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- 1 - THESE pré sentée à l"Institut National des Sciences Appliquées de Toulouse par

Hélène VERGNAULT

en vue de l"obtention du

DOCTORAT

de

Sciences E

cologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries Spécialité : Microbiologie et Biocatalyse Industrielles

Etude et amélioration

de la chromatographie en lit expansé Soutenue le 18 Novembre 2004 devant la commission d"examen :

P. SCHMITZ Professeur, INSA, Toulouse

R.M. W

ILLEMOT Professeur, INSA, Toulouse

C. MARANGES

Maître de Conférences, INSA, Toulouse

X. SANTARELLI Professeur, ESTBB, Université Bordeaux II J.C. BLOCK Professeur, Université Henri poincaré, Nancy P. SANTAMBIEN Docteur, Biosepra, Cergy-St-Christophe

Cette thèse a été préparée au Laboratoire de Biotechnologie-Bioprocédés UMR CNRS

5504 UR INRA 792 du Département de Génie Biochimique et Alimentaire de l"INSA de

Toulouse dans le cadre de l"Ecole Doctorale en Sciences Ecologiques, Vétérinaires,

Agronomiques et Bioingénieries de Toulouse.

- 2 - - 3 - NOM : VERGNAULT PRENOM : Hélène Titre : Etude et amélioration de la chromatographie en lit expansé. Thèse de doctorat de Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries Spécialité : Microbiologie et Biocatalyse Industrielles

Année : 2004 n° d"ordre : 753 pages : 215

RESUME :

La chromatographie en lit expansé est une technique primaire de purification des protéines qui permet de combiner clarification, concentration et purification en injectant directement le moût de fermentation dans la colonne, par un flux ascendant. Dans un premier temps, une

nouvelle colonne de chromatographie en lit expansé avec un distributeur de flux conique a été

conçue afin d"améliorer la qualité de l"écoulement et d"éviter la présence d"une grille, pour

limiter les problèmes de colmatage à forte concentration cellulaire. Cette colonne offre alors de meilleures performances comparées aux colonnes actuellement commercialisées. Dans un second temps, une étude physico-chimique des interactions entre les billes adsorbantes et les levures S. cerevisiae a montré l"importance de se placer dans les conditions réelles de l"expérience et de prendre en compte l"hydrodynamique et l"ensemble des interactions

électrostatiques et non électrostatiques pour décrire le mécanisme des interactions. Enfin, la

lipase de Yarrowia lipolytica a été purifiée par cette technique dans la colonne à distributeur

conique, avec un rendement de 98,8% et un facteur de purification de 3,55, directement en sortie de fermenteur.

MOTS-CLES:

Purification - chromatographie - lits expansés - lits fluidisés - levure - adhésion - lipase.

JURY :

Président : P. SCHMITZ Professeur, INSA, Toulouse

Membres : R.M. WILLEMOT

Professeur, INSA, Toulouse

C. MARANGES

Maître de Conférences, INSA, Toulouse

X. SANTARELLI Professeur, ESTBB, Université Bordeaux II J.C. BLOCK Professeur, Université Henri poincaré, Nancy P. SANTAMBIEN Docteur, Biosepra, Cergy-St-Christophe Soutenue le 18 novembre 2004 à l"Institut National des Sciences Appliquées de Toulouse.

Cette thèse a été préparée au Laboratoire de Biotechnologies-Bioprocédés UMR CNRS 5504 UR

INRA 792 du Département de Génie Biochimique et Alimentaire de l"INSA de Toulouse dans le

cadre de l"Ecole Doctorale en Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries de

Toulouse.

- 4 -

SUMMARY :

Expanded bed adsorption (EBA) is a primary recovery technology allowing the adsorption of target proteins from unclarified feedstock, by an increase in bed voidage, combining clarification, concentration and purification steps. First, a new column with a conical distributor has been specially designed to avoid any grid and limit problems of clogging with high cellular concentration culture broth. This column gives a better efficiency compared with commercial ones. Second, a physico-chemical study of the interaction between adsorbent beads and the yeast S.cerevisiae demonstrated the importance of considering the real working conditions, integrating the hydrodynamics and all kind of interactions (electrostatic, Lifshitz- van der Waals and polar interactions). Then, the lipase of Yarrowia lipolytica has been well purified by this technique using the new column with conical distributor, directly from unclarified feedstock. The yield reached 98.8% and the purification factor approached 3.55.

