifiqueparIHF.LesgènesihfAetihfBcodentpourlesde uxsous-unitésformantl'hétér odimèredeIHF,αe tβrespectivement(Weisbergetal.,1996).LastructurecristallographiquedudimèredeIHFmontreuncorpscompacted'hélicesαdontdeuxbrasflexiblesenfeuilletsβémanent.Uneprolinedechaquebrass'intercaledanslesillonmineurdelaséquenced'ADNspécifique,enroulant37pbd'ADNautourducorpsdelaprotéine.LafixationdeIHFsurl'ADNprovoqueunecourburesupérieureà180°(Riceetal.,1996).Elleintroduitun"U-turn»del'ADN,centrésurlesitedefixation(AzamandIshihama,1999;SwingerandRice,2004)Swinger&Rice,2004).IHFfixelepetitsillondel'ADN:soituneséquencenucléotidiqueconsensusde15pbYAACTTNTTGATTTW(Engelhornetal.,1995)suivantunKD=0,3-2,3nM,soituneséquencenonspécifiqueavecunKD=2μM(Murtinetal.,1998).Lacellulecontientenviron12000monomèresenphaseexponentielle.Laquantitéd'IHFaugmentequandlacroissancedescellulesdiminue,atteignant55000moléculesendébutdephasestationnaire(AliAzametal.,1999).Ainsi,danslatransitionentrelaphaseexponentielleetlaphasestationnaire,IHFestlasecondeNAPlaplusabondante.LegradientdesitesayantunKdde0,1nMà2μM,indiqueuneoccupationgraduelledessitesduchromosomeaucoursdelacroissance
33parl'augmentationdelaquantitéd'IHF.Uneseulemoléculed'IHFsur10000seraitlibreensolution,indiquantqu'IHFjoueraitunrôleimportantdanslastructuredunucléoïdeetlaconversiondesesfonctions(Murtinetal.,1998).Lorsqu'IHFsefixedefaçonhautementspécifiqueenamontd'unpromoteur,ellepeutmodulerl'initiationdelatranscriptioneninfluençantlaformationd'uneboucled'ADN(Dworkinetal.,1998).HU(Histone-likeproteinfromE.colistrainU93)présenteunesimilaritédeséquenceavecl'histoneH1eucaryote:c'estundesraresexemplesdeNAPquiestuneprotéinedetypehistone-likeparsaséquenced'acidesaminés,hautementbasique(Yamazakietal.,1984).LesgèneshupAethupBcodentpourlesde uxsous-unitésαetβrespe ctiveme nt.LacompositiondeHUvarieaveclaphasedecroissance:homodimèreαendébutdephaseexponentielleetβenphasestationnaire,ouhétérodimèreenmilieudephaseexponentielle(ClaretandRouviere-Yaniv,1997).Néanm oins,cestroisformesnesont pasfonctionnellementéquivalentes:laformeβ2,sefixeplusfaiblementàdel'ADNdoublebrin.HUmontreunestructuresimilaireàcelledeIHFmaislesitedefixationestaspécifiqueetsatailletrèsvariable .Commepou rIHF,laprolinedechacun desdeuxbrasenf euilletβs'intercalantdanslepetitsillondel'ADN,ladistanceentrelesdeuxprolinesestde9pbd'ADN.LecorpsdudimèreayantdescontactsvariablesavecdessitesADNsupplémentaires,lesitedefixationpourraits'étendreà19pbetdiminueletourd'hélicemoyend'ADNà31°parpairedebases(Swingeretal.,2003).HUselieraitpréférentiellementàl'ADNprésentantdesdéformationsstructurales,tellesquedescoupuresouunejonction(Balandinaetal.,2002;Pontiggiaetal.,1993).EllesefixesoitavecunKDde200à2500nMpourl'ADNnondéformé(Pinsonetal.,1999)ouà2nMp our less ubstrats déformés(KamashevandRouviere-Yaniv,2000).LafixationàdetellesdéformationssuggèreunrôledeHUdanslaréparationdel'ADNparrec ombinaison homologue(LiandWaters, 1998).Lafixati onaspécifiquedeHUinduitet/oustabiliseunegrandevariétédeséquencesd'ADNcourbés,variantde105à140°(Swingeretal.,2003)(figure11A).CetteflexibilitéducomplexeHU-ADN,facilitelaformationdebouclessurdecourtesdistancesetàfaibleconcentration,permettantlarégulationdel'expressiondesgènesoulacondensationdelarégioncible(Beckeretal.,2007).Trèsrécemment,uneétudeutilisantunefusionHupA-mCherryaétéréaliséeafindevisualiserlechromosomed'E.coliàhauterésolutionspatialeettemporelle(Fisheretal.,2013).Lespropriétésd'interactiondeHUavecl'ensembledunucléoïdeont
