TP 7 Histologie diverses (préparation des échantillons) que l'on applique au matériel étapes successives : fixation, inclusion, coupe, coloration, montage
7 jan 2013 · Ce protocole est utilisé dans la préparation de tissus pour une Remarque préalable : Afin d'obtenir de belles coupes histologiques, les
prélevée est rigide en présence de paraffine solide dans l'espace intracellulaire de chaque cellule composant le tissu OU 7 Confection des coupes histologiques
La préparation de coupes de grande qualité pour l'histopathologie nécessite compétence et expérience d'améliorer la théorie et la pratique de l'histologie par l'éducation, la formation et le discours traité selon un protocole bien trop court
Ici, plusieurs centaines de lames histologiques sont préparées chaque jour et nous allons pouvoir observer chaque étape de cette préparation minutieuse
Plateforme d'Histologie IRIC – Local 3440 Technique solidifiant les tissus et permettant de confectionner des coupes tissulaires minces (4- 5µm) Étapes pour la préparation de tissus inclus dans la paraffine 1 protocole tissus frais)
3 1 Préparation des échantillons pour la microscopie électronique à transmission (ou Figure 1 2 Préparation des coupes histologiques en paraffine 2 1 4 Coloration Le protocole suivi est inverse de celui qui est utilisé pour l'inclusion
des protocoles et des études biologiques nécessite, chaque fois, d'adapter et de aiguilles durant les étapes de préparation des coupes histologiques (les
La technique dite standard consiste en la préparation d'un fragment d'organe coupes histologiques, déparaffinage, réhydratation, montage et observation
Méthodes de prélèvement et de préparation des échantillons pour l'étude de l' activité coupes fines et les observer au microscope optique, est développée au laboratoire (LERFoB, centre Inra de Nancy) Figure 1 : protocole d'imprégnation
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2 Danscettevidéonousallonsparlerd'aspectsplustechniquesliésàl'histologie.Savez-vouscommentonobtientunelamehistologiquecommecelle-ci?Etbienpourledécouvrirouleredécouvrir,jevousproposederejoin dreunl aboratoired'analyse safindecompre ndrecommentlestissusbiologiquessonttraitéspourpréparerleslameshistologiquesquiserontobservéessouslemicroscope.NousvoicidanslelaboratoirededermatopathologieducentrehospitalieruniversitairedeLiège.Ici,plusieurscentainesdelameshistologiquessontpréparéeschaquejouretnousallonspouvoirobserverchaqueétapedecettepréparationminutieuse.Lapremièreétapedeceprocessusestleprélèvementquiconsisteàobtenirunéchantillondetissusenlecoupanthorsd'unorganeoumêmeàpréleverunorganeentier.Enclinique,unfragmen td'organeestprélevé lorsd'uneendoscopieo ulorsd' uneinterventionchirurgicale.Onparlerespectivementdebiopsieoudepièceopératoire.Deséchantillonsdetissuspeuventaussiêtreprélevéssurdescadavreslorsd'autopsies.Danslelaborato ire,les prélèvementsreçussontanalysés macroscopiq uementet,sinécessaire,ilssontrecoupéspourobtenirdespiècesdepetitetaille,d'environ1à2cm2,quisontalorsdéposéesdansdescassettesd'inclusionenplastiqueservantdecontenantpourlasuitedelamanipulation.Afindeconserverlestissusprélevésdansunétatprocheduvivant,ilssontfixéstoutdesuiteaprèsleprélèvementàl'aided'unesubstancechimiquequel'onappellelefixateur.Généralement,ils'agitdeformoloudeparaformaldéhydeàdesconcentrationsdéterminéesmaisd'autrestypesdefixateurspeuventaussiêtreutilisés,celadépendprincipalementdutyped'examenàeffectuerparlasuitesurletissumaisaussidutempsdisponiblepourlafixation.Eneffet,laduréedelafixationvarieselonlatailleduprélèvement.Atitred'exemple,lavitessedepénétrationduformoldanslestissusestde1millimètreparheure.Lesintérêtsdelafixati