Um teste in vitro à sensibilidade das leveduras a agentes antifúngicos pode ser utilizado neste novo contexto (1, 4, 7, 8) FUNGITEST™ satisfaz este objectivo,
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FUNGITEST™ spełnia podane kryteria, jest łatwym do wykonania i interpretacji testem, który pozwala oznaczyć wrażliwość drożdżaków na preparaty
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FUNGITEST™ 60780
10 TESTES
DETERMINACÃO DA SENSIBILIDADE DAS LEVEDURAS A AGENTES ANTIGUNFICOS1- INTERESSE CLINICO
Nos últimos anos tem-se assistido ao aparecimento renovado de infecções a fungos, relacionadas com o número crescente de
indivíduos imunodeprimidos (9).Tal situação deve-se, essencialmente, ao uso de uma quimioterapia anti-cancerígena mais
agressiva, a tratamentos imunosupressivos mais intensos em receptores transplantados e ao uso de antibióticos de largo
espectro (2, 3).Este recrudescimento é acompanhado de um aumento no número de espécies patogénicas identificadas (10) e do emergir da
resistência a espécies anteriormente sensíveis.Um teste in vitro à sensibilidade das leveduras a agentes antifúngicos pode ser utilizado neste novo contexto (1, 4, 7, 8).
FUNGITEST™ satisfaz este objectivo, dado permitir a determi nação da sensibilidade das leveduras a agentes antifúngicos, deacordo com um método estandardizado derivado de um método de referência (5, 6), de fácil execução e interpretação.
2- PRINCIPIO
FUNGITEST™ é utilizado no estudo do crescimento de leveduras, na presença de 6 agentes antifúngicos a duas
concentrações diferentes, em meio de tampão RPMI 1640 modificado, na presença de um indicador redox.
A determinação do crescimento baseia-se na redução do indicador de coloração, que modifica o meio, de azul para rosa.
Quando o crescimento é inibido pelo agente antifúngico, o meio mantém-se azul. Este teste, apresentado sob a forma de uma microplaca de 16 poços, consiste em:2 poços de controlo de crescimento
12 poços contendo os agentes antifúngicos desidratados (6 agentes antifúngicos a duas concentrações diferentes)
2 poços de controlo negativos
Um inoculado calibrado da estirpe a testar é diluído no "meio de suspensão" e, em seguida, distribuído em cada poço da
microplaca.Os agentes antifúngicos presentes em cada poço são assim re-hidratados pelo "meio de suspensão" inoculado.
As concentrações antifúngicas obtidas correspondem a concentrações de discriminação, o que permite a classificação das
estirpes em: estirpes sensíveis(S) estirpes intermédias (I) estirpes resistentes (R)Os pontos de ruptura foram seleccionados no seguimento do estudo de distribuição dos agentes antifúngicos M.I.C.'s obtidos
com microplacas de protótipo utilizadas segundo um procedimento idêntico ao de FUNGITEST™.
Este estudo preliminar (11) foi efectuado em dois Laboratórios de referência, "Unité de Mycologie" do Institut Pasteur de Paris,
e o Laboratório de Imunologia da "Faculté de Pharmacie" de Montpellier; 193 estirpes foram seleccionadas como
representativas das estirpes isoladas na prática clínica e incluíam estirpes resistentes. No referido estudo, foram testadas 8
diluições de 6 fármacos antifúngicos, tendo-se obtido a distribuição dos M.I.C's resultantes. Com base nos gráficos de
distribuição, e em dados da literatura recente, 2 concentrações foram seleccionadas para cada substância antifúngica, para
representação final da galeria.Na ausência de recomendações internacionais actuais para interpretação dos M.I.C.'s, os pontos de ruptura seleccionados são
apenas provisórios, e podem ser modificados no futuro: serão necessários outros estudos para definir a correspondência entre
os resultados obtidos in vitro, e a sua relevância clínica.3- COMPOSICÃO DO DISPOSITIVO
FUNGITEST™ Minclui: Microplate : 10 microplacas de 16 poços, em embalagem individual (o diagrama da microplaca está indicado na etiqueta).
10 películas adesivas
Suspension medium : 10 frascos contendo 3 ml de meio de suspensão pronto a utilizarCada microplaca é embalada individualmente em bolsa de alumínio estanque, contendo uma película adesiva e um
dessecante. 2Diagrama da microplaca
T+ ݾControlo positivo
5 FC ݾ5- fluorocitosina (2-32 µg/ml)
AB ݾanfotericina B (2-8 µg/ml)
MCZ ݾmiconazole (0,5-8 µg/ml)
KET ݾquetoconazole (0,5-4 µg/ml)
ITR ݾitraconazole (0,5-4 µg/ml)
FLU ݾfluconazole (8-64 µg/ml)
T- ݾControlo negativo
4- CONSERVACÃO
Os reagentes, conservados a +2 - 8°C, mantêm-se estáveis até ao termo do prazo de validade indicado na embalagem.
5- MATERIAL NECESSARIO MAS NÃO FORNECIDO
Água destilada esterilizada
Micropipetas de 20 µl e 100 µl
Pontas estéreis
Opacity control 1 Mac Farland: referência 56499Incubadora a 37°C e 32°C.
6- MODO DE FUNCIONAMENTO
A) PREPARACÃO DA SUSPENSÃO DE LEVEDURA
Usar uma pipeta para recolher duas colónias similares de uma cultura pura e fresca obtida em meio Sabouraud, com ou
sem antibiótico, e introduzi-las em 3 ml de água destilada esterilizada, para obter um primeiro inoculado calibrado, com
uma opacidade equivalente ao padrão Mac Farland No. 1 (Opacity control 1 Mac Farland), i.e 3 x 10
6 leveduras/ml. 3Utilizando uma pipeta calibrada, diluir 100 µl deste inoculado em 1,9 ml de água destilada esterilizada.