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35permisderévé lerlastructureglobale detypehélicoïdaleetlanature dynamiquedunucléoïded'E.coli.Lenombremaximal deprotéinesHUpré sentesdans lacelluled'Escherichiacoliaé téestiméà prèsde30000enphase exponenti elle,permettantde recouvriretdeplier10%del'ADNchromosomiqueensefixantàtousles300à400pairesdebasesenviron(AliAzametal.,1999).Fis(Factorforinversionstimulation)ad'abordétéidentifiécommeunfacteurimpliquédanslareco mbinaisonspécifiquede site.Cetteprotéineestconser véedanslaplupartdesbactériesàGramnégatif.Elleselieenhomodimèreàuneséquenceconsensusde17pb,richeenAT,exceptéepourlespositions2et16,oùdesrésidusGetCsontcommunémenttrouvés(AzamandIshihama,1999;Choetal.,2008b).L'homodimèreprésenteuncorpshydrophobed'oùémanentdeuxmotifsdefixationàl'ADN,uneparmonomère,detypehélice-tour-hélice(Panetal.,1996).Lesdeuxhélicesdereconnaissancesontséparéesde2,5nmetl'insertiondanslesdeuxpetitssillonsadjacentsséparésde3,4nminduitlacourburedel'ADN auniveaudusitedeliaiso n,jusqu 'à50°(Skokoetal.,2006).Une courbureadditionnelleestgénéréeparlesinteractionsentrel'ADNflanquantlesitedefixationdeFisetlescôtésdudimèredeFis,résultantenunecourburejusqu'à90°.Lacourburemoyenneestde65°etlesitedefixationestd'environ27pb(Stellaetal.,2010)(figure11B).LafixationdeFisconduitàunecompactionconsidérabledel'ADN,sansdoutedueàdelafixationaspécifiqueetàun re pliementc oncomitant(Skokoetal.,2005),simi laireaumécanismesuggérépourHU(vanNoortetal .,2004).Fiscontribue àdenombreusesactivitéscellulairesimpliquantl'ADN,n otammentlatranscription, laréparationetlarecombinaison(Dorman,2009).Unan alysebio-informatiqueetdesexpériencesd'ImmunoprécipitationdeChromatine(Chip)chezE.colisemblentmontrerqueFisseliepréférentiellementendehorsdesrégionscodantesdegènes,tousles200à300pairesdebasesenmoyennelelongduchromosome(Graingeretal.,2006).FisaunimpactmajeursurlestranscriptomesdeE.colietdeS.thyphimurium(Bradleyetal.,2007;Kellyetal.,2004)enrégulantl'expressiondenombreuxgènesimpliquésdanslacroissancetelsceuxquicodentpourlesARNr,lesARNtoupourd'autresNAPs.LepromoteurdeFisprésentesixsitesdefixationpermettantuneauto-régulationnégativedesonexpression(Balletal.,1992).FisseraitcapabledefairedespontsADN-protéine-ADN(Schneideretal.,2001).Environ50000protéinesdeFiss'accumulen tenphaseexponentiel leprécocepu isleurnombredécroît
36Figure12:co urburedel'ADNparIciA( ouArgP). Modèledefixation dutétra mèredurégulateurtranscriptionnelIciAd'aprèslarésolutionà2, 7Ådelastr uctureducristaldeIciAd eMycobacteriumtuberculosis.LepremierdimèresefixeraitavecunehauteaffinitéauRBS(RecognitionBindingSequence)libre(a),puis lafixationd'un deuxièmedimère serait facilitéeparlarec onnaissance deleurdomainrégulatoireC-terminaletinduiraitunecourburedel'ADN(b)(d'aprèsZhouetal,2010).DimèreIDimèreIIselieàl'ADNDimèreIIDimèreIselieàl'ADNADNFigure13:pontagedel'ADNparH-NSd'aprèslarésolutiondelastructureducristaldesesdifférentsdomaines.A:représentationdelastructureducristalrésoluà3,70Ådudomained'oligomérisationseuld'undimèr e(rougeetbleu)de H-NSdeS.thyp himuriumsuivantuntêteàtête (PDB3N R7).B:représentationdelastructured'unfilamentdeH-NSdeS.thyphimuriumsansdomainedefixationàl'ADNsuivantuntêteàtêteetunqueueàqueue(PDB3NR7).C:représentationdelastructureducomplexedudomainedefixationàl'ADNdeH-NSliéàl'ADNdeE.coli(PDB2LEV).D:modèledupontagedel'ADNparH-NSimpliquantlesreprésentationsA,BetC(d'aprèsKotlajichetal,2015).ABCD
39répresseurglobaldelatranscription,elleaffecteplusde35gènesouopéronschezE.coli(Blotetal.,2006 ),notammentceuxdontl' initiationnécessitelefacteurRpoSparséquestrationdecedernierdansuneboucle(Shinetal.,2005).HN-Sauto-réprimesonexpressionenoccupantsonpromoteur(Falconietal.,1993).Laquantitédecetteprotéineatteintunniveaumaximumenphaseexponentielleà20000protéinespuisdécroîtjusqu'à40%deceniveauenfindephasestationnaire(AliAzametal.,1999).StpA(SuppressoroftdmutantphenotypeA)partage58%d'identitédanssaséquenceenacidesaminésavecH-NS(ZhangandBelfort,1992).StpAsembleavoirunmoded'actionetunprofild'expressionidentiqueàcelle-ci(AliAzametal.,1999;AzamandIshihama,1999;Zhangetal.,1996).Ellefixepréférentiellementl'ADNsurenroulénégativement(Keatchetal.,2005).Parmultimérisation,elleformeunfilamentrigidedeprotéinessurl'ADN,quiestalorsprotégédesdommages,etpeutpontercefilamentavecunADNnu,oucondenserdesfilamentsparpontageenprésencedemagnésium(Limetal.,2012).Cependant,StpAselieàl'ADNavecuneaffinitéquatreàsixfoissupérieureàcelled'H-NS(Sonnenfieldetal.,2001)etsafixationestinsensibleàl'effetdupH,delatempératureoudelaconcentrationensels.ElleprésenteégalementuneactivitédechaperonneARNinvitro(Zhangetal.,1995).MatP(MacrodomainterProtein)selieà22sitesmatSauseindelarégionterminalederéplication,suivantunKD=2-5nM.U