[PDF] [PDF] La réparation des cassures double brin de lADN chez les mammifères

[PDF] La réparation des cassures double brin de lADN chez les mammifères

z La recombinaison méiotique et la mn 82 2 L'intégrité génomique ' connexion entre réparation des cassures double brin et cancer 84 2 1 Le NHEJ et la 

[PDF] La réparation de lADN par la recombinaison - Corpus UL

La réparation par recombinaison homologue implique de nombreux partenaires mais repose principalement sur la protéine RAD51 Le gène RAD51 (pour "DNA  

[PDF] Maintenance et variations du matériel génétique - UNF3S

Transpositions 1- Modèle procaryote 2- Recombinaison homologue des eucaryotes 3- Recombinaison homologue et réparation 4- Recombinaison intra- brin

[PDF] Réparation de cassures double brin et lésions complexes - SFRP

(ATM/ATR/OGG1/PARP/MRN/BRCA1/BRCA2/ KU etc ) Réparation des mésappariements Excision de bases Excision de nucléotides Recombinaison

[PDF] Université de Montréal - Thèse numérique - CORE

Homologous recombination and non-homologous end joining (NHEJ) are the La recombinaison homologue est un mode de réparation des bris double-brins

[PDF] Le système de réparation des mésappariements contrôle la - iPubli

réparation des mésappariements de l'ADN (mismatch-repair ou MMR), dont une fonction est d'inhiber les recombinaisons entre séquences imparfaitement 

[PDF] cours de stylistique française pdf

[PDF] synthèse translésionnelle

[PDF] fiches grammaire capes lettres modernes

[PDF] les risques stratégiques de l'entreprise

[PDF] gestion des risques entreprises pdf

[PDF] xeroderma pigmentosum

[PDF] cartographie des risques stratégiques

[PDF] gestion des risques danone

[PDF] risques environnementaux définition

[PDF] recombinaison non homologue

[PDF] types de risques environnementaux pdf

[PDF] recombinaison site spécifique

[PDF] recombinaison homologue plasmide

[PDF] prévention et gestion des risques environnementaux

[PDF] évaluation des risques environnementaux

UNIVERSITE PARIS XI

FACULTE DE MEDECINE PARIS-SUD

N°attribuépar labibliothèque

THESE

Pourobtenirle grade de

DOCTEURDE L'UNIVERSITE PARIS XI

Spécialité: Radiobiologie

Présentée et soutenue publiquement

par

FabienDELACOTE

1e21/11/02

Titre Laréparationdescassuresdoublebrindel'ADN chez les mammifères:intervention séquentiellede laRecombinaison

Non Homologuepuisde laRecombinaisonHomologue.

DirecteurdethèseM. Bernard S. Lopez

JURY

Pr. Jean-Marc Cosset

Président

Dr. Dora Papadopoulo

Rapporteur

Dr. Martine Defais

Rapporteur

Dr. Dietrich Averbeck

Examinateur

Dr. Bernard S. Lopez

Directeurdethèse

Ce travail a été réalisé dans le laboratoire d'étude des mécanismes de la régulation de

la recombinaison homologue(LMR),dirigé par le Dr. Bernard S.Lopez,au sein de l'unité mixte CEA/CNRS (UMR 217), auCEAde Fontenay-aux-Roses.

Je tiens à remercier les membres du Jury:

Le Pr. Jean-MarcCossetd'avoir bien voulu présider ce jury, Les Dr. Martine Defais et Dr. Dora Papadopoulo d'avoir aimablement accepté d'être rapporteur de cette thèse, Le Dr. Dietrich Averbeck d'avoir cordialement accepté d'être examinateur de cette thèse. Je remercie également Bernard S.Lopezde m'avoir accueilli dans son laboratoire et

d'avoir dirigé cette thèse. Je te remercie pour toutes nos conversations scientifiques et autres.

