Enhanced green fluorescent protein Ethyle méthanesulfonate GOC Gene order conservation IF Initiation factor iSDR Induced-stable DNA replication MGMT
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[PDF] Vers la compréhension des mécanismes de réparation de lADN
Enhanced green fluorescent protein Ethyle méthanesulfonate GOC Gene order conservation IF Initiation factor iSDR Induced-stable DNA replication MGMT
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AVERTISSEMENT
Ce document est le fruit d'un long travail approuvŽ par le jury de soutenance et mis ˆ disposition de l'ensemble de la communautŽ universitaire Žlargie. Il est soumis ˆ la propriŽtŽ intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de rŽfŽrencement lors de lÕutilisation de ce document. D'autre part, toute contrefaon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pŽnale.Contact : ddoc-theses-contact@univ-lorraine.fr
LIENS Code de la PropriŽtŽ Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la PropriŽtŽ Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10Membres du jury:
Rapporteurs: M. Philippe Mazodier Directeur de Recherche Institut Pasteur, Paris M. Fabrice Confalonieri Professeur, Université Paris-Sud 11 Examinateurs: Mme. Bénédicte Michel Directrice de Recherche CNRS, Paris M. François Lecointe Chargé de Recherche INRA, Jouy-en-Josas Directeur de thèse: M. Pierre Leblond Professeur, Université de LorraineCo-encadrant de thèse: Mme. Annabelle Thibessard Maître de Conférence, Université de Lorraine
Vers la compréhension des mécanismes de
ǯStreptomyces :
ǯ Thèse
en Ecotoxicité, Biodiversité, Ecosystèmes et soutenu publiquement le 23 septembre 2014 par Lingli ZHANG Ecole doctorale RP2E (Ressources, Procédés, Produits et Environnement) Laboratoire DynAMic ȂUMR UL/INRA 1128 ȂIFR EFABA Faculté des Sciences et Technologies - 54506 Vandoeuvre-lès-NancyCEDEX 1Remerciements
Merci pour la qualité de son encadrement et la pertinence de ses remarques. remercie pour la qualité de son encadrement, sa grande disponibilité, égalementFrançois Lecointe
pour avoir accepté de juger ce travail. Je remercie vivement Claire Bertrand pour le soutien scientifique, Emilie Piotrowski pour son aide à la réalisation technique de ce travail et Ludovic Chipot pour son été vraiment ravie de pouvoir travailler dans une ambiance aussi bonne. Je remercie ma famille, Papa, Maman et mes beaux parents pour leur soutien. Et enfin un grand merci à Zhenghui, mon mari pour son soutien de tous les jours et même saveur sans vous. 2Liste des abréviations
A-EJAEP Alternative end-joining
Archaeo eukaryotic primase
BER Base excision repair
BIR Break-induced replication
BLM Bloom syndrom
cSDR Constitutive-stable DNA replicationDSB Double strand break
DSBR Double strand break repair
ECF Extracytoplasmic sigma factor
eGFP EMS Enhanced green fluorescent proteinEthyle méthanesulfonate
GOC Gene order conservation
IF Initiation factor
iSDR Induced-stable DNA replicationMGMT 6-O-methylguanine DNA methyltransferase
MLSA Multilocus sequence analysis
MMC Mitomycine C
MMR DNA mismatch repair
MRN Mre11/Rad50/Nbs1 complexe
MRX Mre11/Rad50/Xrs2 complexe
NER Nucleotide excision repair
NHEJ Non-homologous end joining
RDR Recombination-dependent replication
RFR Replication fork reversal
RH Recombinaison homologue
RI Recombinaison illégitime
ROS Reactive oxygen species
RPA Replication protein A
RSS Recombination signal sequence
SAP SAF-A/B, Acinus and PIAS
SD Shine-Dalgarno
SDSA Synthesis-dependent strand annealing
SF1 Superfamille 1
SSA Single-strand annealing
SSB Single-stranded DNA-binding protein
TIR Terminal inverted repeat
3Sommaire
Remerciements ............................................................................................................................................ 1
Liste des abréviations ............................................................................................................................... 2
Sommaire ....................................................................................................................................................... 3
1. Introduction ...................................................................................................................................... 6
6.1. Réplication conservative, mutations et évolution ........................................................................... 6
6.2. Sources des mutations ................................................................................................................................ 8
1.2.1. Les erreurs de réplication ............................................................................................................. 8
1.2.3. Les lésions induites par les agents mutagènes .................................................................. 10
1.2.5. Le système SOS............................................................................................................................... 14
1.2.6. Le transfert horizontal ................................................................................................................ 15
6.3. Mécanismes de réparation des cassures double-brin ................................................................. 20