neanalyse structure-fonction,baséesuruneexpériencededoublehybridebactérien,aétémenéeparallèlementàlarésolutionducristaldelaprotéineMatP.Elleprésente3domainesdistincts:undomainedefixationàmatS,undomainededimérisation(motifRibbon-Helix-Helix),etundomainecoiled-coildanslarégionC-terminale(Dupaigneetal.,2012).CedernierestimpliquédanslaformationdetétramèresdeMatPetdansl'interactiondeMatPaveclamachineriededivision(Espélietal.,2012).MatPsefixeendimèreausitematSetpliel'ADNsuivantunanglede8°.DesanalysesdediffractionderayonXauxpetitsangles(SAXS)montrentégalementquecettefixationinduitunchangementdeconformationdudimèrepermettantlatétramérisationparlesdomainesC-terminauxcoiled-coildesdimères.Desanalysesdemicros copieàforceatomiq uemontrentqueMatPestcapabledeformerdesbouclesenfixantdeuxsitesmatSéloignés,exceptédanslemutantdetétramérisation(Dupaigneetal.,2012).OnsupposedoncqueMatPestcapabledeponterdeuxsitesmatSpartétramérisation(figure14).
41SeqAainitialementétéidentifiéecommeunfacteurséquestrantl'originederéplicationoriCchezE.coli,enempêchantlaformationducomplexeouvertderéplicationetl'expressiondufacteurd'initiationdelaréplicationDnaA.LaprotéineSeqAcontribueàrégulerlaréplicationduchrom osomeenempêchantlaré-initiationauxoriginesnouv ellementrépliquéespendantenvironuntierscycle(Luetal.,1994).Elles'associeaugrandsillondesséquencesGATCdoublebr inquisonthémi-méthyléessurleAaprèsrép licationmaisau ssil'ADN complètementméthyléàoriCquiprésente11sitesGATC(Guarnéetal.,2002;Slateretal.,1995).SeqAetlaDamméthytransféraseseraientencompétitionpourlafixationàl'ADN(Waldminghausetal.,2012).SeqAsefixestablementendimèreàdeuxséquencesGATCparsapartieC-terminale,defaçoncoopérative,ensemultimérisantparsapartieN-terminale(Guarnéetal.,2005).Lafixationd'unerégiondeplusde100kb,àunedistancede300à400kbdelafourche(Helgesenetal.,2015).Aussi,ilestsupposéqueSeqApromeutlepontageintermoléculairedel'ADN,àlaman ièred'unecohésine, enmaintenantassembléeslesmoléculesfillesnouvellementrépliquéesinvitro(Fossumetal.,2007)etinvivo(Joshietal.,2013)(figure15).Environ1000moléculesdeSeqAsontprésentesdanslacelluleenphaseexponentielle(Slateretal.,1995).d) FilamentsetagrégatsLesprotéinesquipolymérisentsousformedefilamentssurl'ADNouquis'ys'agrègent,ontgénéralementunrôleprotecteur:ellesplusspécifiquementexpriméesdansdesconditionsdelétalitécellulaire.DnaA(DNA-bindingproteinA)liéeàl'ATPsefixedefaçoncoopérativeàdesboîtesRouDnaAde9pb5'-TTAA/TNCACAsuivantunKDde4à20nMdanslarégiond'oriCetd'originesderéplicationdeplasmidestelspSC101,pBR322etColE1(Fulleretal.,1984;SchaperandMesser,1995).Pourinitierlaréplication,elles'oligomériseparsondomaineN-terminaldefaçonATP-dépendante(Sekimizuetal.,1987;Simmonsetal.,2003)stimuléeparlefacteurDiaA(Keyamuraetal.,2007)etouvreladoublehéliced'ADNenl'étirant,s'associantàl'ADNsimplebrin(Duderstadtetal.,2011)(figure16).Cetteprotéine joueaussiunrôled'activateurouderépresseurdesatranscriptionetdecelledenombreuxautresgènes,ycomprisdanslarégionOri(Atlungetal.,1985;Braunetal.,1985).LaquantitéintracellulairedeDnaAestde1000à2000moléculesparcellule(Sekimizuetal.,1988),atteignantson
42Figure17:ag régationdel'ADNparDps.A:représentationdelastructureducrista ld'unh omo-dodécamèredeDpsdeE.colirésoluà2,60Å(PDB1F33)(Luoetal,unpublished).B:micrographesdeforceatomiquemontrantl'auto-agrégationdeDpscondensantsimultanémentl'ADN(d'aprèsCecietal,2004).AB100nm