Elles m'ont permis de clarifier mon esprit et surtout de percevoir différemment le monde et la culture scientifique. Je tiens à témoigner ma reconnaissance à tous les membres actuels du laboratoire: Pascale Bertrand (bon courage pour ta nouvelle vie de mère chercheuse), Anne et Fayza (je vous fais confiance pour la suite), David (merci pour toutes tes aides), François (bonne chasse aux protéines), Josée (vive le NHEJ au sein duLMR)et enfin Yannick(welcome back).Je remercie également les membres passés duLMR:Sarah (tu es toujours ma collègue

préférée), Olivier (que la recherche soit avec toi), SylvieHuck(que la vie italienne t'apporte

ce que tu recherches), Brigitte (tu as intérêt à être là le jourJ),Franck et Thierry (promis je

passerai à Evry), Patrick et Stéphane (les SC comme moi), Hugues (fais gaffe à mon doigt), Guillaine et Elodie (bonne chance dans la vie professionnelle). A tous, je tiens à vous dire que j'ai apprécié nos relations techniques, pratiques (surtout le douloureux thème des commandes), scientifiques mais surtout nos relations humaines très amicales malgré les difficultés d'une vie en huit clos dans un laboratoire. Je tiens à remercier Jozo Delic pour m'avoir accueilli chaleureusement et de si bonne humeur dans le laboratoire de Laure Sabatier et pour m'avoir initié au test de la DNA-PK. remercie égalementLudo,Michèle et Luis pour leur disponibilité et leur gentillesse. Merci également à Francis Fabre qui a eu la patience et la gentillesse de répondre

mes questions parfois tortueuses. Bien que ces réponses ne m'aient pas forcément éclairé sur

le moment, elles m'ont véritablement servi à ma réflexion. Je remercie tous les membres anciens et actuels de son laboratoire Serge, Xavier, Eric, Christine, Laurence, Laurent, Thomas et Delphine pour leur accueil et leurs conseils scientifiques et surtout informatiques. Je témoigne mon extrême reconnaissance à tous ceux qui ont contribué à mon bon

équilibre moral lors de cette thèse. Je pense très fortement à mes amis rencontrés au CEA

Sarah et Pierrot (je vous serai éternellement reconnaissant de m'avoir fait rencontrer ma

moitié), Fabrice (merci de ta sincère amitié), Marie (j'ai toujours grand plaisir de discuter avec

toi), Olivier (merci pour les concerts partagés), Thierry et Amandine (quand est-ce qu'on se

voit?), Anne (j'ai apprécié ta terrasse), Marco (à bientôt sur Toulouse), Yoyo (vive le hackisac

et vogue la galère), Laurence (j'apprécie ton soutien), Flo (toujours aussi charmante). Spécial dedikas aux potes de Rennes: Bass & Cendrine, Loïc & Maloulou, Romain, Yaya, Vince, Tycoon, Roswell, Loblaze, Francky, Norton, Clint & Poche, Titi & Zaza&

Alice, Papy & Mumu, K1000 & Aymeric...

Un grand merci à ma famille. Stéphane je te remercie de m'avoir laissé ton appartement à ma disposition. Pierre-Yves, mille mercis pour la voiture qui m'a été

indispensable pour ce travail. Merci à mon père, à ma mère et à nouveau à mes frères d'avoir

cru en moi jusqu'au bout et d'avoir su me motiver à chaque instant de ma vie où cela était nécessaire. Enfin, je tiens tout particulièrement à remercier Anne Lise du fond de mon coeur qui

lui est entièrement dévoué. Grâce à toi, j'ai pu gagner en force, en confiance et en patience.

Merci de me soutenir dans mes moments de doute et d'être tout simplement à mes côtés.