KEY-WORDS :

Purification - chromatography - expanded beds - fluidised beds - yeast - adhesion - lipase.

PUBLICATION :

Vergnault H., Mercier-Bonin M. and Willemot R.-M. (2004) Physico-chemical parameters involved in the interaction of Saccharomyces cerevisiae cells with ion-exchange adsorbents in expanded bed chromatography. Biotechnology Progress, 20, 1534 - 1542.

REMERCIEMENTS

- 5 -

Ce travail de recherche a été réalisé au Laboratoire de Biotechnologie-Bioprocédés de

l"Institut National des Sciences Appliquées de Toulouse. De par son interdisciplinarité, il a nécessité l"aide et l"implication de nombreuses

personnes. Un grand et sincère merci donc à ceux qui ont contribué à son aboutissement, que

ce soit grâce à leur soutien scientifique et technique, en y consacrant un peu ou beaucoup de

leur temps, ou grâce à leur écoute et leur amitié et qui ont fait que les agréables souvenirs

seront nombreux. Tout d"abord, merci à René-Marc WILLEMOT, Professeur à l"INSAT, pour avoir

imaginé ce projet et pour m"avoir permis de relever ce défi grâce à l"implication de toutes ces

personnes. Merci Claude MARANGES, Maître de Conférences à l"INSAT, pour ton soutien et ton écoute tout au long de ces trois années. Merci également à Xavier SANTARELLI, Professeur à l"ESTB de Bordeaux, Jean-Claude BLOCK, Professeur à l"Université Henri Poincaré de Nancy et à Patrick SANTAMBIEN, Docteur au sein de la société Biosepra, pour avoir accepté de juger mon travail et pour vos remarques constructives qui ont contribué à faire avancer le débat. Je tiens à remercier très sincèrement et particulièrement Muriel MERCIER-BONIN, pour ton encadrement scientifique et ta disponibilité mais également pour ton soutien et ton

écoute de tous les instants.

Un énorme merci à mes trois stagiaires Guillaume ALBOUZE, Emmanuel SOULIE et Xavier LELUT pour votre travail et votre bonne humeur. C"est grâce à vous que j"ai pu avancer sur plusieurs fronts ! Merci au Professeur Christian FONADE " l"ancien chef » pour son inventivité, à Patrick CHEKROUN " le verrier » pour sa patience, à Pascal GUIRAUD du LIPE et au Professeur Philippe SCHMITZ " le nouveau chef » pour leurs discussions

REMERCIEMENTS

- 6 - hydrodynamiciennes, à propos de la colonne à distributeur conique. Un merci tout particulier à Christophe ELLERO pour son incroyable disponibilité et son amitié. Merci à Jean-Christophe BELLOT, Maître de Conférences à l"INSAT et Krzysztof Kaczmarski de l"Université de Technologie de Rzeszow (Pologne) pour leur travail de modélisation. Merci encore à Muriel pour tout le travail sur les interactions physico-chimiques des cellules avec le support. Un grand merci également à Aude VERNHET du Laboratoire de Sciences pour l"Oenologie de Montpellier, pour son expertise dans ce domaine. Merci également à Gaëlle GUILLEMOT pour son aide et sa sympathie lors de ce petit séjour à Montpellier. Merci aussi à Hélène MARTIN-YKEN pour son expertise dans le domaine de la physiologie des levures et à Nathalie DOUBROVINE pour les observations au microscope

électronique à balayage.

Merci à Péco pour son aide précieuse d"expert en purification et à Alain MARTY, sans qui la lipase n"aurait jamais pu être produite. Merci également à Papi, Fonfon et encore Christophe pour leur aide technique au quotidien. Enfin, merci à tous les membres des équipes " Bioréact » et " Enzymo » pour m"avoir

donné l"impression que je faisais partie de l"équipe et surtout un énorme merci à tous ceux qui

ont permis à mon esprit de s"évader de temps en temps : Vincent, Fadhel, Christophe, David,

Emeline, Céline C., Bénou, Ghislane, Priscilla. Les amis de la K"fet. Et tout particulièrement

Mathias pour ton authenticité et ton amitié sincère et toujours plus étonnante.

