Chromatographie de partage: en mode normal; en mode inversé; Phases stationnaires 2 Chromatographie d'adsorption Les solvants 3 Chromatographie
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[PDF] 4 CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE
a) chromatographie d'adsorption b) chromatographie de partage c) chromatographie par échange d'ions d) chromatographie par exclusion de taille
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Chromatographie de partage () 4 2 1 Principe 4 2 2 Chromatographie en phase normale 4 2 3 Chromatographie de partage à polarité de phase inversée
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Coefficient de partage: rapport des concentrations respectives du soluté dans la phase stationnaire et la phase mobile, au cours de l'analyse 4 13 Valeurs de
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Les chromatographies de partage : - La chromatographie liquide-liquide (CLL) ou chromatographie de partage : la phase stationnaire est un liquide immobilisé
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La chromatographie d'adsorption est basée sur le partage des solutés entre l' adsorbant solide fixe et la phase mobile Chacun des solutés est soumis à une force
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Chromatographie de partage: en mode normal; en mode inversé; Phases stationnaires 2 Chromatographie d'adsorption Les solvants 3 Chromatographie
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la chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP ou HPLC en La phase stationnaire en chromatographie de partage doit être chimiquement
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La Chromatographie La Chromatographie
en Phase Liquideen Phase LiquideCPLCPL
MariePaule Bassez
http://chemphys.ustrasbg.fr/mpb PLANIntroduction
1. Chromatographie de partage: en mode normal;en mode inversé;Phases stationnaires
2. Chromatographie d'adsorption
Les solvants
3. Chromatographie d'exclusion st
érique4. Chromatographie ionique ou par
échange d'ions5. Chromatographie d'affinit
é6. Chromatographie liquide chirale
7. Electrochromatographie capillaire
7.1 Introduction
7.2 Flux
électroosmotique7.3 Electrochromatographie sur colonne capillaire remplie et nonremplie7.4 Chromatographie
électrocinétique micellaire capillaire
8. L' instrumentation
8.1 Réservoirs8.2 Pompes
8.3 Injecteurs d'
échantillon 8.4 Colonnes
8.5 Détecteurs9. Chromatographie planaire
9.1 Introduction
9.2 D
épôt de l'échantillon9.3 D
éveloppement de la plaque9.4 D
étection 9.5 Chromatographie bidimensionnelle9.6 Phases stationnaires
9.7 Grandeurs Chromatographiques
Bibliographie
Tableau 1. Les différentes techniques chromatographiques Phase Mobile PS2 3 4 5 1 Introduction
liq (LLC) P. organ. polaire/apol. (LPgreffée)partage
(LLC)LPgreff
éeLC, CPLSFC, CPSGC, CPG
67 d'apr
ès C. Poole 2003, p5 et http://web.uconn.edu/rusling/Stuart_intro.pdf gel partage (ECC)Les techniques chromatographiques peuvent être classées selon le type de phase stationnaire et mobile.
Que la PM soit gazeuse, liquide ou supercritique, la PS est située dans une colonne, travers
ée par la PM sous l'effet d'une pression extérieure. C'est la:chromatographie sur colonne column chromatography. La chromatographie liquide moderne utilise beaucoup d'oxydes inorganiques avec groupements fonctionnels organiques chimiquement liés: "bonded phases" ainsi que des polym
ères poreux.