Avant-propos: les dommages de l'ADN3

INTRODUCTION

7 A/ Les modèles de réparation des cassures double brin8

1. LES MODÈLESDU NHEJ8

IILES MODÈLESDE LA RH10

1.Conversiongéniqueet crossing over11

2.Lemodèlede Szotack11

3.Le SDSA (pour Synthetis-Dependent Strand Annealing)13

4.Le BIR (pour Break-Induced Replication)13

5.Le SSA (pour Single Strand Annealing)1.5

B/ Contrôle génétique des mécanismes de réparation des cassures double brin17

1. CONTRÔLE GÉNÉTIQUE DU NHEJ17

1.Le complexe DNA-PK17

1.1. L'hétérodimère Ku17

1.1.1. L'hétérodimérisation18

1.1.2. La fixation à l'ADN19

1.1.3. Le recrutement de la DNA-PKcs20

1.1.4. Le recrutement du complexe XRCC4 / Ligase IV21

1.1.5. Autres propriétés de Ku21

1.2. La DNA-PKcs23

1.2.1. Une serine/thréonine kinase de la famille des PI-3 kinases23

1.2.3. Les fonctions de l'activité kinase dans le mécanisme du NHEJ24

2.Le complexe Xrcc4/ligase IV24

2.1. Les protéines Xrcc4 et LigaselV25

2.2. Structure et propriété du complexe26

3.Les autres protéines impliquées dans le NHEJ26

3.1. Les protéines impliquées dans le NHEJ dépendant des complexes DNA-PK et XRCC4/ligaseIV27

3.1.1. Le complexe Mrel l /Rad50/Nbs l (Xrs2)27

3.1.2. La protéine WRN28

3.2. Un mécanisme NHEJ indépendant des complexes DNA-PK et Xrcc4/Ligase IV29

IICONTRÔLE GÉNÉTIQUE DE LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE30