43maximumenmilieudephaseexponentielle(AliAzametal.,1999).CbpA(CurvedDNAbindingproteinA)estuneco-chaperonneconservéedanslaplupartdesγ-protéobactéries(Yamashinoetal.,1994).LaprotéineCbpAsefixedefaçonpréférentielleàde l'ADNco urbéetricheenA Tsousformed'homod imère fonctionnnel(AzamandIshihama,1999;Yamadaetal.,1990).Ellefixelepetitsillondel'ADNetformedesagrégats(Chintakayalaetal.,2015).CbpAcontribueàlacroissanceàbasseetàhautetempérature.ElleformeuncomplexeaveclaprotéinedemodulationdechaperonneCbpMquiinhibealorssonactivitédeco-chaperonneenbloquantsadimérisationainsiquesafixationàl'ADN(Birdetal.,2006).LatranscriptiondeCbpAestsouscontrôledeLrpetRpoS(ChenowethandWickner,2008)etrépriméeparFis(Chintakayalaetal.,2013).Elles'accumulejusqu'àplusde2500copiesenfindephasestationnaire(AliAzametal.,1999).Dps(DNA-bindingproteinfromstarvedcells)estuneprotéinequiprotègel'ADNens'yfixantdefaçonaspécifiqueencasdecarence,destressnutritionneloudestressoxydatif,doncnotammentenphasestationnaire(Almirónetal.,1992).Cetteprotéinedetypeferritines'oligomérisesousformededodécamère(AzamandIshihama,1999).Lechromosomeestprotégédesdommagesoxyd atifsparunco-cristaldedod écamèredeDpset d'ADN,hautementstableetordonnéparlaséquestrationdesionsFe2+dumilieuintracellulaireetempêchantlaproductionderadicauxoxygénés(Grantetal.,1998;Wolfetal.,1999)(figure17A).Dpsprotègeégalementdustressoxydatifenphaseexponentielle,desdommagesUVetdesirradiations,delatoxicitéducuivre,duferetdustressthermique(NairandFinkel,2004).Ellecondensel'ADNviasarégionN-terminaleenformantdesagrégatspardiminutiondupH(Cecietal.,2004)(figure17B).LatranscriptiondedpsenphasestationnairerequiertlefacteurRpoSdelatranscriptionetIHF(Almirónetal.,1992)alorsqu'elleestrépriméeparFisetH-NS(Graingeretal.,2008).Cetteprotéineestdoncprésenteenunefaiblequantitéenphas eexponentielle (6000)quiaugmenteprogressivementpour atteindreunniveaumaximalenfindephasestationnaire(180000)(AliAzametal.,1999).Hfq(HostFactorforphageQbeta)aétéidentifiéecommelefacteurdel'hôterequispourlaréplicationduphageARNQβsouslaformed'unhexamèreàdel'ADNsimpleoudoublebrinmaisplusspécifiquementàdel'ARN(FranzedeFernandezetal.,1972).L'inactivationdeHfq
44Figure18: organisationtransversaleduchromosomed'E.coli danslacel luleoùlep ositionne mentphysiquedeslocisuit leurposition nementgénomique. A:représentationschématiquedelacarted'organisationdesdomainesOri(vert)autourdel'originederéplicationoriCetTer(bleu)autourdesitederésolutiondesdimèresdechrom osomesdifdanslechro mosomed' E.coli .Lespositi onsindiquéescorrespondentaux22sitesciblésparlessondesfluorescentesduFISH.B:représentationschématiquedel'orientationduchromosomedanslacellule:lesdomainesOri(O,vert)etTer(T,bleu)sontàchaquepôledelanouvellecellule(haut).Avantd'initierlaréplication,ledomaineOrimigreaucentredelacellule,suividudomaineTer,plaçanttransversalementlechromosomedanslacellulependantlamajeurepartieducyclecellulaire(d'aprèsNikietal,2000).AB
45mèneàladiminutiondelacroissance,àunesensibilitéauxUV,auxagentsoxydantsetauxchocsosmotiques(Tsuietal.,1994)enraisondesonimplicationdanslaréponseaustressréguléeparlespetitsARNrégulateurssARNs(Storzetal.,2011).HfqestunechaperonneARNquifacilitel'appareillementdessARNssurlarégion3'desARNmciblespourréprimerleurtraduction(Schupplietal.,1997)telsceluidu gènecodantlefac teursigmarpoS(Muffleretal.,1996)etceuxdesgènesderéparationdel'ADN,mutSetmutH(Tsuietal.,1996).Safixationpermetaussideprotégerl'ARNmdeladégradation(Folichonetal.,2003).Parailleur s,Hfqestcapabledefixerl' ADNcourb é(AzamandIshiham a,1999)etdecondenserl'ADNparsondomaineC-terminalendiminuantsalongueurdepersistance(Jiangetal.,2015).Onmesure55000moléculesdeHfqenphaseexponentielle,dontlaquantitédécroîtdèslatransitionenphasestationnaire(AliAzametal.,1999).4) Lesmacro-domainesAu-dessusdel'échellenucléoprotéique,lechromosomed'E.coliestpartitionnéenrégionsisoléesgénétiquement,dansdesespacescellulairesdéfinis.a) LesrégionsOrietTerL'arrangementspatialdeschromosomespeutêtrepartiellementreconstruitparsuividespositionsspatialesdelocichromosomiquesàl'aidedelamicroscopieàfluorescence.L'unedespremière sméthodesdéveloppéespourdetellesv isualisatio nsaétél'Hybridation FluorescenteInSitu(FISH).LeFISHimpliquelaperméabilisationpartielledescellulessuiviedel'additi ondesondesd'ADNmarquées parfluo rescencequis'hybrid entauxrégionscomplémentairesduchromosome.L'observationparmicroscopieàépi-fluorescencepermetalorsderévélerlalocalisationsubcellulairedulocusmarqué.Nikietsescollaborateursontainsiétudiélalocalisationde22segmentsd'ADNchromosomiqueschezE.coliparFISH(Nikietal.,2000).Leurstravauxontrévéléqueleslociobservéssontdisposésàpeuprèsdansl'ordredanslequelilssontpositi onnésdansl egénome,in diquantunestructurechromosomiquehautementorganisée.Deux"macrodomaines»regr oupantdeslociquicolocalisenttrèssouvent,correspondantà40%duchromosome,ontétéains irecens és(figure18A).LemacrodomaineOricomprendleslociprochesdel'originederéplicationoriC(de80à100 min),enétantcentréautourd'unes équencecentrom ériquemigS.Cette séquencede25pbestimpliquéeencisdanslepositionnementbipolaired'oriC(Yamaichi