Inocular 20 µL da diluição obtida no meio de suspensão fornecido com o dispositivo. A concentração do inoculado será
então equivalente a 1 x 10 3 leveduras/ml.B) INOCULACÃO DA MICROPLACA
Utilizando uma pipeta calibrada, distribuir 100 µL desta suspensão em cada poço da microplaca.
Cobrir com película adesiva.
C) INCUBACÃO DA MICROPLACA
Incubar : - a 32°C durante 72 hpara Cryptococcus neoformans - a 37°C durante 48 hpara as outras leveduras.D) LEITURA E INTERPRETACÃO DOS RESULTADOS
Examinar a placa apenas quando os poços de controlo positivo (T+) estiverem rosa.Observar qualquer alteração de cor nos poços que contêm o agente antifúngico, em comparação com os poços de
controlo negativo (azul). Interpretar de acordo com a cor dos dois poços para cada agentes antifúngico: - Azul-Azul = sem crescimento: estirpe inibida pelo agente antifúngico in vitro - Rosa-Azul = crescimento reduzido: estirpe intermédia - Rosa-Rosa = crescimento: estirpe não inibida pelo agente antifúngico in vitro.7- PRECAUCÕES DE UTILIZACÃO
Não utilizar reagentes após o termo do prazo de validade.RECOMENDACOES DE HIGIENE E SEGURANCA
As estirpes e reagentes inoculados são potencialmente infecciosos; deverão ser manuseados de acordo com as precauções
habituais e eliminados em cumprimento das normas de higiene e segurança presentemente em vigor para este tipo de produto.
8- CONTROLO DE QUALIDADE DO TESTE
Os desempenhos de FUNGITEST™ são controladas utilizando as seguintes estirpes:ESTIRPES RESULTADO DA CULTURA EM 48h A 37°C
T+ 5FC AB MCZ KET ITRA FLU T -
C. tropicalis ATCC 750 Rosa S S/I S/I S S/I S Azul C. krusei ATCC 6258 Rosa I S/I I S/I S/I I Azul C. albicans CIP 884.65 Rosa S S/I S/I S S S Azul C. glabrata SDP A35 Rosa S S S/I I I/R I/R Azul C. parapsilosis ATCC 22019 Rosa S S S/I S S/I S Azul C. neoformans SDP B53* Rosa S/I S S/I S/I S/I I/R Azul * Incubação durante 72h a 32°C9- CONTROLO DA QUALIDADE DE FABRICO
Todos os reagentes são fabricados de acordo com o nosso Sistema de Qualidade, desde a recepção das matérias primas até
à comercialização final do produto. Cada lote é submetido a avaliações de controlo de qualidade, sendo comercializado apenas
quando em total conformidade com os critérios de aceitação predefinidos. Os registos relativos à produção e controlo de cada
lote são arquivados pela Bio-Rad.10- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. ANAISSIE ELIAS J, KARYOTAKIS NICHOLAS C, HACHEM RAY, DIGNANI MARIA C., REX JOHN H., AND PAETZNICK
VICTOR. Correlation between In Vitro and In Vivo Activity of Antifungal Agents against Candida Species. The Journal of
Infection Diseases 1994 ; 170 : 384-389.
2. BERENGUER J, FERNANDEZ-BACA V , SANCHEZ R, BOUZA E. In Vitro Activity of Amphotericin B, Flucytosine and
Fluconazole against Yeasts Causing Bloodstream Infections. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1995 ; 14 : 362-365.
3. DROMER F, DUPONT B. The increasing problem of fungal infections in the immunocompromised host. J. Mycol. Méd.
1996 ; 6, Suppl. I : 1-6.
4. ESPINEL-INGROFF A, PFALLER MA. Antifungal agents and susceptibility testing. In MURRAY PR, BARON EJ, PFALLER
MA, TENOVER FC, YOLKEN RH, eds. Manual of Clinical Microbiology, 6th ed. Washington, DC : American Society for
Microbiology, 1995.
5. ESPINEL-INGROFF A, RODRIGUEZ-TUDELA JL, and MARTINEZ-SUAREZ JV. Comparison of Two Alternative
Microdilution Procedures with the National Committee for Clinical Laboratory Standards Reference Macrodilution Method
M27-P for In Vitro Testing of Fluconazole-Resistant and -Susceptible Isolates of Candida albicans. J. Clin. Microbiol.
1995 ; 33 : 3154-3158.
46. NCCLS. Antifungal Susceptibility Testing; Committee Report. NCCLS document M27-T. NCCLS, 771 East Lancaster
Avenue, Villanova, Pennsylvania. October 1995.
7. PAUGAM A. Intérêt de l'étude in vitro de la sensibilité des levures aux antifongiques. Revue française des laboratoires.
1996 ; 282 : 157-159.
8. PFALLER MA, BUSCHELMAN B, BALE MJ, et al. Multicenter comparison of a colorimetric microdilution broth method with
the reference macrodilution method for in vitro susceptibility testing of yeast isolates. Diagn Microbiol Infect Dis. 1994;19 :
9-13. 4
9. WALSH TJ, GONZALEZ C, ROILIDES E, MUELLER BU, ALI NASR, LEWIS LL, WHITCOMB TO, MARSHALL DJ, and
PIZZO PA. Fungemia in Children Infected with the Human Immunodeficiency Virus : New Epidemiologic Patterns,
Emerging Pathogens, and Improved Outcome with Antifungal Therapy. Clin. Infect. Dis. 1995 ; 20: 900-906.