1.Le groupe d'épistasie Rad5230

2.Rad52: la protéine directrice31

2.1. Implication dans la Recombinaison Homologue31

2.2. Propriétés biochimiques de Rad5231

2.3. Interactions protéiques32

3.Rad51: la protéine

de la conversion génique34

3.1. Implication dans le mécanisme de recombinaison homologue

3.2. Rad51 et la réaction d'invasion et d'échange de brin34

3.3. Interactions protéiques de Rad5 135

4.Les paralogues de Rad5136

4.1. Rad55 et Rad5737

4.2. Xrcc2, Xrcc3 et Rad51 B-D37

5.Rad54 et son homologue38

5.1. Implication dans le mécanisme de recombinaison homologue38

5.2. Rad54 membre de la famille des protéines SWF2/SW1239

6.LecomplexeMRN(X): maturation descassureset stabilisation deschromatides40

7.Autres protéines impliquées danslaRecombinaisonHomologue41

7.1. Desprotéinesde laréparationpar excision denucléotideset des mésappariemmentssont impliquées dansle

mécanismedu SSA41

7.2. La migration et larésolutiondesjonctionsde Holliday41

C/ Régulation des mécanismes de réparation des cassures double brin43

I.LE CHOIX DES MÉCANISMES DE RÉPARATION43

1.Le type d'organisme43

1.1. La levure et la recombinaison homologue44

1.2. Les cellules de mammifères et le NHEJ44

1.3. Le cas particulier des cellules DT40 de poulet45

2.Le stade de développement chez les mammi res45

3.Les protéines orientant la réparation46

3.1. La compétition entre Ku et Rad5246

3.2.Orientation par le complexe MRN(X)46

4.Le cycle cellulaire47

4.1. La Recombinaison Homologue et la phase fin de S/G247

4.2. Le NHEJ et la phase G 1/début de S chez les vertébrés48

IILES RÉPONSES AUX RADIATIONS IONISANTES49

1.Les senseurs des cassures double brin49

1.1. Implication d'ATM dans la signalisation des cassures double brin49

1.2. Autres protéines impliquées dans la signalisation51

1.2.1. La protéine ATR51

1.2.2. DNA-PKcs: réparation et/ou signalisation ?52

2.Les arrêts du cycle cellulaire53

2.1. Le point de contrôle GI/S: un des rôles dep5353

2.2. Le point de contrôle intra-S: deux mécanismes parallèles54

2.3. Le point de contrôle G2/M54

3.Modifications post-traductionnelles des protéines de réparation56

3.1. Phosphorylations desprotéinesde réparation56

3.1.1. La phosphorylation de Rad5l: activation ou inhibition de la RH ?56

3.1.2. La phosphorylation de la DNA-PKcs57

3.1.3. Brcal: une protéine â de multiple facettes57

3.1.4. Le complexe MRN(X)58

3.2. Re-localisation en foyer des protéines de réparation59

3.2.1. Les foyers Rad5159

3.2.2. Les foyers MRN60

3.3 Dégradation des protéines de réparation62

3.3.1. Dégradation de RadS l par apoptose et par ubiquitination62

3.3.2. Dégradation des protéines du NHEJ63

4 Conclusions63

D/ Rôles biologiques des facteurs et des mécanismes de réparation des CDB64

IROLES BIOLOGIQUES VARIÉS4

1.Le développement64

1.1. Le développement embryonnaire

1.2. Le développement neuronal embryonnaire66

1.3. Le développement lymphocytaire68

1.4. La croissance68

2.Le maintien et la structure des télomères6.9

2.1. Rôle de la recombinaison homologue69

2.2. Rôle des protéines du NHEJ et la structure des télomères70

2.3. Rôle du complexe MRN71

3.La réplication"..'.'..'.'..".".".".'.'.".".'.'..'.".'....'"."."."."."."."."."7/

3.1. La recombinaison homologue et la réplication deux processus étroitement liés7\

3.2. Ku et les origines de réplication"."."."."."."."."."."73

3.3.aroalet les arrêts de réplication7s

3.4. Le rôle du complexeMRNdans la réplication:prévenir des cassures74

4.La réparation des dommages induits par les radiations UV74

4.1.Latolérance aux dommages UV:Recombinaison homologue et SynthèsetruoulénioonoUc74

4.2.InhibitionduNERpar les protéinesduNHEJ78

5.Larnav^c,iprion''....''".".'77

II. LA RÉPARATION DES CASSURES DOUBLE BRIN:DIVERSITÉ GÉNÉTIQUE ET INTÉGRITÉ GÉNOMIQUE70

1. LA DIVERSITÉ GÉNÉTIQUE'..."...".".".".".".".".".".".".".".".".."..".'.".'....'70

1.1. La recombinaisonV(D)Jet leNHEJ"..'.'..."..".".".".".'."."."..".".."...."78

!zLa recombinaison méiotique et lamn82

2.L'intégrité génomique.'connexion entre réparation des cassures double brin et cancer84

2.1. LeNHEJet lamocontribuent au maintien de l'intégritédugeoomc84

2.1.1. Remaniementsgénomiques84

2.1.2. Implication duNHEJ'..."..."..."'..".'.".'..."'84

2.1.3.Implicationdelann86

2.1'4.Les protéines impliquées dans laneet leNHEJ87

2.1.5.Les mécanismesderéparation sourcesderemaniements génétiques88

2.2.Canceret dérégulation des mécanismes de réparation desCDB8B

22.1. L'Ataxietélangiectasie ~augmentation ou altération de lann?89

2.2.2.p53et la réparation desCDB"'....".'."....".".'...."'....'oy

2.2.3.Bcr-Abl:augmentation de lamnet inhibitionduNHEJo0

RESULTATS

94
AlUndéfaut duNHEJaugmente lmRH induite spécifiquement par lescassuresdouble l.STRATÉGIE''..'g5 I.Mesuresdela réparation dictée par l'homologie95 !.!.Substrat permettant de mesurer les fréquences de lann95

1.2. Formation des foyersmad51g0

2.Inactivationdumécanisme de8@9/J98

2.1. Utilisation de lignées déficientes pourxrue490

2.2. Utilisation de laWoumuomnaeo

2.3.Avantagesdecette stratégie99

II. UN DÉFAUT DUNHEJAUGMENTE LAB8INDUITE PAR LES RADIATIONS IONISANTES100 /.Un défautdeXrcc4augmente la RH induite par les y100