onsontmultiples:immo bilisationdesconstituantstissulairesetcel lulaires,préventiondel'autolysecellulaireetdelaputréfactionbactériennepost-mortem.Pourpouvoirobserverlestissusaumicroscope,ilfautréaliserdefinestranchesrégulièresdansleprélè vement.Po uryparvenir,celui-cidoitavo irunecons istancesolide,c 'estpourquoiilestinclusdansdelaparaffine.C'estcequel' onappelle laphased'in clusionquies tgénéralementréalisée dansun automate.Laparaffineétanthydrophobe,lestissusdoiventêtrepréalablementdéshydratéspardespassagessuccessifsdansdesbainsd'alcooldeconcentrationcroissante,puisdansun
3solvantdanslequellaparaffineestmiscible,parexemplelexylèneouletoluène.Acestade,leprélèvementdevienttransparent,c'estlaclarification.Alafindel'étaped'inclusion,lesprélèvementssontplongésdansdesbainsdeparaffineliquidequioccuperatouslesespacesvidesdansletissu.Alasortiedel'automate,leprélevementestsortidesacassetted'inclusionetdéposédansunmoulequipeutêtreremplideparaffine,c'estlaphased'enrobage.Enrefroidissant,laparaffinedurcira,cequiformeraunblocdanslequell'échantillondetissusestinclusetquipourraêtrecoupéenfinestranchesquel'onappelledescoupes.Parfoisunexamentrèsr apidedes tissusestnécessai re,parexemp lepourunexamen extemporanéc'est-à-direpourguide rlechirurgie nensalled'opération. Danscec as,leprélèvementestfixépuiscongeléetinclusdansunmélangehydrosolubledeglycolsetderésinespourréaliserlescoupes.Cettetechniquepermetd'écourterleprocessusenévitantlesétapesd'inclusionetd'enrobageenparaffine.Silepré lèvement aétéinclusdanslaparaf fine, leblocestalorscoupéàl'ai ded'un microtome.Sileprélèvementaétécongelé,lescoupessontréaliséesdansuneenceinteréfrigéréeàl'aided'unemachineappeléecryostat.Lemicrotomeetlecryostatsontdesappareilsmunisd'unelameaiguiséequipermettentd'obtenirdescoupesdetiss usfines,de 2à5micromètresd'é paisseur. Audelàde5micromètres,ilestdifficiled'observercorrectementleprélèvementaumicroscopecarlescouchesdetissussesuperposent.Lesfinescoupesréaliséessontensuitedéposéessurdeslamesdeverrepuisséchéesafind'adhérerparfaitementàlalame.Dansleslaboratoiresd'analysecommecelui-ci,c'estunautomatequisechargeradelasuitedesétapesdelapréparation.Lescoupesyserontdéparaffinéesetréhydratéesparpassagessuccessifsdansdesbainsd'alcooldemoinsenmoinsconcentréetenfinparpassagedansunbaind'eaupourpouvoirêtrecolorées.Puisquelestissusdel'organismenesontpasspontanémentcolorés,ilsserontnaturellementmalvisibl es,c'estpourquoionutilisee nhistologiede scolorantsquipermettentleur observationaumicroscope.Laplupartsontdescomposantsacidesoubasiquesenmilieuaqueuxquiinteragissentaveclesradicauxionisésdestissus.Lacolorationlapluscourammentutiliséeestl'hématoxyline-éosine.Cettecolorationestlatechniquedecontrastefondamen talepourto utexamenmicroscopiqu ehistologiqueconventionnel.L'hématoxylineestuncolorantbasique,quisefixeauxacidesnucléiquesetcoloreainsilesnoyau xcellulaireset leréticulum endoplasmiquerug ueuxenviolet.Au
4contraire,l'éosineestunco lorantacide,quisefixeaux protéines etdoncc olorelecytoplasmeetlesfibresenrose.Uneautrecolorationfréquenteestl'hématoxyline-éosine-safran,cederniercolorantauneaffinitéaveclesfibresdecollagènedelamatriceextracellulairedestissusetpermetdoncdemettrecesfibresenévidence.Lacolo rationtrichromedeMassone stelleaussicl assiquemen tutiliséeenlab oratoire,surtoutpouridentifierlespathologiesmusculaires,cardiaques,hépatiquesetrénalescarellepermetdebiendifférencierd'unepartlesfibresmusculairesdontlecytoplasmeprendunecolorationrougeetd'autrepartlesfibresdecollagènequisecolorentenvert.Ilexis teévidemmentbien d'autrespossibilitésdecoloratio ndestissusqu