TABLE des MATIERES

- 7 -

TABLE DES MATIERES.......................................................................................................7

LISTE des SYMBOLES.............................. .......................................... 11

INTRODUCTION................................................................................. 16

CHAPITRE 1 : ETUDE BIBLIOGRAHIQUE

I - LA CHROMATOGRAPHIE EN LIT EXPANSE :.......................................................27

I - 1 - L

ES ORIGINES DE LA CHROMATOGRAPHIE EN LIT EXPANSE :..................................27

I - 1.1 - Schéma général d"un procédé classique de biopurification :....................27

I - 1.2 - Réduire le nombre d"étapes :......................................................................29

I - 1.3 - Augmenter l"espace inter-particulaire :.....................................................30

I - 1.3.1 - L"adsorption en " batch » :......................................................................30

I - 1.3.2 - La chromatographie en lit fluidisé :.........................................................31

I - 1.3.3 - La chromatographie en lit expansé :........................................................32

I - 2 - L

ES SUPPORTS DE CHROMATOGRAPHIE EN LIT EXPANSE........................................34

I - 3 - C

ONCEPTION DES COLONNES - DISTRIBUTEUR :....................................................38

I - 4 - P

ROCEDURE EXPERIMENTALE :..............................................................................43

I - 4.1 - Equilibration :............................................................................................43

I - 4.2 - Injection de l"échantillon :..........................................................................44

I - 4.3 - Lavage :......................................................................................................44

I - 4.4 - Elution :......................................................................................................44

I - 4.5 - Nettoyage en place :...................................................................................45

II - HYDRODYNAMIQUE ET TRANSFERTS DE MASSE EN LIT EXPANSE :.......47

II - 1 - L

A FLUIDISATION :...............................................................................................47

II - 2 - E

XPANSION ET CLASSIFICATION :.........................................................................49

II - 2.1 - Classification :..........................................................................................49

II - 2.2 - Modélisation du degré d"expansion :........................................................50

II - 3 - M

ODELISATION DE LA CHROMATOGRAPHIE EN LIT EXPANSE :..............................53

II - 3.1 - Les modèles globaux :...............................................................................53

TABLE des MATIERES

- 8 -

II - 3.2 - Modèles plus complexes :..........................................................................57

II - 4 - L

ES RESISTANCES AU TRANSFERT DE MASSE :......................................................58

II - 4.1 - L"équilibre d"adsorption :.........................................................................59

II - 4.2 - La dispersion dans la phase liquide :........................................................59

II - 4.3 - La dispersion de la phase solide :.............................................................61

II - 4.4 - La diffusion intraparticulaire :..................................................................62

II - 4.5 - Le transfert de masse externe :..................................................................64

III - LES INTERACTIONS CELLULES / SUPPORT EN CHROMATOGRAPHIE EN

LIT EXPANSE.......................................................................................................................67

III - 1 - L

ES DIFFERENTES TECHNIQUES D"ETUDE DES INTERACTIONS CELLULES/SUPPORT :

III - 1.1 - Evaluation de la compétition entre protéines et cellules :.......................67

III - 1.2 - Mesure des interactions directes cellules/support :.................................68

III - 1.3 - Mesure de la stabilité du lit :...................................................................69

III - 2 - I

NFLUENCE DE LA PRESENCE DE CELLULES SUR LES PERFORMANCES :................69 III - 2.1 - Influence de la présence de cellules sur le transfert de masse des

protéines :.........................................................................................................................70

III - 2.2 - Influence de la présence de cellules sur la stabilité du lit et

l"hydrodynamique :..........................................................................................................71

III - 3 - L

ES PARAMETRES INFLUENÇANT LES INTERACTIONS DES CELLULES AVEC LE

SUPPORT

III - 3.1 - Influence du type de support de chromatographie :................................74

III - 3.2 - Influence du type de cellules :..................................................................75

III - 4 - M

ODELISATION DE L"INTERACTION DES CELLULES AVEC LE SUPPORT EN

CHROMATOGRAPHIE EN LIT EXPANSE

III - 4.1 - Un phénomène en deux temps :................................................................77

III - 4.2 - Etude du potentiel zêta :...........................................................................79

IV - LES DIFFERENTES INTERACTIONS ENTRE MICROORGANISME ET

IV - 1 - L

ES DIFFERENTS TYPES D"INTERACTIONS :..........................................................82

IV - 1.1 - Interactions liées aux forces de van der Waals :.....................................83

IV - 1.1.1 - Effet d"orientation :...............................................................................83