2.Un traitement à laWortmanninaugmente laRBinduite par les y101

3.Les effets de la délétion du gèneXRCC4et de laWortmanninsur la RH induite par les radiations

ionisantes sontépistatiques'.."....".."..'.".".".".".".".".".".".".'."."."."."..."189 DLETUDEDE L'EFFET DE L'INACTIVATIONDUNHEJSUR LES DIFFÉRENTS VOIESDELA RBoRÂCE À LA

STRATÉGIEI-SCEI'....''104

J.L'altération de la protéineXrcc4augmente laRBinduitepar 1-Scel/04

2.L'absence de la protéineXrcc4stimule la RH induitepar 1-Scelà un niveau moléculaire106

3.Un traitement à laWortmanninn'a pas d'effet sur laRBinduitepa,108

IV. L'INVALIDATIONDUGÈNEXRCC4NESTIMULENI LARHSPONTANÉENI LARHINDUITE PAR LES

1. Un défaut deXrcc4ne stimule pas laR/{spontanée109

2. Un défaut deXrcc4n'affecte pas le RH induite par lesDV110

V.L'INACTIVATIONDUNHEJSTIMULELAFORMATION DES FOYERS RADS 1 APRÈS UN STRESS CRÉANT DES CDBU!

1.Un défaut deXrcc4stimule la formation des foyersRad5linduits pary112

2.Un traitementùlaWortmanninaugmente la fréquence dexfoyersRad5linduits pary113

3.Une déficience deXrcc4ne stimule pas la formation des foyersRad5laprès une irradiationUV114

BI Un défaut duNHEJconduit h la réparation en G2 par la RH desCDBinduites en G1 [LES FOYERS RADSlsEFORMENT EN FINDES/G2APRÈSEXPOSITIONSAUX RAYONNEMENTS RAYONNEMENTS y SUR DES

CELLULES ASYNCHRONES)lb

1.Un défautduNHEJconduitùun arrêt prolongédu ü2après irradiation aux y//6

2.Corrélation entre la fin deS/G2et la formation des foyersRad5l118

3.Les foyersRad5lapparaissent en finde3YC2120

D.LESCDBNONRÉPARÉESENG}STIMULENT LARBINDUITE PAR LES RADIATIONS IONISANTES122 III. LESCDBNON RÉPARÉESEN G1 STIMULENT LAFORMATION DES FOYERSRADSiaemO2!24 J.Les foyersRad5lse forment lorsque les cellules sonten G2124

2.Les foyersRad5lsont induits plus tardivement lorsque les CM sont induites en G1125

I.STRATÉGIE127

I.Le choix de la sur-expression deRad52pour stimuler la RD127

2. Clonage duRAD52de hamster et lignées de sur-expression127

3. MesureduNH5J128

0LRAD52-V5NE STIMULE PAS LA RH INDUITE PAR LESCDB120

DISCUSSION

135

1.La nature des cassures double brin, le stade du développementetl'accessibilité de /'ADN136

2.Les effets de laWoxtnonnin.'inhibitiond'ATM et/ou deDNA-PKcs137

3.Les inactivations desdifférentes étapesduNHEJstimulent-elleslaRHinduite par une seule cassure?