46Figure19:or ganisationduchromosomed'E.coli enquat rerégionsisoléesgénét iquementetspatialement.A:représentationschématiquedelacarted'interactionsgénétiquesduchromosomed'E.coli,reflétantlamesurede211fréquencesderecombinaisonentresitesattRetattLdusystèmeIntdeλ.Lesquatre macrodomainesOri, Ter,RightetLeftsontisolésgénétiqueme nt,contraireme ntauxdeuxrégionsnonstructuréesNSLetNSR(d'aprèsValensetal,2004).B:représentationgraphiquedeladistanceparcourueparlesmarqueursParB-GFPenfonctiondeleurpositionsurlechromosomed'E.coli,reflétantlamobilitédesdifférentsmacrodomaines.Lesmarqueursdesrégionsnonstructuréessontbeaucoupplusmobilesquelesmarqueursinsérésdanslesmacrodomaines(d'aprèsEspelietal,2008).ABPositionsurlechromosomedepuisoriCDistanceparcourue(.0,1μm2)
47andNiki,2004).OpposéaumacrodomaineOri,lemacrodomaineTerregroupequantàluileslociprochesduterminusderéplication(de25à45min),enétantcentrésurlesitederésolutiondesdimèr esdechrom osomeappelédif(deletion -inducedfilamentation).Ces macrodomainesnesontpasstatiques;ilssemblentmontrerunedynamiquespécifiqueaucoursducyclecellulaire(figure18B).b) Desrégionsisoléesgénétiquementetspatialement:lesmacrodomainesDesexpérie ncesderepè resgénéti quesontrévéléquelec hromosomed'E.coliest"compartimenté»ensixzones,parmilesquelleslesmacrodomainesOrietTerdécouvertsparFISH(Valensetal.,2004).Cetravailaconsistéenl'analysedesprobabilitésd'interactiondel'ADN àlonguedistance,r epo santsurlacapacitédusy stèmederecombinaisonspécifiquedesiteducoliphageλ,àenregistrercescommunications.Danscesystème,lesfréquencesdecollisionainsimesuréesauseind'unepopulationdecellulesdoiventrefléterlesdistancesinter-locus,bienqu'ellesnesoientpastoujourséquivalentes.DessitesattRetattLontétéinsérésàdemultiplespositionssurlechromosomed'E.colietlaréactionderecombinaisonentreunsiteattRetuns iteattLaensuiteétémesuréepo ur211combinaisonsdedistance,aprèsinductiondelarecombinasedeλ.Parcetest,ilaétéobservéquelessitesapp artenantàdeuxm acrodomaines différentsinterag issenttrèsfaiblement.Quatremacrodomaines(O ri,Lef t,RightetTer)on tétédéfini scommedes territoireschromosomiquesisolésgénétiquement.LesmacrodomainesOrietTersesontrévéléstrèssimilairesà ceuxdéfinis parNikietsescollègues.Deu xd omainessupplémentaires,lesdomainesRightetLeft,deuxautresrégionsde0,7MbflanquantsleTer,nemontrentpasd'interactionsniavecl'Ori,niavecleTer.Enfin,deuxrégionsnonstructurées,c'estàdirecapablesderecombineraveclesmacrodomainesflanquants,ontétédétectées.Ils'agitdesrégionsNSR(NonStructuredRight)de0,9MbetNSL(NonstructuredLeft)de0,6Mb(figure19A).Cesterritoiresgénétiquesontensuiteétésuivisaucoursducycledansl'espacecellulaire.LafixationdescellulesenFISHempêchanttoutsuiviaucoursdutemps,unetechniquebaséesurlesdifférentssystèmesderépresseur/opérateurdécritschezlesbactéries,telsLacI/lacO,TetR/tetO,CI/Pλ,ParB/parS,aétéutilisée(FeketeandChattoraj,2005;Lauetal.,2003;Robinettetal.,1996) .Ces systèmesson tappelésFROS(SystèmeOpérateur-RépresseurFluorescent):unnombredéfinidesitesADNspécifiquesouOpérateurs,sontinsérésàcôté