Quand la PS est
étalée en fine couche sur une surface plane telle une plaque de verre (auparavant du papier) et que la PM se d
éplace sur cette couche sous l'effet de forces de capillarit é, la technique est appelée:chromatographie planaire ou sur couche mince planar or thinlayer chromatography (TLC) En considérant la nature de la phase stationnaire et son interaction avec les molécules de soluté, les séparations chromatographiques sont classées en 5 principaux types:
1. Chromatographie de partage en phase normale ou invers
ée2. Chromatographie d'adsorption
3. Chromatographie d'exclusion st
érique 4. Chromatographie sur
échangeur d'ions5. Chromatographie d'affinit
é6. Electrochromatographie
Rem. L'efficacit
é d'une colonne augmente quand la taille des particules de support diminue et donc que la hauteur
équivalente à un plateau théorique diminue. Pour obtenir un débit convenable avec des microparticules de 2 à 5 μm de diamètre, il faut exercer une forte pression sur la phase mobile. La CLHP, Chromatographie Liquide
à Haute Performance a donc
été longtemps appelée Chromatographie Liquide sous Haute Pression. Depuis 2004, l'UPLC, Ultra Performance Liquid Chromatography, avec PS de particules < 2 μm (cf. "Notions fondamentales de chromatographie".Les techniques chromatographiques (cf. tableau 1)
1. PS = film liquide imprégné sur un support solide (silice) ou phase organique greffée par liaison covalente et le M
chromatographie de partage ou chromatographie liquideliquide (LLC), * si la PM est plus polaire que la PS: chromatographie en mode inversé reversedphase chromatography (RPC)
2. PS = solide et MS = adsorption en surface de la PS:
chromatographie d'adsorption, (LSC)3. PS = solide avec pores uniformes et MS= la s
éparation des solutés selon leur taille:chromatographie d'exclusion stérique: sizeexclusion chromatography: (SEC)
4. PS = solide avec des sites ioniques et MS= interaction
électrostatique entre les ions de PM et les ions de PS: chromatographie ionique, ionexchange chrom. (IEC) or ionchrom. (IC)
5. PS = solide avec ion m
chromatographie d'affinit é sur ions métalliques immobilisés, affinity chromatogr. (AC)6. MS= entra
lectrochromatographie capillaire, ECC, capillary electrochromatography (CEC)7. PS = micelles charg
électrocinétique micellaire capillaire, CEMC, micellar electrokinetic chromatography (MEKC)1. Chromatographie de partageLe mécanisme de séparation est le partage entre la PM et la PS. La PS peut être un film liquide impr
égné sur un support (silice) mais il a tendance à être emporté avec la PM ("lessivage", "bleeding"), ou une phase organique fixée par liaison covalente sur un support (gel de silice) (phase greff
ée). On distingue deux types de chromatographie de partage selon les polarités relatives des phases mobile et stationnaire:Chromatographie à polarité de phase normaleChromatographie à polarité de phase normale
(mode normal ou direct): La phase stationnaire est polaire, de nature hydrophile, avec des groupements: amine: NH2 , nitrile: CN, dialcool ou diol: (CHOH)CH2OH, greff és sur la silice.La phase mobile est un solvant apolaire, de nature lipophile : l'hexane ou l' éther ipropylique (isopropylique) ((CH3)2CHOCH(CH3)2).Le solut
é le moins polaire est élué en premier. (rem: alkyles: C8: (CH2)7CH3 et C18: (CH2)17CH3 , apolaires; ph
ényle: (CH2)nC6H5 apolaire)
Chromatographie à polarité de phase inverséeChromatographie à polarité de phase inversée
(reversed phase, mode inversé)c'est la phase stationnaire, constitu ée souvent d'un hydrocarbure qui est apolaire, de nature lipophile, avec des chaînes alkyles de C4 à C30 , des
groupements propyle, ph ényle, diphényle. La phase mobile est un solvant polaire, tel l'eau, le méthanol, ou le cyanure de m
éthyle (acétonitrile). Les colonnes C18 sont remplies de silice greffée en phase inverse C18 ,
ou "gel de silice C18" : SiOSi(CH3)2(CH2)17 CH3 ; les colonnes C4 sont utilis ées pour séparer les peptides et les protéines, les C30 pour les caroténoïdes et les flavanoïdes.
Le gel de siliceLe gel de silice
C'est un solide amorphe, un polymère inorganique de formule SiO2(H2O)n avec n proche de 0, la silice naturelle cristallineétantde formule: SiO2.. La structure
est de type t étraédrique avec groupements silanol: SiOH. Il est sous forme de: microsph ères de diamètre ~constant dans une même colonne (d = 112 μm). monolithe poreux: gel de silice d'une seule pièce dans la colonne. Il est tr
ès polaire. Avec un éluant apolaire, les solutés polaires sont retenus dans la colonne, contrairement aux solut
és apolaires qui sortent en premier. Le m
écanisme d'action du gel de silice repose sur l'adsorption. Avec les particules de faible diam ètre, d ~ 2 μm, la surface de contact ,la HEPT et l'efficacit é de la colonne . (cf Notions fondamentales) Synthèse du gel de siliceSynthèse du gel de silicetetraéthoxysilaneTEOS, Si(OEt)4,
tétraédrique(ou TMOS