evousrencontrerezsurleslameshistologiquesquevousobserverezdansceMOOC.Desréactionschimiquesplusspécifiquespeuventaussiparfoisêtreutiliséespourmettreenévidencecertainesstructures.Prenonsquelquesexemples.Lemucusprésentdanscertainstissuspeutêtrecoloréparexempleàl'aideduBleu Alc ianouduRougeMuci carminqui colorentles mucopolysaccharidesacidesrespectivementenbleuouenrouge.Unautreexempleestceluidelacolorationàl'acidepériodiquedeSchiffquel'onappelleplussouventcolorationPASquimetenévidencelesglucidesparuncolorantrouge-pourpre.Cettecolorati onpermetparexempledemie uxvisualiserleg lycogène oulesmucinescontenusdanscertainescellulesouencoreleslamesbasalesdesépithéliumsquisontrichesenglycoprotéines.Nousévoqueronsaussiplustardlacolorationàl'orcéinequiestunecolorationspécifiquedesfibresélastiquesquel'ontrouvedanslestissusconjonctifs,maisaussil'imprégnationàl'argentquipermetdevisualiserlesfibresdecollagènedetypeIIIappeléesaussifibresréticuléesetfinalementlafixationàl'acideosmiquequipermetdeconserveretvisualiserleslipidesdestissusbiologiques.Finalementd'autrestechniques, ditesd'immunohistoch imie,peuventêtreutiliséespourmettreenévidencedesmotifsantigéniquesprésentsdanslestissus.Ellessontcourammentutiliséesenrechercheetdansleslaboratoiresdediagnostic.Ellesconsistentàutiliserdesanticorpsspécifiquesdemoléculesd'intérêtafind'évaluerleurprésenceetleurrépartitiondansuntissu. Laréactio nantigène-anticorpsestvisualiséeso itparune réactionenzymatiquesoitàl'aidedesub stanceschimiq ues appeléesfluorochromes.Pourlaréalisationdecestechniques,lacongélationdestissusestaussipréférablecarellepermetunemeilleureconservationdessitesantigéniquesdansletissu.Ladernièreétapedelapréparationdeslameshistologiquesestlemontage.Lorsqueletissuaété coloré, ilfautleprotégerparl'ap position d'unerés ineetd'u nelamelledeverre
5couvre-objetoubienparunfilmplastique,commec'estlecasdanscetautomate.Cecipermettradeconserverlalameetdel'observeraumicroscopesansrisqued'abîmerletissu.Voussavezmaintenan tcommenton réalisedeslameshisto logiquesàpartird'un prélèvementdetissu.Pourobserverceslameshistologiques,vouspouvezbiensûrutiliserunmicroscopecommecelui-cimaisdeplusenplusfréquemmentdanslapratiquemédicale,pourlarechercheoudansl'enseignement,commedansceMOOCparexemple,ceslamessontdigitaliséespourpouvoirêtreregardéessurunordinateur.Voyonsenquelquesmotsenquoiconsisteleprocessusdedigitalisation.Ladigitalisation,c'estl'obtentiond'uneimagenumériqueàpartird'unelamehistologiquegrâceàunscannerparticulierdotéd'unmicroscopeetd'unecaméradigitale.Leprocessusd'acquisitiondel'imagedébuteparlechoix,àfaiblegrossissement,delapartiedelalameànumériseretparleréglagedeparamètrestelsquelanetteté.Lanumérisationproprementditepeutalorsavoirlieu.Desmilliersd'imagesdelacoupehistologiquefourniesparl'objectifdumicroscoperégléàl'agrandissementmaximumchoisisontenregis tréesdemanièresérielle,puisregro upéespo urreconstruirelatotali tédel'échantillon.L'observationdeslamesnumériséessefaitsurl'écrand'unordinateuràl'aided'unlogicieldevisualisation,quireproduitlesfonctionsd'unmicroscopeenpermettantdenaviguersurlalameàdifférentsgrossissements.Leslamesscan néesprésentent denombreuxavantagescomme notammentunaccèspartagéentredenombreusespersonnes,uneconsultationàdistanceetàtoutmoment.Ellespermettentégalementdepointercertainesstructuresd'intérêtetd'incorporerdescommentairessurl'image.DansceMOOC,vousaurezdoncunmicroscopevirtuelàvotredispositionaveclequelvouspourrezexploreràvotreguisenoslamesdigitaliséesmaisaussivouslaisserguideràtraverslestissuslelongdeparcoursdequestions-réponsesquenousavonspréparéspourvous.
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