49dulocus d'intérêtdansdes cellulesexprimantle"Répresseur»(ouprotéin efixantlaséquencespécifique)fusionnéàuneprotéinefluorescente.Cettefixationproduitunfocusdiscretmaisvisibleparmicroscopieàfluorescencequipeutêtresuiviaucoursducyclecellulaire.Cettetechniqueapermisderévélerladimensionspatialedumacrodomaine.Afindesuivrelesquatremacrodomainesaucoursducyclecellulaire,dessitesparSontétéinsérésà35positionstou tau longduc hromosome.Reconnusparlap rotéinePar B,fusionnéeàlaprotéinefluorescenteGFP,cesmarqueursinternesauxmacrodomainesontpermisdelocalisercesderniersetdevisualiserleurdynamiqueetleurségrégation.LesmarqueurssituésdanslesmacrodomainesmontrentunemobilitébienmoinsimportantequeceuxsituésdanslesrégionsNS(Espelietal.,2008)(figure19B).Lesmacrodomainesdéfinisgénétiquementprésententchacununechorégraphiespécifiqueindiquantquelesmacrodomainessontnonseulementdesrégionsisoléesgénétiquementmaisqu'ellessontenplus confinéesdansdese spacescellulairesprécis.Laségr égationdeschromosomessembleavoirlieuentroisétapes:lesMDOri,etlesdeuxrégionsNSségrégentrapidementetenmêmetemps.PuislesMDRightetLeftseséparentprogressivementensuivantlacartedugé nome.Enfin,lemacrodomaineTerestr apidementség régéjusteavantladivi sioncellulaire,aprèsunelonguepériodedeco-localisationenconditiondecroissancelente.Ensebasantsurl'hypothèsequ'unmacrodomaineestdéterminéparlaliaisond'unfacteuràunsitespécifiquerépanduexceptionnell ementdanslarégiond' intérêt,lelaboratoi red'accueilamisenévidenceune"signaturededomaine»grâceàlacollaborationavecunlaboratoiredebio-informatique.Une séquencecon sensusde13pbGTGACRNYGTC ACappeléematS(macrodomainterSequence)aeneffetétéidentifiée(figure20B)ettrouvée23foisentrelescoordonnées1135kbet1900kb,correspondantenvironàl'étenduedumacrodomaineTerdécritprécédemment(1220kbà1900kbdans(Espelietal.,2008)).CetteséquencepalindromiqueestreconnueparlaprotéineMatP(Mercieretal.,2008).UneexpériencedeChIP-seqaprécisé qu eMatPsefixeraità22sites matSausein dumacrodomaineTer(Dupaigneetal.,2012)(figure20A).a) OrganisationduchromosomeenbrasderéplicationChezlesbacté ries,lechr omosomeétantcirculaire,laré plication del'ADNestinitiéeàl'origineuniqueoriCetproc èdedefaçonbidirec tionnellesuivantdeuxfourchesderéplication(McKennaetMasters,Natur e,1972).Lecomplexederéplication dechaque
50Figure21:laréplicationbi-directionnelleduchromosomed'E.coli .A:représentationschématiquedesfour chesderéplicationdroite(r ouge)etgauche(bleu)aprèsinitiationdelaréplicationàoriC,avançantjusqu'ausitedeterminaisonter.B:représentationschématiquedelacartederépartitiondesmacrodomaines,suivantlaséparationdesfourchesderéplicationlocaliséesaucentreetquiimpliquelaconstitutiond'unréplichoredroitetd'unréplichoregauche(d'aprèsSobetzkoetal,2012).AoriCRéplichoregaucheReplichoredroitB
51fourchefaitavancercelle-cijusqu'auxsitesdeterminaisonter(Hidakaetal,Cell,1988)(figure21A).L'observationenmicroscopieàfluorescencedelasous-unitéenzymatiquePolCdureplisomedeB.subtilusfusionnéeàlaprotéinedefluorescenceverteGFPmontrequelaréplicationestinitiéeetsepoursuitenunpointfixe,aumilieudelacellule(LemonandGrossman,1998).Celasuggèrequelemouvementdunucléoïde,doncsapositiondanslacellule,dépenddecette"usineàréplication».ChezE.coli,lesuividelasous-unitéDnaXmontredeuxcomplexesderéplicationquicolocalisentaumilieudelacelluleàl'initiation,puissedupliquentetdeviennentextrêmementdynamiques(BatesandKleckner,2005).Laséparationdesreplisomes contribueàlaformationd'uneasymétr iedesbraschromosomiquesderéplication(oureplichores)gaucheetdroitetainsiàleurségrégationprogressivepartranslationaucoursdelaréplication(Whiteetal.,2008)(figure21B).b) Orientationduchromosomesuivantl'axed'élongationcellulaireDelamêmefaçon,laconfigurationglobaleduchromosomededifférentsorganismestelsB.subtilis,E.coli,Caulobactercrescentus,PseudomonasaeruginosaaétéétudiéeparFROS,enutilisantlesystèmelacO,séquencereconnueparlaproté ined efusionlacI-GFP,oulesystèmeparS/ParBettetR/TetOchezP.aerugi nosa.D'aprèscestravaux,de uxtypesd'organisationdesbraschromosomiquesderéplicationontpuêtremisenévidence.ChezB.subtilisencoursderéplication,quatrelociontétéanalysés,unlociprochedel'origine,unautreproched uterminusderéplication,e tdeuxautresaumi lieudechaqueb raschromosomique.Cetravailmontrequelesoriginesdupliquéessesituentàchaquepremierquartdelacellule(prèsdupôledelacellule),leterminusétantaumilieudelacelluleetlesbraschromosomiquesgaucheetdroitétantdisposéslongitudinalementparrapportàl'axed'élongationdelacellule(entreleterminusetchaqueorigine)enconservantl'ordredesgènes(Telemanetal.,1998;Webbetal.,1997).Uneanalysesimilaireréaliséeavecdescellulesd'E.coliencroissancelente(oùlenombredechromosomeestlimité),arévéléuneorganisationglobaletrèsdifférente.L'origineetleterminusdelaréplicationsontprèsducentredelacellul eetlesbraschro mosomiquesgaucheetdroitpl acésdanschaquecompartimentopposédelacellule(Wangetal.,2006).Enfin,uneétudeportantsur112lociduchr omosomedeC.crescentusamo ntré,commechezE.colietB.subtili s,un econservationentrelacartegénétiqueetlalocalisationcellulaire,l'origineetleterminusderéplicationétantplacésàchaquepôledelacellule(Viollieretal.,2004).Lesbactériesquiont