1.3.2. Multiplicité des mécanismes de réparation des DSB ...................................................... 21
6.4. Pourquoi
1.4.1. Une organisation chromosomique originale ...................................................................... 48
1.4.2. ǯ-"-± ±±- ... Streptomyces ........................................................................... 49
1.4.3. Région de synténie dégénérée ................................................................................................. 51
1.4.4. Les recombinaisons chez Streptomyces ................................................................................ 52
2. Objectifs de la thèse .................................................................................................................... 54
3. Résultats .......................................................................................................................................... 56
3.1. La recombinaison homologue .............................................................................................................. 56
3.1.1. Les gènes adnAB
dans les génomes de Streptomyces ...................................................... 563.1.2. adnAB
est essentiel chez les Streptomyces .......................................................................... 61
3.1.4. adnAB
affecte le phénotype de Streptomyces ........ 753.2. La recombinaison illégitime .................................................................................................................. 82
3.2.1. Identification in silico
ambofaciens ............................... 864. Discussion ..................................................................................................................................... 103
4.1. ǯ±...-nucléase AdnAB, la recombinaison homologue et la survie chez les
Streptomyces .........................................................................................................................................................103
4.1.1. ǯ±...-nucléase AdnAB est essentielle chez les Streptomyces ...........................103
4.1.2. Le locus adnAB
4.1.3. La
réponse SOS est-elle indépendante de LexA chez les Streptomyces ? ...............113 S.ambofaciens : implication dans la réparation des DSB ....................................................................117
44.2.1. KuA et KuC sont impliquées dans la résistance aux stress génotoxiques .............117
4.2.2. Les protéines Ku jouent-elles un rôle dans la protection des télomères chez les
Streptomyces ? .............................................................................................................................................120
4.2.3. Caractérisation des homologues LigD .................................................................................121
4.3. Compétition entre RH et NHEJ chez Streptomyces .....................................................................123
4.3.1. RH et NHEJ
: entre collaboration et compétition chez les eucaryotes ....................1234.3.2. Et chez les bactéries
? ................................................................................................................125
4.4. Recombinaison
et évolution du génome des Streptomyces .....................................................127
5. Perspectives ................................................................................................................................. 130
6. Matériel et Méthodes ................................................................................................................ 132
6.1. Souches bactériennes, plasmides et BAC .......................................................................................132
6.1.1. Souches bactériennes ................................................................................................................132
6.1.2. Plasmides
6.1.3. BAC (Bacterial Artificial Chromosome) ..............................................................................135
6.1.4. Cosmides ........................................................................................................................................136
6.2. Condition de cultures .............................................................................................................................136
6.3. Construction des plasmides, cosmide et BAC recombinants ..................................................137
6.5.1. Les constructions pour la mutagenèse ...............................................................................137
6.5.2. Les plasmides recombinants pour les expériences de complémentation ............140
6.5.3. Les plasmides recombinants utilisés pour la localisation des homologues de
Ku 141
6.4. Extrac- ǯAB - ǯA2B ..................................................................................................................143
coli et de Streptomyces ......................................................143 coli ..................................................................................1436.8.2. Conjugaison inter-générique ..................................................................................................