4.LaDNA-PKcsest-elle nécessaire pour la réparation d'une seule cassure double brin?139

5.La stimulation de la RH par un défaut duNHEJest-elle spécifique des cassures double brin.?139

BI Réparation des cassures double brin et cycle cellulaire^.~.^~..~...~~...~140

1.LaB/fdépendante deRad5la lieu uniquement en findeS/G2chez les vertébrés140

2.LeNHEJest-il en compétition avec la RH enG2?/*V

3.Stimulation de la R/fpx,un défautduNHEJet un défautdela transitionG//S142

4.Efficacité des mécanismesderépmxzdon143

5.Modèle:une réparation séquentielle des cassures double brini44

C/Une stimulation de la RH inhibe-4-01e leNHEJ?146 Dl Conclusions~~^~~~~~^~~^~~^~`^^^..^~~^~~^^^^~^~~..~~~..~..~.~~~~.~0*.~~~U4 7

MATERIELS ET METHODES

148
A/ Techniques de biologie moléculaire et de biochimie149

1. LES CLONAGESDEGÈNES

149

1.LeclonagedugèneHsXRCC4149

2.LeclonagedugèneHsXRCC4-V5150

3.LeclonagedeRAD52-V5151

II.LA TECHNIQUE DE WESTERN BLOT151

III.LE TESTD'ACTIVITÉDE LA DNA-PK152

1.Préparationdesextraits protéiques152

2.ActivitéDNA-PKenrichie (ou"pull down assay")153

BI Techniques de culturecellulaire154

1. LIGNÉES CELLULAIRES UTILISÉES154

1.Lignées établieset conditions de culture154

2.Etablissement de clones stables155

II.MESUREDE LARECOMBINAISONHOMOLOGUE156

1.Larecombinaison spontanée:le test de fluctuation156

1.1. Principe du test de fluctuation156

1.2. Test de fluctuation de larecombinaison157

2.Recombinaison induitepar des agents génotoxiques158

2.1. Principe158

2.2. Expositionauxradiationsionisantes158

2.3. Expositionaux UV158

3.Recombinaison induitepar l'endonucléase 1-Scel159

3.1.Mesurede la RH par lafréquencedes clonesrésistants159

3.2.Mesurede la RH et du NHEJ auniveau moléculaire160

III.TRAITEMENTS LORSDELA CULTURECELLULAIRE160

1.Traitementà la Wortmannin161

2.Traitementau 1irdU161

III.MARQUAGEPAR IMMUNOFLUORESCENCE

1.Localisationcellulairedesprotéines fusionnéeà l'épitope V5162

2.Les foyers Rad51162

2.1.Marquageunique de Rad51163

2.2. Co-marquage Rad51 et BrdU13

3.Montage et observation des lames164

IV. SYNCHRONISATION ET ANALYSE DU CYCLECELLULAIRE164

1.Analyse du cyclecellulaire164

2.Synchronisation descellules165

BIBLIOGRAPHIE166

ARTICLES202

Liste des abréviations

8-oxoG 8-Oxoguanine

aa:acide aminé

ADN:acide désoxyribonucléique

ADNc:ADN codant

ALT:AlternativeLengtheningofTelomeres

A-T:AtaxieTélangiectasie

ATM:Ataxia Telangiectasia Mutated

ATP:adénosine triphosphate

ATPase:activité de dégradation deFATP

ATR: Ataxia Telangiectasia Rad3 related

BASC: Brcal-Associated genomeSurveillanceComplex

BER:réparation d'une base (Base ExcisionRepair) BIR:réplication induite par une cassure (BreakInduced Replication) BLM:maladie Bloom ou gène muté dans cette maladie BRCA:gène de prédisposition aux cancers du sein(BreastCancerAssociated) BRCT:séquenced'aaidentifiée dans la partieCterminale deBrcaldéfinissant un domaine d'association entre protéines(BRCA1 CTerminal)

BrdU: Bromodéoxyuridine

CHO:cellule d'ovaire de hamster chinois(ChineseHamsterOvarian)

CDB:Cassure Double Brin

CG:Conversion Génique

CS:ComplexeSynaptonémal

db:double brin

DNA-PK:protéine kinase dépendante de l'ADN

DNA-PKcs:sous unité catalytique de laDNA-PK

DSBR:réparation des cassures double brin (Double Strand BreakRepair) EJ:activité de ligature des extrémités d'uneCDB(EndJoining)