52Figure22:représentationschématiquedesdeuxmodèlesd'orientationduchromosomeprocaryoteencoursderéplica tionsuiv antl'axed'élongationdelacell ule.A:re présentationschématiquedeladispositiontransversaleduchromo somed'E.coli .B:re présentationschématiquedeladispositionlongitudinaleduchromosomedeC.crescentus.Enbas,sontreprésentésleschromosomesrespectifsdesdeuxespèces,lespartiesrougeetbleucorrespondantauxcompartimentscellulairesdesréplichoresdroitetgaucherespectivement(d'aprèsReyes-Lamotheetal,2012).ABFigure23:capturedeconformationdechromosome.A:représentationschématiquedesméthodesde3C,5CetH i-Cdo ntleprincipe estiden tique(a)maisquidiffère ntparlate chniqued'isolationdesinteractionsgénomiquesetparlaquantitétestée(b). B:carted'interac tionsreprésentantlamatriced'interactionsdesdiffére ntsfragme ntsgénomiquesdontlesjonctions ontétéséquençéeschezC.crescentus(d'aprèsLeetal,2013).Laprobabilitéd'interactionestreprésentéeparlegradientdecouleur:pluslacouleurestfoncée,pluslaprobabilitéd'interactiondesdeuxsegmentsestélevée.Aussi,sansfacteurderappro chementde deuxloc igénomiques, laprobabilitéd'interactiondépenddeladi stance. Ladiagonalecaractérisel'interactiondeslociavecleurvoisinage.Lasecondediagonale,moinsprononcée,confirmel'organisationlongitudinalede C.cres centus.Ch ezE.coli ,seulecettediagonaleapparaitrait(d'aprèsLeetLaub,2014).Cross-linkRestrictionLigationPurificationBiotinyléA(b)(a)BPositionsurlegénome(kb)Positionsurlegénome(kb)
53uneorganisati onchromosomiquesimilaire àcelled'E.coliontuneor ganisationdite "transversale»;lesbactériesdontl'organisationduchromosomeestsimilaireàcelledeB.subtilisoudeC.crescentusontuneorganisationdite"longitudinale»(figure22).Uneétuderécentesurl'organisationduchromosomedeP.aeruginosamontrequesaconfigurationestdetypelo ngitudinal(Vallet-GelyandBoccard, 2013).Cesdeuxconfigurationsontétévalidéesparl estechni quesrécentesdeCapture deConf ormationdeChromoso me(3C) misesaupoin tchezleseucary otes(Dekkeretal.,2002)avantd'être appliquéesauxprocaryotes(Umbargeretal.,2011).LaCapturedeConformationdeChromosomereposesurletraitementdescellulesauformaldéhyde,permettantderéticuler,oudefixer,lescomplexesprotéines-ADN,préservantainsilaconformationduchromosome(figure23A).Lematérielsubitensuiteuneétapededigestionenzymatique,puisuneréactiondeligationenmilieudiluéfavorisantlaligati ondesite sréticulé sauseind'unmêmecomp lexe.Cesévènementsdeligationunissentdoncdeslociquiétaientspatialementprocheslorsdelafixationdescellulesparleformaldéhyde.Lesjonctionsdeligationsontensuitepurifiéespourêtretestées.Latechniquede3CutiliselaPCRpourtesterdesjonctionsd'intérêt.Désormais,lestechniquesdérivéesdu3C,tellesle5CetleHi-Csontprincipalementutiliséespuisqu'ellesoffrentunemeilleurerésolution.Le5CfaitappelàlaPCRmultiplexéeetauséquençagedemultiplestypesdejonctio ns.Latech niquedeHi-Ccomp orteuneétaped'incorporationdenucléotidesbiotinylésavan tlaligation ,permettantdeprécip iterseulementlesrégionsliguéesgrâceàdesbillesdestreptavidine.Cesrégionssontensuiteséquencéesàhautdébit.Aprèstraitementdesséquencesobtenues,le5CetleHi-Crévèlentl'identitédenombreuxsitesquiinteragissentavecunefréquencedonnéeetquisontalorsreprésentéessousformedecarted'inte ractionsendeux dimensions(figure23B).Larésolutionobtenuedépenddeladistribution,dunombredesitesderestrictionetdelaprofondeurdeséquençageréalisée.Lapremièreexpériencede5CbactérienfutréaliséesurdescellulesdeC.crescentus(Umbargeretal.,2011).Cettedernièreprésentel'avantage,àl'étatmobile, denepasserépliquern idesedivis er,permettantdesynchroniser naturellementle scellules. L'analysede169#170inte racti onsarevelé ,à13 kbderésolution,que leslociin teragissenttypiquementleplusf ortementavecd'au treslociàmoinsde100kbdumêmebraschromosomique,etmontrédesinteractionsplusfaiblesavecdeslocisituésenvironàlamêmepositionmaissurlebrasderéplicationopposé.Cettecarted'interactionrenforcelesrésultatsobtenusparFISHetparFROS,montrantquel'originede
