Le point sur lantifongigramme - Edimark
Cité 1 fois — Interprétation des CMI de Candida par les méthodes CLSI et EUCAST CMI (µg/ ml) Sensible Sensible
ANTIFONGIGRAMME
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DISQUES POUR ANTIFONGIGRAMME - Bio-Rad
POUR ANTIFONGIGRAMME 8- INTERPRETATION DES RESULTATS Mesurer
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Antifongigramme
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DISQUES POUR ANTIFONGIGRAMME
CARTOUCHE DE 50 DISQUES
ETUDE DE LA SENSIBILITE DES LEVURES DU GENRE CANDIDAAUX ANTIFONGIQUES DE LA FAMILLE DES AZOLES (FLUCONAZOLE, VORICONAZOLE)1- INTÉRÊT CLINIQUE
Ces disques permettent de déterminer la sensibilité des levures du genre Candidaaux agents antifongiques de la famille des azolés
(fluconazole, voriconazole), par une méthode de diffusion en milieu gélosé. Cette méthode suit une procédure standardisée publiée
par le CLSI/NCCLS (1).Les documents du CLSI/NCCLS les plus récents doivent être consultés pour les recommandations concernant la réalisation de
l'antifongigramme et son interprétation.2- PRINCIPEDes disques de papier imprégnés avec une concentration déterminée d'antifongique sont déposés à la surface du milieu MHGBM
(Mueller-Hinton +2% de glucose + 0,5µg/ml de bleu de méthylène) préalablement ensemencé avec un inoculum calibré, préparé à
partir d'une culture pure de la levure à tester. Un gradient de concentration d'antifongique s'établit autour des disques dans la
gélose. Après incubation, le diamètre des zones d'inhibition observées autour des disques permet de déduire les Concentrations
Minimum Inhibitrices (CMI) des différents antifongiques (fluconazole, voriconazole) pour la souche testée et la catégorisation
clinique : Résistant (R), Sensible-Dose Dépendant (S-DD), Sensible (S).3- PRÉSENTATIONLes disques, fabriqués à partir de papier absorbant de qualité supérieure ont 6,5 mm de diamètre et sont imprégnés d'antifongiques à des
concentrations précises.Ces disques sont clairement identifiés par un symbole comportant 3 lettres, suivi de la charge exprimée en µg, imprimé de chaque
côté du disque (tableau 1).Les disques Bio-Rad sont présentés en cartouche de 50 disques conditionnés en containers étanches contenant un deshydratant.
Tableau 1
4- CONSERVATIONLa date de péremption s'applique uniquement aux disques contenus dans des cartouches intactes conservées conformément aux
instructions du fabricant. La date de péremption et le numéro de lot figurent sur chaque conditionnement (cartouche et container).
• Les cartouches de disques doivent être conservées dans leur container entre + 2 et + 8°C au sec.
• Ramener les cartouches à température ambiante (18-30°C) avant de les ouvrir, remettre les cartouches inutilisées entre + 2 et + 8°C une
fois la pose des disques terminée. • Ne pas utiliser les disques dont la date de péremption est dépassée.• Si les cartouches sont conservées dans le distributeur après dépôt, il est nécéssaire de conserver celui-ci à + 2-8°C au sec avec des
dessicants à l'intérieur.• La stabilité des disques, de cartouches ouvertes placées dans des distributeurs a été validée en conditions de routine pendant 6 semaines.CHARGE DU DISQUE SYMBOLE CONDITIONNEMENT CODE PRODUIT
Fluconazole25 µg FCA25 1 x 50 disques62802
Voriconazole1 µg VCZ1 1 x 50 disques62803
IVD 25- MATÉRIEL NÉCESSAIRE NON FOURNI
• Distributeur de disques : 6 disques-code 50271, 8 disques-code 50270, 12-16 disques-code 50295
• Milieu de culture MHGBM (Mueller Hinton + 2% de glucose + 0,5µg/ml de bleu de méthylène)
• Milieu de culture : Sabouraud agar(code 56519), Sabouraud Chloramphenicol Gentamicin agar (code 63774)
• Öse • Pipettes Pasteur • Témoin d'opacité 0,5 McFarland • Souches fongiques pour le contrôle de qualité • Etuve à 35°C +/- 2°C• Matériel de laboratoire nécessaire pour la réalisation des antifongigrammes par la méthode de diffusion en milieu gélosé
6- PRÉCAUTIONS D'UTILISATION
Suivre les instructions d'utilisation des recommandations en vigueur (CLSI/NCCLS).Observer à tout moment les techniques et précautions en vigueur en matière de protection contre les dangers microbiologiques.
Après usage, stériliser les cultures et tout le matériel contaminé.7- MODE OPÉRATOIRE
a) Milieu de cultureLe référentiel M44-A du CLSI /NCCLS recommande l'utilisation du milieu MHGBM : Mueller-Hinton avec 2% de glucose et 0,5µg/ml de
bleu de méthylène.Après avoir préparé ce milieu de culture décrit dans le référentiel, en verser 25ml dans une boîte de Petri ronde de diamètre de 90mm ou
60ml dans une boîte de Petri carrée de 120mm.