ES:cellules souches embryonnaires(EmbryonicStern)

FA:Fanconi Anemia

IP6: inositol hexakisphosphate

JC:Joint Codant

1

JS:Joint Signal

kb:kilobases kDa: kilodalton

LigIV: gène codant laLigaseIV

MEPS:longueur d'homologie minimum pour avoir de la RH efficace (Minimal Efficient

ProcessingSegment)

MJ:Molécule Jointe

MMR:réparation desmésappariements (MisMatch Repair) MRN(X):complexeMre 11 Rad5O Nbsl (Xrs2)chez les mammifères (chez S.cerervisiae) Nbsl:protéine mutée dans le syndrome deNijmegen NER:réparation par excision de nucléotide(NucleotideExcisionRepair) NHEJ:réparation par ligature des extrémités d'uneCDB(NonHomologousEndJoining) pb: paire de bases

PI3-kinase:phosphatidylinositol3 - kinase

RH:Recombinaison Homologue

RI:Radiations Ionisantes

RPA:protéine de réplication A(Replication ProteinA) RSS:Séquences signales de recombinaison(RecombinationSignalSequences) sb:simple brin SDSA:Synthèse dépendante de l'hybridation(Synthetis-DependentStrandAnnealing) SCE: Echangeentre chromatides soeurs(SisterChromatideExchange) SCID:phénotype de défaut immunitaire sévère(Severe Combined Immuno Defiency) SSA:dégradation hybridation (Single StrandAnnealing) TLS:Synthèse d'ADNtranslésionnelle (TransLesion Synthesis) UDS:synthèse d'ADN non programmée(Unschedule DNA Synthesis)

UV:Ultra Violet

WRN: maladie Werner ou gène muté dans cette maladie

XRCC: X-RayCrossComplementation

2

Avant-propos:les dommages de l'ADN

La molécule d'ADN est perpétuellement soumise à des dommages. Ceux-ci peuvent

être engendrés par des agents exogènes mais également de manière endogène (spontanément

ou induits lors de processus physiologiques). Plusieurs types de dommages de l'ADN existent: des mésappariements (bases non complémentaires appariées), des pontages (liaison entre bases) inter- ou intra-brins, des sites abasiques (perte d'une base), des modifications de base, des liaisons covalentes entre protéine et ADN, des cassures simple brin, des dommages

multiples localisées sur les deux brins (constitués à la fois de bases modifiées, de sites

abasiques et de cassures simples brin) et enfin des cassures double brin qui ont fait l'objet de cette étude. La réparation de ces dommages est essentielle au bon fonctionnement de la vie

cellulaire. Tous ces dommages sont réparés par différents mécanismes qui sont généralement

spécialisés pour un (ou plusieurs) type(s) de dommages. Quatre voies de réparation de l'ADN corrigent ces dommages: la réparation par excision de nucléotide (NER pourNucleotide ExcisionRepair),la réparation par excision de base (BER pour Base ExcisionRepair),la réparation des mésappariements(MMRpour MisMatchRepair)et enfin la réparation des cassures double brin (DSBR pour Double Strand BreakRepair). Il est important de signaler que ces mécanismes de réparation sont distincts de par leurs facteurs (protéines) impliqués. Cependant, le NER, le BER et le MMR utilisent des

étapes moléculaires présentant des similitudes (excision, synthèse). De plus en plus d'études

3

montrent que certains facteurs impliqués dans des mécanismes différents interagissent, ce qui

suggère que ces mécanismes de réparation sont probablement très intriqués. Les dommages peuvent être induits de manière spontanée par le métabolisme même de l'ADN. Par exemple, lors de la réplication, la polymérase peut commettre des erreurs

conduisant à des mésappariements. Les bases peuvent également être modifiées ou perdues

spontanément par différents processus biologiques comme par exemple la dépurination, la

dépyrimidination, ou la déamination. De plus, le métabolisme énergétique de la cellule

conduit à la formation de produits hautement réactifs vis-à-vis de l'ADN: les radicaux libres.