54Figure24:représentation3DdelafixationdeprotéinesNAPsdefusionfluorescentessurlenucléoïdeparmicroscopieàfluorescencesurcelluleunique.A:profildefixationdeHU(HupA-mCherry).Lacelluleprésenteunconfinementlong it udinalparcroissancedesdeuxréplicho res(RH:re plichoredroit,LH:replichoregauche).B:profildefixationde Fis-GFP.Lesdeux imagesmontrentuneformeellipsoidaleincurvéedunucléoïde(d'aprèsKleckneretal,2014).AB
55C.crescentusestancréeàunpôledelacellule,lesdeuxbrasderéplicationétantorientéslongitudinalementparrapportàl'axedelacellule(figure22B).Cesdonnéesde5Contaussiétéutiliséesafindemodéliserlaconfigurationglobaleduchromosomeensupposantquelesfréquencesd'interactionreflètentladistancephysiqueentrelocietencherchanttouteslesconformationssatisfaisantcescontraintesspatialesétablies.Lamodélisationrésultantesuggèrequedeuxbraschromosomiquesadoptentuneformehélicoïdale,enétantlégèrementtournésl'unautourdel'autre.Delamêmefaçon,lareprésentation3DdelafixationdesprotéinesNAPsdefusionHup1-mCherry(Fisheretal.,2013)etFis-GFP(HadizadehYazdietal.,2012),parmicroscopieàfluorescencesurcelluleunique,amontréquelenucléoïdeauneformeglobaled'ellipseincurvée(figure24).5) LacohésiondeschromosomesfrèresLapéri odedecolocalisationdes locinouv ellementrépliquésestdéfini ecomme étantl'intervalledetempsentrelaréplicationdulocusetlaséparationvisuelledesdeuxlocifrères,dépendantdescondition sdecroissance(Adachietal.,2008).Demême, cettepérioden'estpasconstante lelongduchromoso med'E.coli.Lacolocalisationpourraitcorrespondreàuneinteractionphysiqueou"cohésion»(Lesterlinetal.,2012).Lorsquelechromosomeestpresqueentièrementrépliqué,lacohésionentrechromosomesfrèresestrompuesimultanémentàcesdifférentsloci(Joshietal.,2011;Sunakoetal.,2001).Plusieursfacteursdecohésionontétéproposés,enraisondeleureffetsurletempsdecolocalisationdeschromosomes.a) MukBChezE.coli,l'in activationdugènemukBentraineunphénotypethermosensibleetàtempératurepermissive,untauxdecroissancetrèsréduitet15%decellulesanucléées(Nikietal.,1991).MukBestunhomologuestructuraldesprotéinesducomplexedeMaintenanceStructuraledesChromosomes(SMC),présentchezlesprotéobactéries.LesprotéinesSMCsontresuisespourlaségrégationdeschromosomesetlapoursuiteducyclecellulaire;ellessonttrèsconservéesparmilestroisrègnesduvivant(Hirano,2010;NasmythandHaering,2005).Chaquesous-unitédel'hétér odimèreS MC/MukBestconstituéed'unerégiond'hélicesenrouléesd'environ50nm,quiseplieauniveaud'undomaineglobulairecentral
56Figure25:re présentationschématiquedumodèledecohési onchromosomiqueintramoléculaire etintermoléculaireparSMC/MukB.A:représentationschématiquedelaco hésinede typeSMC /MukB(d'aprèsSohetal,2015).B:modèledepontagedesbrasderéplicationoudeschromosomesfrèresparSMCchezB.subtilis(d'aprèsBürmannetal,2015).AHomodimèredeSmCDomainescoiled-coiljuxtaposésDomainesdetête(ATPase)Domainescharnières-Dissolutiondu"tube»-Fixationàl'ADN-EngagementdelatêteADNConfiguration"tube»Configuration"ouverte»BCohésiondesbrasderéplicationchromosomiqueCohésiondeschromosomesfrèresFourchesderéplicationCohésiondesbrasderéplicationchromosomiqueFigure26:représentationschématiquedumodèledecohésiondesduplexesd'ADNhémiméthyléesparSeqA.Danscemodèle,SeqAsuitlafourchederéplication,étirantl'ADNentrelefocietlafourche,surprèsde400 kb.Arrivésa upremierqua rtduchromosomeencour sderé plication,cesfociSe qAseraientrelocalisésàoriCpourunnouveaucyclederéplication(d'aprèsHelgesenetal,2015).
57dedimérisation.L'hétérodimèreprésenteégalementundomainesglobulaireN-terminal/C-terminaldediméquotesdbs_dbs7.pdfusesText_13
[PDF] Chapitre 1