IV - 1.1.2 - Effet d"induction :.................................................................................83

IV - 1.1.3 - Effet de dispersion :..............................................................................83

TABLE des MATIERES

- 9 -

IV - 1.2 - Interactions électrostatiques :..................................................................84

IV - 1.3 - Interactions polaires :..............................................................................86

IV - 1.3.1 - Liaison hydrogène :..............................................................................86

IV - 1.3.2 - Répulsion hydrophile :..........................................................................86

IV - 1.3.3 - Attraction hydrophobe :........................................................................86

IV - 1.4 - Théorie D.L.V.O. étendue :......................................................................87

CHAPITRE II : MATERIEL et METHODES

I - MATERIEL UTILISE......................................................................................................93

I - 1 - S

UPPORTS :............................................................................................................93

I - 2 - C

OLONNES DE CHROMATOGRAPHIE :.....................................................................94

I - 2.1 - Chromatographie en lit fixe :.....................................................................94

I - 2.2 - Chromatographie en lit expansé :..............................................................94

I - 3 - C

ELLULES :............................................................................................................96

I - 4 - M

ILIEUX DE CULTURE :..........................................................................................97

I - 4.1 - Milieu solide :.............................................................................................97

I - 4.2 - Milieux liquides :........................................................................................97

I - 4.2.1 - Milieu de culture de Saccharomyces cerevisiae :....................................97

I - 4.2.2 - Milieu de culture de Yarrowia lipolytica :...............................................97

I - 5 - P

ROTEINES :...........................................................................................................98

II - CARACTERISTIQUES ET PERFORMANCES D"UNE COLONNE A

DISTRIBUTEUR CONIQUE...............................................................................................99

II - 1 - C

ARACTERISATION DU SUPPORT DE CHROMATOGRAPHIE :...................................99 II - 1.1 - Détermination de la masse volumique du support :..................................99 II - 1.2 - Détermination de la distribution de taille des billes adsorbantes :..........99 II - 1.3 - Détermination de la porosité particulaire

P :........................................100

II - 2 - I

SOTHERMES D"ADSORPTION DE PROTEINES SUR LE SUPPORT :...........................100

II - 3 - C

INETIQUES D"ADSORPTION DE PROTEINES SUR LE SUPPORT :............................102

II - 4 - C

OURBES DE PERÇAGE DE BSA ET LYSOZYME SUR SUPPORT ECHANGEUR D"IONS

EN LIT FIXE

II - 4.1 - Détermination du volume mort du système :...........................................102

II - 4.2 - Réalisation des courbes de perçage :......................................................103

II - 4.3 - Calcul de la capacité dynamique d"adsorption :....................................103

II - 5 - E

TUDE EN LIT EXPANSE :....................................................................................103

TABLE des MATIERES

- 10 -

II - 5.1 - Détermination du volume mort :.............................................................103

II - 5.2 - Mesure du degré d"expansion :...............................................................104

II - 5.3 - Etude de la distribution des temps de séjour - Calcul du nombre de

plateaux théoriques :......................................................................................................104

II - 5.3.1 - Etude de la distribution des temps de séjour........................................104

II - 5.3.2 - Calcul du nombre de plateaux théoriques............................................105

II - 5.4 - Courbes de perçage de BSA sur le support échangeur d"anions Q Hyper Z

en lit expansé :................................................................................................................105

II - 5.5 - Impulsions de bleu dextran en lit expansé en présence de levures :.......105 II - 5.6 - Détermination du taux de vide interstitiel en lit expansé ei :..................106 III - ETUDE DES INTERACTIONS DE LA LEVURE S.CEREVISIAE AVEC LE

SUPPORT :...........................................................................................................................107

III - 1 - C

ULTURE DES LEVURES S.CEREVISIAE :.............................................................107

III - 1.1 - Conditions de culture :...........................................................................107

III - 1.2 - Mesure de la biomasse par gravimétrie ou turbidimétrie :...................107

III - 1.2.1 - Gravimétrie :.......................................................................................107

III - 1.2.2 - Turbidimétrie :....................................................................................108

III - 1.3 - Dosage du glucose résiduel :.................................................................108

III - 2 - C

ARACTERISATION DES LEVURES :....................................................................108

III - 2.1 - Mobilité électrophorétique des levures :...............................................108

III - 2.2 - Méthode MATS.......................................................................................109