t par condensation, il y a formation d'une liaison siloxane, et par polycondensation, d'un r éseau tridimensionnel de tétraèdres SiO4. Un tétraèdre est li é à d'autres. Il existe donc une formule chimique "moyenne" SiO2 . C'est une structure tétraèdrique de type SiO4 mais avec fonctions silanol. Par séchage, la taille des particules diminue. Il y a formation de microsph
ères poreuses.http://fr.wikipedia.org/wiki/Proc%C3%A9d%C3%A9_solgel F.ChaputFig. particule de gel de silice
Ref: H.HBauer, G.D.Christian, J.E.O'Reilly, Instrumental Analysis, 1978, Allyn and Bacon, p657 et http://web.uconn.edu/rusling/StuartLC3.pdfGroupements silanol associés par liaison hydrogèneFonctions silanolPont siloxane
Liaison hydrog
èneDes mol
écules d'eau peuvent se fixer par liaison hydrogène pour former un gel + ou hydrat
éOHOH2
pore microsphère poreuse sph
ères submicroniques
Si-OH : fonction silanol
Si O : groupement diméthylsiloxane
(de silicium, oxygène et alcane)Si - O - Si: pont ou liaison siloxaneSiH4 : silane (cf. CH4 méthane)
CH3 CH3 M ic r o p o r e u x d 2 n mM e s o p o r e u x 2 d 5 0 n mM a c r o p o r e u x d 5 0 n mL e s s o l i d e s p o r e u xzé ol it h esM C Mm o u ss e V O Ref: http://www.labos.upmc.fr/lcmcp/files/livage/Cours%20200506/51Microporeux.pptCompléments: Les monolithes siliciques http://www.lof.cnrs.fr/article.php3?id_article=255normes UIPCA
silice mésostructurée type hexagonalLes solides poreux mésoporeux dpore < 2 nmmicroporeux2 dpore>50nm zéolithesmousse V2O5 Fig. Photographies de gels de silice obtenues par
microscopie électronique à balayage.a) Les particules sont homog ènes; la porosité est de 50% et le diam
ètre des pores est de 10nm; la surface de contact (surface sp écifique) est de 150 m2/g. (porosit
é=Volume vide/ Vtotal)b) Le x
érogel a une porosité de 70%; sa surface de contact est de 300 m2/g et ses pores ont un diam ètre de 10nm.Rem. Pour les colonnes monolithiques, la porosit é peut atteindre 90% du volume total de la colonne. Ref. Kirkland 1996; K.Unger 1979 et site ;
ef. http://diffusiondessavoirs.uomlr.fr/balado/wpcontent/uploads/2008/01/chromatoliquide2007.pdfLe gel de silice comporte des pores de diff
érentes dimensions.
Fig. a) Photographie par microscope électronique à balayage MEB (Scanning Electron Microscope, SEM image) d'un monolithe poreux de gel de silice. Le diam
ètre moyen des pores est de 14,2 nm et la surface sp écifique de 105,3 m2/g.
b) S éparation d'acides organiques avec ce monolithe par électrochromatographie capillaire, ECC (capillary electrochromatography, CEC). L'efficacit
é de la colonne correspond
à 267 000 plateaux/m. PM: 10 mM citrate avec 40% acétonitrile; séparation à 10 kV. Ref. E.Grushka p.404 et site
Les phases stationnaires grefféesLes phases stationnaires greffées Le gel de silice est hydrophile. Ses caractéristiques évoluent dans le temps, ce qui conduit à un manque de reproductibilité. Pour diminuer sa polarité, il est rendu hydrophobe par fixation par liaison chimique de mol
écules organiques sur les fonctions silanol. Le gel de silice devient alors un support de la phase
stationnaire. L'oxyde de zirconium ZrO2 , l'oxyde de titane TiO2 ou l'alumine Al2O3 peuvent remplacer le gel de silice en qualit é de support. La s
éparation met alors en jeu des coefficients de partage et non des coefficients d'adsorption. Ces phases greff
ées dont la polarité est ajustable, sont utilis ées dans la: chromatographie liquidephase greff ée .
La plupart des supports à phase greffée sont constitués de siloxanes: Si OH + Cl SiR(CH3)2 SiO Si R(CH →3)2 + HCl silanol organochlorosilane siloxane dim éthylchlorosilane r
éaction de silanisation
Si R = groupement alkyle ou greffon alkyle en C8 (noctyle): - (CH2)7 CH3 ou en C18 (noctad écyle): - (CH2)17 CH3 la phase greffée est apolaire. La diff
érence d'électronégativité entre C et H est faible. P(C)=2,5 et P(H)=2,2. Plus la cha
îne est longue, plus le soluté est retenu et plus tR ↑. La PM (solvant) est polaire: m éthanol, eau. Les solutés polaires sont élués en 1er. D'autres types de greffons peuvent
être greffés sur du gel de silice: des porteurs de fonctions aminopropyle, cyanopropyle... ou des greffons dipolaires.
La polarit
é de la phase greffée augmente.
OSiCH3
CH3unit
é de base du diméthylsiloxane
Ref. C.Poole,The Essence of Chromat., Elsevier 2003, p285. http://web.uconn.edu/rusling/StuartLC3.pdfFig. Groupements fonctionnels R des organosiloxanes greffés. greffon
propyl propyl CH3 CH3 Si O Si (CH2)17 CH3noctad
écyle dim
éthylsiloxane
Ref. LCGC Asia, 8 (1), 2005
2. Chromatographie d'adsorption ou liquide-solide Il existe un mécanisme d'adsorption du soluté par la phase stationnaire solide et un m
écanisme d'élution (désorption) par la phase mobile liquide ou gazeuse. La 1 ère séparation chromatographique était de ce type: séparation de pigments végétaux sur de la craie (carbonate de calcium) par Tswett en 1906.
