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méthode simple et non couteuse a permis le maintien de la viabilité des huitres pour une période permettant Test de viabilité cellulaire MTT (MOSSMAN ,

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DE LA VIABILITE DE CELLULES INFECTEES PAR LE VIRUS Pauwels et Coll (36) 6-1 Principe cellulaire 6 - METHODE AU MTT au MTT Deuxième partie : 

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Évaluation de la viabilité cellulaire par le test MTS lors de l'exposition à deux test MTT, les données du test WST-1 ont indiqué aucune cytotoxicité aiguë de 

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Z Appréciation de la viabilité cellulaire par la mesure de paramètres Evaluation de la réponse du test au MTT, en fonction du nombre de cellules en culture, 

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cellules, via le développement de méthodes in vitro appro- ment, la majorité des tests de cytotoxicité mesure la viabilité Ce test est similaire au test MTT,

LIGNE DIRECTRICE DE LOCDE POUR LES - OECD iLibrary

28 juil 2011 · il convient selon l'essai de viabilité/toxicité cellulaire utilisé Pour le test MTT, la formule suivante peut être utilisée: de cellules viables =

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conservée à -70°C Elle est utilisée dans les cultures cellulaire à une Viabilité des cellules Inhibition de croissance tumorale (test MTT ou WTS1) Le clivage  

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Tests de toxicité et tests sur les cellules SKRC59 dans les salles de culture du La viabilité cellulaire est mesurée par différentes techniques : test MTT, test 

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LIENS Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10

Qualité

des Fumées d'Incinération de Déchets

Evaluée par Mesure de la Cytotoxicité

sur Cellules de Type MacrophagiqueRAPPORT

DE THESE

DE

TOXICOLOGIE

DE L'ENVIRONNEMENT

UNIVERSITE

DE MEf,Z

Anne GERY

Date de soutenance : ler décembre 1997 lVlembres du Jury :

Docteur

F. ENGUEHARD, C.R.E.E.D., LIMAY

Professeur

M, GUERBET, Université de ROUEN, Rapporteur

hofesseur

P. VASSEUR, Université de METZ

Professeur

C. VOISIN, Institut Pasteur de LILLE, Rapporteur

BIBLIOTHEOUE

UNIVERSITAIRE DE METZilllril llill lllll lllil lllll lllil llill llil lllll llll llll llll 022

420625 5

RAPPORT

DE TIIESE

DE

TOXICOLOGIE

DE L'ENVIRONNEMENT

UNIVERSTTE

DE METZ

Qualité

des Fumées d'Incinération de Déchets

Evaluée

par Mesure de la Cytotoxicité sur Cetlules de Type Macrophagique

Anne GERY

Date de soutenance : ler décembre 1-aîeiiôr H e o tJ É u N rv5+)i rrA I R E g3Do8o5 I

Docteur

F. ENGUEHARD, C.R.E.E.D., LIMAY Ito'

Professeur

M. GUERBET, Université de ROUEN, Rapporteur

Professeur

P. VASSEUR, Université de METZ

Professeur

C. VOISIN, lnstitut Pasteur de LILLE, Rapporteur

RÉ

IVIERC IEIVIÉ|VTS

Merct au CREED Je tiens à remercier M. Georges Valentis, directeur du Centre de Recherches et d'Essais pour l,Environnement et le Déchet, pour m'avoir accueillie au CREED, pour m'avoir permis de faire cette thèse dans de bonnes conditions. Un merci particulier pour la grande satisfaction que j'ai eue à mettre en

place le laboratoire d'Ecotoxicologie. Merci à M. François Enguehard pour m'avoir épaulée

pendant ces années d'efforts. Merci enfin à tous les membres du CREED, ceux qui y sont ancrés comme ceux qui y passent le temps d'une mission, et qui lui donnent une âme. Et

puis, un immense merci à Véronique Baehm pour sa précieuse collaboration durant son stage au

CREED;

nous avons ensemble abattu rapidement un travail de qualité. Je salue également le sérieux et la gentillesse des autres stagiaires de passage au labo : successivement Estelle, Anne et Sophie. Merci

à Céline Boudard.