III - 2.3 - Chambre à écoulement cisaillé :............................................................110

III - 2.3.1 - Levures et surfaces solides :................................................................110

III - 2.3.2 - Composition de la chambre :..............................................................110

III - 2.3.3 - Expériences de détachement :.............................................................111

III - 2.4 - Mesure du diamètre des levures :..........................................................112

III - 2.5 - Mesure de la viscosité de la suspension de levures :.............................112

III - 3 - C

ARACTERISATION DU SUPPORT DE CHROMATOGRAPHIE :................................112

III - 3.1 - Expériences de sédimentation du support :...........................................112

III - 3.2 - Détermination des propriétés physico-chimiques du support par montée

capillaire :......................................................................................................................113

III - 3.3 - Détermination du potentiel zêta du support Q Hyper Z par mesure du

potentiel d"écoulement :.................................................................................................115

TABLE des MATIERES

- 11 - III - 4 - CINETIQUES D"ADSORPTION DE LEVURES SUR LE SUPPORT DE CHROMATOGRAPHIE,

EN LIT EXPANSE :.................................................................................................................116

III - 5 - M

ICROSCOPIE ELECTRONIQUE A BALAYAGE :...................................................117 IV - PURIFICATION DE LA LIPASE DE YARROWIA LIPOLYTICA PAR

CHROMATOGRAPHIE EN LIT EXPANSE DANS UNE COLONNE A

DISTRIBUTEUR CONIQUE.............................................................................................118

IV - 1 - P

RODUCTION DE LA LIPASE DE YARROWIA LIPOLYTICA :.....................................118

IV - 2 - D

ETERMINATION DU POINT ISOELECTRIQUE DE LA LIPASE :..............................119

IV - 3 - C

ARACTERISATION DES LEVURES Y.LIPOLYTICA ET DU SUPPORT CM HYPER Z :119

IV - 3.1 - Mesure de la mobilité électrophorétique des levures :..........................119

IV - 3.2 - Cinétique d"adsorption de levures Y.lipolytica sur le support CM Hyper

Z :...................................................................................................................................119

IV - 4 - P

URIFICATION DE LA LIPASE EN CHROMATOGRAPHIE EN LIT FIXE :...................120

IV - 5 - O

PTIMISATION DE LA PURIFICATION DE LIPASE EN LIT EXPANSE :.....................120

IV - 6 - C

OURBES DE PERÇAGE DE LIPASE SUR CM HYPER Z :......................................121

IV - 6.1 - Courbe de perçage en lit fixe :...............................................................121

IV - 6.2 - Courbe de perçage en lit expansé :........................................................121

IV - 7 - P

URIFICATION DE LA LIPASE EN LIT EXPANSE SUR COLONNE A DISTRIBUTEUR

CONIQUE

IV - 8 - D

OSAGE D"ACTIVITE LIPASE :...........................................................................122

IV - 8.1 - Détection de l"activité lipase :...............................................................122

IV - 8.2 - Dosage de l"activité lipase :...................................................................122

IV - 9

- DOSAGE DES PROTEINES TOTALES PAR LA METHODE DE BRADFORD :..............123

IV - 10 - E

LECTROPHORESE EN CONDITIONS DENATURANTES SDS-PAGE :.................123

CHAPITRE III : RESULTATS et DISCUSSION

I - CARACTERISTIQUES ET PERFORMANCES D"UNE COLONNE A

DISTRIBUTEUR CONIQUE.............................................................................................127

I - 1 - C

ONCEPTION DE LA COLONNE A DISTRIBUTEUR CONIQUE :..................................127

I - 2 - E

TUDE DE LA FLUIDISATION DU LIT DANS LA COLONNE A DISTRIBUTEUR CONIQUE :

I - 2.1 - Influence de la hauteur de lit sédimenté :.................................................130

I - 2.2 - Influence du distributeur sur la fluidisation du support :.........................131 I - 2.3 - Comparaison avec la corrélation de Richardson-Zaki :..........................132

TABLE des MATIERES

- 12 - I - 3 - HYDRODYNAMIQUE ET TRANSFERT DE MASSE DANS LA COLONNE A DISTRIBUTEUR

CONIQUE

I - 3.1 - Caractérisation des supports échangeur d"ions :....................................137

I - 3.1.1 - Isothermes d"adsorption :......................................................................137

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