Ces derniers créent plusieurs types de dommages dont des changements de bases et des cassures simple brin. Les dommages peuvent également être induits par des agents exogènes comme les radiations ionisantes (naturelles, accidentelles ou radiothérapie), les radiations UV, ou des agents chimiques (fumée de cigarette, chimiothérapie). Les effets des radiations aux UV-C (254nm)et des radiations ionisantes seront présentés dans cet avant-propos puisque ces deux types de stress ont été utilisés dans cette étude. L'unité de mesure des radiations UV correspond à une énergie de 1 joule déposée sur une surface de 1 m2(Jlm2). Les radiations aux UV-C créent plusieurs types de dommages dont essentiellement des dimères de pyrimidine cyclobutane et des photoproduits (6-4) (tout deux constitués de deux bases pyrimidiques qui se lient de manière covalente). Les radiations UV induisent également des liaisons covalentes ADN-protéines et des cassures simple brin. Une 4 différence majeure entre les radiations UV et ionisantes est que ces dernières produisent directement des cassures double brin. L'unité de mesure des radiations ionisantes est le Gray (Gy) qui correspond une

énergie de 1 Joule absorbée par kilogramme de matière. Les radiations ionisantes agissent sur

l'ADN de deux façons: directement sur la molécule d'ADN ou indirectement par les radicaux libres formés par ionisation de la molécule d'eau. Comme cet élément est le constituant majoritaire de la cellule, ce mode d'action indirect est prédominant. Les radiations ionisantes

induisent un large spectre de lésions qui ont été quantifiées (cf. tableau 1). Les cassures

double brin sont supposés être les lésions létales majeures bien qu'elle ne soient pas les plus

fréquentes. Tableau1:Estimation des dommages de l'ADN induits par les radiations ionisantes pour une cellule de mammifère (d'après Pougetetal., 1999;Ward,1990)

Type de lésion

Nombre de lésions/cellule/Gy

Cassures simple brin

Dommages de bases

Liaisons covalentes ADN-protéine

150

Cassures double brin

40
1000
500
5 Les cassures double brin(CDB)sont réparées par deux mécanismes considérés comme distincts: •La Recombinaison Homologue (RH) qui nécessite l'utilisation d'une molécule d'ADN homologue à la molécule lésée. ▪La ligature des extrémités de la cassure n'utilisant pas ou peu d'homologie de séquences (NHEJ). L'objectif de cette étude est d'étudier la balance entre ces deux mécanismes de réparation distincts. L'introduction de cette thèse est divisée en quatre partie. La première présente les modèles moléculaires de réparation des cassures double brin permettant de comprendre

comment les molécules d'ADN sont utilisées pour être réparées. Par la suite, les protéines

catalysant ces deux mécanismes de réparation seront présentées. La troisième partie aborde la

régulation des voies de réparation desCDB.Enfin, la dernière partie montre les différentes

implications biologiques des systèmes de réparation desCDB:la diversité génétique et l'intégrité génomique. 6

INTRODUCTION

Al Les modèles de réparation des cassures

double brin

I.Les modèles du NHEJ

Ce mécanisme consiste à ligaturer les extrémités des cassures double brin de l'ADN. En fonction de la nature de ces dernières, il est possible de distinguer plusieurs mécanismes

(cf. figure 1). Les systèmes de réparation invitroet invivode plasmides linéarisés ont permis

d'élaborer ces modèles (pour revue Labhart, 1999 Smithetal., 2001). Lorsque les extrémités sont cohésives ou à bouts francs (figure 1A) la réparation consiste en une ligature de ces extrémités. Si les extrémités sont de même polarité mais non complémentaires le mécanisme de

NHEJ peut consister à hybrider de petites séquences homologues situées sur les extrémités

sortantes puis de remplir par polymérisation les brèches créés (figure 1B).quotesdbs_dbs10.pdfusesText_16