Merci

à SA/tP- Industries

Je remercie M. Michel Stérin et M. Hervé Martel, qui m'ont accueillie avec mes tuyaux, mes cuves, mes cellules au sein de I'usine SARP Industries de Limay, et qui m'y ont donné une grande liberté. Merci

pour leur aide à toute leurs équipes : le Four, le l-aboratoire, le Magasin, I'Atelier. J'ai acquis à

leur contact une expérience précieuse du terrain- Merci

à l'Institut Pasteur de Lille

Je voudrais exprimer ma reconnaissance au Pr Cyr Voisin pour son accueil, ses connaissances inestimables et son entrain : un grand merci pour le temps que vous avez consacré à la lecture de cette thèse, de laquelle vous avez accepté d'être Rapporteur. Merci aussi au Pr Benoît S/allaert, au

DrPhilippe

Gosset et à toute l'équipe de l'Institut Pasteur de Lille (particulièrement Christine Merdy et Catherine Fourneau), pour m'avoir fait une place dans leur laboratoire et pour m'avoir enseigné toutes

les techniques de culture cellulaire et d'analyse biochimique qui sont à la base de mon travail de

thèse. Je salue ici la qualité de leur collaboration. Merci au CSE Merci

au Pr Paul R. [,ehr, directeur CNRS, qui m'a épaulée au début de ma thèse, et au Pr Paule

Vasseur,

directeur du Centre des Sciences de l'Environnement, directeur de thèse et Présidente du Jury de thèse. Je vous suis profondément reconnaissante pour votre temps, votre attention, vos conseils. Mon enrichissement à votre contact depuis I'année 1988 est inestimable. Merci arn Membres du Jury Je

terminerai en remerciant vivement le Pr Michel Guerbet pour avoir accepté d'être Rapporteur de ma

thèse ; merci pour le temps que vous avezconsacré à la lecture et à I'analyse de mon travail. Merci

à rrufarnille

Pour terminer, je voudrais remercier mes proches, toutes celles et tous ceux qui m'ont accompagnée pendant ces quelques années.

Maman,

toujours là au bon moment. C'est grâce à toi que j'ai pu me lancer, mais surtout tenir dans cette aventure.

Milou,

Marraine, vous m'avez continuellement donné les plus vifs encouragements. Marraine, je te dédie I'ensemble de mon travail, car c'est avec toi que je I'ai terminé ; merci Marraine.

Nathalie,

Christine, et Mémère, vous avez été d'infaillibles supportrices.

Nolwenn,

tu m'as portée durant la fin de mon travail tandis que je te portais.

Enfin,

merci Jean-Yves pour le courage que tu m'as insufflé, le soutien que tu m'as apporté, le tout sans faille ni limite. 4V

4NT-pROpOS

[ae

travail que j'ai réalisé a eu pour but de mettre à la disposition de I'industriel un outil qu'il puisse

< en sortie de cheminée pour évaluer la qualité de ses effluents atmosphériques et en suivre l'évolution. Ce rapport n'a pas pour objet de juger si une usine d'incinération représente ou ne représente pas un quelconque danger pour I'environnement ou pour le voisinage du site industriel, mais bien de fournir à I'industriel un nouveau test pour ses fumées. [ae travail de recherche proprement dit est mené au CREED. Il est né d'une collaboration souhaitée par le CREED d'une part et le Pr Cyr VOISIN de I'Institut Pasteur de Lille d'autre part. La thèse de

Toxicologie

de l'Environnement de I'Université de Metz, dirigée par le h Paul LEHR puis par le pr paule Vasseur, est menée dans le cadre d'une convention CIFRE proposée par I'ANRT- Elle fait partie du grand projet Eurêka-INTEC (Integrated Technologies for Global Waste, 8 partenaires, 7 pays d'Europe, 70 millions d'EURO) qui a vu le jour en 1992. Une participation au projet de

I'Ademe

Ecotoxicité, suite à un appel d'offre lancée en août 1994, est également à souligner. Ce

travail fut en outre récompensé de l-auriers d'Honneur au concours Yvelines-Environnement 1995 organisé par la Chambre du Commerce et de I'Industrie de Versailles.

Brevet

: chaque matériel, chaque méthode, chaque protocol e,, a été arrêté et décrit étape après étape

dans un brevet no 95.06O28 du 22 de mai 1995 auprès de I'Institut National de la Propriété

Industrielle,

intitulé : procédé d'évaluation de la toxicité des fumées et appareillage pour Ia mise en

aeuvre d'un tel procédé. 4i: f'-.fi;. I ii,: i.,É:,: -*#rç:+ so tvt tvt4tRÉ

REMERCIEMENTS

AVANT.PROPOS

INTRODUCTION

PREMIERE

PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQI E.... .

A. CONTEXTE

DE LtETUDE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . ' 2

I. DECHETS

E-T INCINERATION ....2

l.

Nature des déchets incinérés. ""'2

2. Principe

de I'incinération ''''4

3. Incinération

et pollution atmosphérique ---- '"''''9 rr. EFFLUENTS

ATMOSPHERIQUES ET (ECO)TOXICOLOGIE ...... l1

l.

Toxicité des produits de combustion. " " " 1 1

2. Méthodes d'étude de la toxicité des fumées . " " 22 B. REACTIF BIOLOGIQUE FACE AUX FUMEES.....o.........r..................-29 r.