1436.6. Tests de PCR quantitative et PCR semi-quantitative .................................................................144
6.7. 4- ǯ...--± ...± .......................................................................................................................144
6.8. Caractérisation phénotypique ............................................................................................................145
6.8.1. Test de viabilité cellulaire ........................................................................................................145
6.8.2. Exposition aux rayonnements UV.........................................................................................145
6.8.3. Traitement à la mitomycine C ................................................................................................145
6.8.4. Exposition aux rayonnements gamma ................................................................................146
6.9. Observation au microscope
à épifluorescence des souches de Streptomyces .................1467. Références .................................................................................................................................... 152
5INTRODUCTION
Introduction-Réplication conservative, mutations et évolution 61. Introduction
6.1. Réplication conservative, mutations et évolution
génétique de génération en génération. Elle est, de par son mécanisme génétique. Néanmoins, la diversité des organismes vivants qui nous entourent et de leurs caractéristiques morphologiques est remarquable, tout comme le sont leurs évolutionniste. Ainsi des variations interindividuelles sont observées chez les domestications. Les organismes vivants présentent donc la capacité spontanée devarier. De plus, certaines de ces variations peuvent être fixées héréditairement,
...ǯ--à-dire transmise à la descendance par la reproduction sexuée. A la fin du 19ème
entre conservation et variation génétique. Introduction-Réplication conservative, mutations et évolution 7 En 1901, Hugo de Vries (1848-1935) a publié un ouvrage intitulé " Die M utationstheorie». Dans ce volume il nomme mutation les variations brusques et mutationnisme voit le jour. Selon cette théorie, les mutations peuvent expliquer à théorie de Darwin qui donne à la sélection naturelle un rôle clé dans le processus de diversification des espèces. Avec les progrès de la génétique des populations dans les années 1930, mutations et sélection naturelle trouvent leur place dans la théorie que les mutations sont la source de la variabilité génétique, et que dans certaines conditions, la sélection naturelle " fait le tri clairement démontré dans des modèles bactériens par Luria etDelbrück (1943),
Newcombe (1949) et Lederberg and Lederberg (1952).Introduction-Sources des mutations
86.2. Sources des mutations
les mutations peuvent être classées en trois catégories : (1) les mutations ou plusieurs nucléotides, insertion et délétion) ; (2) des réarrangements inversion, duplication, fusion et fission chromosomique) ; (3) les mutations Les mutations sont principalement introduites par les deux mécanismes clés de1.2.1. Les erreurs de réplication
L a réplication est un mécanisme hautement fidèle qui repose sur la synthèse du ; le mécanisme est appelé hémisynthèse (Meselson et grâce à deux niveaux de contrôle d it " pré-synthétique », est capable de sélectionner le bon nucléotide à incorporer à chaque position, le second, dit post-synthétique », permet une correction par délétion du nucléotide inadéquat - ǯE. coli entre 10-8 et10-10 erreur par paire de bases. La déficience de cette
et confère donc un phénotype hypermutateur (Degnen etCox, 1974; Michaels et al.,
1990).
Introduction-Sources des mutations
9 Des altérations de la structure chimique des bases de ǯ plus classiques sont la désamination et la dépurination/dépyrimidination. Le premier phénomène correspond à la perte du groupement amine (position 4), et de cette base modifiée. La dépurination/dépyrimidination correspond à la perte du mais sont néanmoins pré-mutagènes, et peuvent entraîner une erreur de Les fréquences de ces lésions spontanées sont faibles mais leur accumulation 100-500 déaminations spontanées par jour et par celǯǡ ǯͻͲͲͲ-10000 dépurinations spontanées (Lindahl et Nyberg, 1972). Cela en fait la première cause endogène d'altération de l'ADN. Certains nucléotides ou contextes nucléotidiques sont plus propices à ces dommages : ainsi, les cytosines mé thylées en position 5 (5mC) constituent des points chauds de transition. En effet, par désamination spontanée les 5mC se transforment en thymine. Pour cause, il ponctuelles (cytosine vers thymine) vont se produire à hautes fréquences aux positions des 5mC.
Introduction-Sources des mutations
101.2.3. Les lésions induites par les agents mutagènes
en deux catégories : (1) les agents chimiques tels que les agents alkylants, les agents in tercalants, les analogues des bases et (2) les agents physiques comme des radiations ionisantes, des rayonnements UV. Certains agents induisent des en lui transférant un groupe méthyle ou éthyle. Les radiations ionisantes induisent plus de 70 types de lésions oxydatives différentes dont des cassures simple et double brin. Les rayons UV provoquent la formation de dimères de bases adjacentes (notamment des thymines). Certains agents perturbent la structure de la double les paires de bases. Par ailleurs, les analogues des bases peuvent leurrer la machinerie réplicative en se substituants aux bases de l'ADN lors de la réplication et induire des mutations aux cycles réplicatifs ultérieurs.1.2.4.
Les lésions en quantités trop importantes vont entraîner la mort cellulaire, et ne présentent aucune conséquence évolutive. En revanche, lorsque ces dommages vont être endigués, la nature du mécanisme de prise en charge va déterminer le caractère correct ou incorrect de la réparation, et donc ses conséquences sur le Les paragraphes suivants présenteront les mécanismes principaux de réparation deIntroduction-Sources des mutations
111.2.4.1. Réparation par excision
Réparation par excision de base
alkylation. La réparation par excision de base (BER) est communément utilisée pour éliminer par excision les bases endommagées. Dans ce processus, une ADN glycosylase reconnaît ǯǡ une activité endonucléasique clive le désoxyribose. Une ADN polymérase remplit à nouveau ǯcomplémentaire comme matrice. Enfin, une ADN ligase suture le brin réparé. Les mutations dans les acteurs de la réparation par BER entraînent une augmentation de la fréquence de mutations chez de nombreux organismes (Reagan et al., 1995; Denver et al., 2006; Kurthkoti et al., 2008) (figure 1).Figure 1. ǯ (BER) chez E. coli
Introduction-Sources des mutations
12YRéparation par excision de nucleotides
L a réparation par excision du nucléotide (NER) est un mécanisme plus flexible que endommagé. Le principe est la reconnaissance de la perturbation engendrée par le libre puis ǯǯȋ2). Chez E.