Dans le processus d'adsorption sur une surface, les liaisons sont de faible nergie: liaisons hydrogène, dipôledipôle ou de van der Waals.quotesdbs_dbs29.pdfusesText_35
Fig. Photographies de gels de silice obtenues par
microscopie électronique à balayage.a) Les particules sont homogènes; la porosité est de 50% et le diam
ètre des pores est de 10nm; la surface de contact (surface spécifique) est de 150 m2/g. (porosit
é=Volume vide/ Vtotal)b) Le x
érogel a une porosité de 70%; sa surface de contact est de 300 m2/g et ses pores ont un diam ètre de 10nm.Rem. Pour les colonnes monolithiques, la porosit é peut atteindre 90% du volume total de la colonne.Ref. Kirkland 1996; K.Unger 1979 et site ;
ef. http://diffusiondessavoirs.uomlr.fr/balado/wpcontent/uploads/2008/01/chromatoliquide2007.pdfLe gel de silice comporte des pores de diff
érentes dimensions.
Fig. a) Photographie par microscope électronique à balayage MEB (Scanning Electron Microscope, SEM image) d'un monolithe poreux de gel de silice. Le diam
ètre moyen des pores est de 14,2 nm et la surface spécifique de 105,3 m2/g.
b) Séparation d'acides organiques avec ce monolithe par électrochromatographie capillaire, ECC (capillary electrochromatography, CEC). L'efficacit
é de la colonne correspond
à 267 000 plateaux/m. PM: 10 mM citrate avec 40% acétonitrile; séparation à 10 kV. Ref. E.Grushka p.404 et site
Les phases stationnaires grefféesLes phases stationnaires greffées Le gel de silice est hydrophile. Ses caractéristiques évoluent dans le temps, ce qui conduità un manque de reproductibilité. Pour diminuer sa polarité, il est rendu hydrophobe par fixation par liaison chimique de mol
écules organiques sur les fonctions silanol. Le gel de silice devient alors un support de la phase
stationnaire. L'oxyde de zirconium ZrO2 , l'oxyde de titane TiO2 ou l'alumine Al2O3 peuvent remplacer le gel de silice en qualité de support. La s
éparation met alors en jeu des coefficients de partage et non des coefficients d'adsorption. Ces phases greff
ées dont la polarité est ajustable, sont utilis ées dans la: chromatographie liquidephase greffée .
La plupart des supports à phase greffée sont constitués de siloxanes: Si OH + Cl SiR(CH3)2 SiO Si R(CH →3)2 + HCl silanol organochlorosilane siloxane diméthylchlorosilane r
éaction de silanisation
Si R = groupement alkyle ou greffon alkyle en C8 (noctyle): - (CH2)7 CH3 ou en C18 (noctad écyle): - (CH2)17 CH3 la phase greffée est apolaire.La diff
érence d'électronégativité entre C et H est faible. P(C)=2,5 et P(H)=2,2.Plus la cha
îne est longue, plus le soluté est retenu et plus tR ↑. La PM (solvant) est polaire: méthanol, eau. Les solutés polaires sont élués en 1er. D'autres types de greffons peuvent
être greffés sur du gel de silice: des porteurs de fonctions aminopropyle, cyanopropyle... ou des greffons dipolaires.
La polarit
é de la phase greffée augmente.
OSiCH3
CH3unit
é de base du diméthylsiloxane
Ref. C.Poole,The Essence of Chromat., Elsevier 2003, p285. http://web.uconn.edu/rusling/StuartLC3.pdfFig. Groupements fonctionnels R des organosiloxanes greffés. greffon
propyl propyl CH3CH3 Si O Si (CH2)17 CH3noctad
écyle dim
éthylsiloxane
Ref. LCGC Asia, 8 (1), 2005
2. Chromatographie d'adsorption ou liquide-solide Il existe un mécanisme d'adsorption du soluté par la phase stationnaire solide et un m
écanisme d'élution (désorption) par la phase mobile liquide ou gazeuse. La 1ère séparation chromatographique était de ce type: séparation de pigments végétaux sur de la craie (carbonate de calcium) par Tswett en 1906.
Dans le processus d'adsorption sur une surface, les liaisons sont de faible nergie: liaisons hydrogène, dipôledipôle ou de van der Waals.quotesdbs_dbs29.pdfusesText_35