Après solidification, sécher 15 minutes à 37°C avant utilisation. b) InoculumPréparer un inoculum standardisé à 0,5 McFarland à partir d'une culture pure de 24 heures, de levure du genre Candida, obtenue sur un
milieu d'isolement ( gélose Sabouraud agar, Sabouraud Chloramphenicol Gentamicin agar...).L'inoculum est préparé par mise en suspension dans du sérum physiologique stérile de l'équivalent de 5 colonies bien isolées de 1mm de
diamètre.Après homogénéisation de la suspension au vortex, ajuster l'opacité à 0,5 McFarland, soit par addition de sérum physiologique soit par
ajout de colonies supplémentaires. c) EnsemencementDans les 15 minutes suivant l'ajustement de l'inoculum à 0,5 McFarland, plonger un écouvillon de coton dans la suspension et tourner
plusieurs fois. Eliminer l'excès de liquide en pressant fortement l'écouvillon contre la paroi du tube au-dessus du niveau du liquide.
Après séchage du milieu 15 minutes à 37°C, ensemencer la totalité de la surface à l'aide de l'écouvillon selon la méthode standard.
Répéter l'écouvillonnage plusieurs fois en tournant la boîte de 60°C, de manière à s'assurer de l'homogénéité de la répartition de
l'inoculum sur toute la surface, y compris sur les bords.Laisser la boîte ouverte pendant 3 à 5 minutes (sans dépasser 15 minutes) de manière à laisser absorber l'excès d'humidité avant de
déposer les disques sur le milieu. d) Application des disques d'antifongiquesLes disques sont appliqués sur la gélose à l'aide d'un distributeur de disques (6 disques maximum sur une boîte ronde de 90mm de
diamètre, 9 disques maximum sur une boîte carrée de 120mm de diamètre). e) Incubation Incuber à 35+/- 2°C dans un délai de 15 minutes après l'application des disques.La durée d'incubation est de 24 heures.
f) Lecture-Interprétation Mesurer les diamètres des zones d'inhibition après 24 heures d'incubation. Placer la boîte sur fond noir non réfléchissant et effectuer la lecture sous une lampe. Si la culture est insuffisante après 24 heures d'incubation, ré-incuber la boîte 24 heures supplémentaires et effectuer la lecture à 48 heures.Les diamètres des zones d'inhibition doivent être mesurés jusqu'aux colonies de taille normale
(Figure1). En effet, il est possible d'observer sur les bords des zones d'inhibition, une inhibition partielle de la culture avec la présence de colonies de petite et de moyenne taille. Ces colonies ne correspondent pas à des mutants résistants et ne doivent pas être prises en compte pour la mesure des diamètres des zones d'inhibition.Figure1
g) Remarques• Echantillons : les disques ne doivent pas être utilisés pour un test directement sur échantillons biologiques
• Il est recommandé d'appliquer les bonnes pratiques de laboratoire8- INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
• Mesurer précisément les diamètres des zones d'inhibition,• La correspondance diamètre, Concentration Minimum Inhibitrice (C.M.I.) et catégorisation clinique : Résistant (R), Sensible-Dose
Dépendant (S-DD), Sensible (S) est résumée dans le tableau suivant : *Fluconazole : référentiel CLSI/NCCLS M44-A (1) Voriconazole : Artemis Disk Global Antifungal Surveillance Study (3)9- PERFORMANCES / CONTRÔLE QUALITÉ DU TEST
Le tableau suivant rassemble les limites acceptables des diamètres d'inhibition obtenus par diffusion en milieu gélosé pour les souches de
référence citées ci-après (1) :10-CONTRÔLE QUALITÉ DU FABRICANT
Tous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sont placés sous un système d'assurance qualité de la réception des
matières premières jusqu'à la commercialisation des produits finis. Chaque lot de produit fini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'est
commercialisé que s'il est conforme aux critères d'acceptation. La documentation relative à la production et au contrôle de chaque lot est
conservée par le fabricant.11-LIMITES D'UTILISATION
Les performances du test dépendent non seulement de l'activité des disques, mais également des facteurs tels que l'utilisation d'un inoculum
standardisé, de souches de contrôle appropriées, de milieux de culture adaptés pré-testés et d'une température de stockage des disques
adéquate.12-RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1. Method for Antifungal Disk Diffusion Susceptibility Testing of Yeasts ; Approved Guideline, M44-A, Vol. 24 N°15, NCCLS, May 2004.
2. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts ; Approved Standard-Second Edition, M27-A2, Vol. 22
N°.15, NCCLS, August 2002.
3. M.A. Pfaller, D.J. Diekema, M.G. Rinaldi, R. Barnes, B. Hu, A.V. Veselov, N. Tiraboshi, E. Nagy, D.L. Gibbs, and the Global Antifungal
Surveillance Group. 2005. Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Study : a 6.5- Year Analysis of Susceptibilities
of Candida and Other Yeast Species to Fluconazole and Voriconazole by Standardized Disk Diffusion Testing. J. Clin. Microbiol.43:
p. 5848-5859.4. M.A. Pfaller, D.J. Diekema, J.H. Rex, A. Espinel-Ingroff, E.M. Johnson, D. Andes, V. Chaturvedi, M.A Ghannoum, F.C. Odds, M.G. Rinaldi,
D.J. Sheehan, P. Troke, T.J. Walsh, and D.W. Warnock. 2006. Correlation of MIC with Outcome forCandidaSpecies Tested against
Voriconazole ; Analysis and Proposal for Interpretive Breakpoints. J.Clin. Microbiol. 44: p. 819-826.
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