ǯ ǯuvrD augmente la fréquence de mutations spontanées par un facteur 100 (Washburn etKushner, 1991; Hall, 1995; LeCuyer et al., 2010).
Figure 2. ǯȋȌE. coli
Introduction-Sources des mutations
13YRéparation des mésappariements
Un troisième système de réparation par excision reconnaît les bases qui, bien que mécanisme spécifique, post-réplicatif, Ǯ ǯ MR originelle (figure 3). La discrimination des brins, parental et néosynthétisé, se fait grâce au caractère méthylé du brin parental. La méthylation est un phénomène post-réplicatif. Chez E. coli, les protéines MutS, MutL et MutH sont les acteurs Figure 3. Modèle de la réparation des mésappariements (MMR) chez E. coliLe processus de réparation par MMR commence par la reconnaisance des mésappariements par la protéine
MutS. Ensuite, MutL est recruté pour former le complexe MutSLH avec MutH déjà fixé sur le site GATC. Sous
cette forme complexée, MutH est activé et clive le brin non méthylé au niveau du site GATC. Puis, une
exonucléase intervient au site de clivage avec l'aide d'hélicase II et des protéines SSB. Si le clivage se produit
sur le côté 3 'du mésappariement, cette étape est réalisée par l'exonucléase I. Si le clivage se produit sur le
côté 5' du mésappariement, cette étape est réalisée par l'exonucléase VII ou RecJ. La lacune est comblée par
l'ADN polymérase III et l'ADN ligase.Introduction-Sources des mutations
14 essentiels pour ce mécanisme MMR. Ainsi, des mutations dans ces gènes sont à (Modrich, 1991).Par ailleurs, le MMR joue un rôle anti-recombinogène, servant de barrière à la
recombinaison entre les séquences peu homologues. Chez les bactéries, cela Radman, 1998). 1.2.4.2.Réparation par recombinaison En cas de cassures de ǯAB ou si les deux brins de la molécule sont altérés, la r éparation par recombinaison est utilisée. Deux grands types de mécanismes sont à distinguer : (i) ceux faisant intervenir la recombinaison homologue (RH) qui permet une réparation la plupart du temps fidèle et (ii) ceux appelés collectivement1.2.5. Le système SOS
Introduction-Sources des mutations
15 Cette réponse repose sur un contrôle transcriptionnel en trans ǯ nsemble de gènes dispersés dans le génome. Chez E. coli et de nombreuses autres bactéries, le LexA sur le promoteur des gènes cibles assure la répression de leur expression. Unǯ...--± ...-protéasique de la protéine RecA (appelée RecA*). Cette activité, en
favorisant la dégradation de LexA, déréprime le régulon SOS. Outre la surexpressioninfidèle appelée polymérase V. Cette polymérase possède une activité translésion
qui lui permet de synthétiser le brin complémentaire à travers un dommage porté "" ǯAB matrice. En contrepartie, la synthèse est le plus fréquemment incorrecte IV . Cette polymérase a une activité translésion plus faible que la PolV, et induit des mutations sur des matrices non endommagées. DinB participe également à la mutagénèse adaptative (McKenzie et al., 2001) dépendant du régulateur clé de la phase stationnaire RpoS, et de la recombinaison homologue (Galhardo et al., 2009)1.2.6. Le transfert horizontal
distinct. Chez les bactéries, le transfert horizontal joue un rôle prépondérant dansIntroduction-Sources des mutations
16 ponctuelles. La divergence, précédée ou pas de la duplication du gène ancestral, requiert en effet la formation de mutations ponctuelles indépendantes qui, extrêmement rare chez les bactéries comparé à la fréquence des transferts horizontaux. recombiné au génome de la bactérie hôte : la transformation naturelle, la transd uction et la conjugaison (figure 4). Figure 4. Modèles du transfert horizontal de gène entre les bactéries.Introduction-Sources des mutations
171.2.6.1. La transformation
ǯiologique particulier,
phénomène a été très étudié chez une bactérie Gram-positive pathogène de
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