CELLULES DE TYPE MACROPHAGIQUE.. .... 2e

1. L-e modèle du macrophage alvéolaire (MA) ' ' '' ' 29 2. Cellules en lignée "de type macrophagique" ... . 30 II. PARAMETRES BIOCHIIVIIQUES CARACTERISTIQUES DES CELLULES.... .... 32 1. Activité cellulaire de trois molécules anti-oxydantes " " " ' 32 2. Viabilité cellulaire et cwotoxicité .. " ' 34

OBJECTIFS

de la thèsg.... ...... ...... .... -...38

DEUXIEME

PARTIE : MATERIELS ET METHODES39

A. MATERIEL

BIOLOGIQUE ET METHODES D'ANALYSES............ -.. o...... 39

I. CELLULES

ET CULTURE CELLUI.AIRE. ...... 39

l. Récolte des macrophages alvéolaires (MA) ' ' ' ' ' 39

2. Entretien

des lignées cellulaires (THP-I et U-937) ... ""' 39

3. Culture

cellulaire en phase gazeuse " N 4. Culture des cellules en vue des analyses biochimiques .... 42

II. MODES

D'ETUDE DE I-A VIABILITE CELLUI.AIRE .... 43

1. Organisation

des manipulations.... " 43 2.

Emploi d'un sel de tétrazolium : le MTT " 4

3. Dosage

de I'adénosine triphosphate intracellulaire (ATP) " " " ' 45

4. Dosage

de la lacticodéshydrogénase cellulaire après V+h (LDH-}/+ h)... -. -.... AE

5. Dosage

de I'acide désoxyribo nucléique de la cellule (ADN) " ' 47

6. Suivi

de la cinétique de viabilité cellulaire. """ 49

III. MODES

D'ETUDE DE L'ACTIVITE CELLUT-AIREANTI-OXYDANTE ... .. 50 l.Organisationdesmanipulations ""'' 50 2. Mesure de I'activité du glutathion (GSH, GSSG) " ' 50

3. Mesure

de I'activité de la superoxyde dismutase (SOD) "' 52

4. Dosage

de la catalase (CAT) .... " " " 54 B. MATERIELS ET METHODES, POUR L'EXPOSITION CELLULAIRE AUX GAZ

ET FUMEES.

.. r .. .. . . . . .. .. ...... . .. .. . . . r.... . . t ... . ... ... . .. . . . . . t .... .. ... .. t ' t ' ' ' t t t t 57

I. MODE

D'D(POSITION CELLULAIRE. .... 57

l. Critères d'une exposition satisfaisante. " " 57

2. Chambres

d'exposition " " 58 3.

Méthode d'exposition. ""' 59

II. GALSIMPLES

ET FUMEES DE TABAC : ESSAIS DE IABORATOIRE. .. -.. 60

1. Essais

sur des gaz simples .. " " 60

2. Essais

sur des fumées de combustion " " ' 61

III. PRELEVEMENT

ET ECHANTILLONNAGE DES FUMEES D'INCINERATION DE

DECHETS:

ESSAIS DETERRAIN..- "" 62

1.

Prélèvement de fumées.... """ 62

2. Prélèvement

de poussières de fumées .... " " " ' ae 3.

Avantages et inconvénients . " " 65

4. Contrôle de la qualité des fumées ... " " " ' 66

5. Conditions

et calendrier des manipulations sur site " 66 C.

OUTIL STATISTIQUE67

A. ADAPTATION

DE TECHNIQUES POUR LE TEST68

I. MISE AU POINT D'UNE LIGNE D'ECHANTILLONNAGE AVEC SECHAGE DES FUMEES PAR

PERMEATION ....... 68

rr. cHolx DEs CELLULES, LE REACTIF BIOLOGIQUE DU TEST ... .... 68 1.

Comportement en culture des cellules ' ' ' ' ' 68

2. Comparaisons

avec le macrophage alvéolaire.. -.. " " 69 rII. ADAPIATION DE l-{ METHODE AU MTT (VIABILITE) . - - - 7O 1. Concentration de MTT et intensité de coloration .... " " " ' 70 2.

Dissolution des cristaux de Formazan " " ' 70

3.

Coloration au MTT et nombre de cellules... " " 7I

4. Remarque

sur le choix du sel de tétrazolium MTT ' ' ' 7 | B. COMPORTEMENT DES CELLULES EN CULTURE EN PHASE GAZEUSE. ..72 I.

RESULTATS ET ANALYSE DES MESURES BIOCHIMIQUES72

72
l. Viabilité des cellules THP- I . .. . 2. Cinétique de la viabilité cellulaire... " 73

3. Activité

anti-oxydante des cellules.. ""''' 74 rr.

DrscussloN DES RESULTATS BIOCHIMIQUES.... ... 76

l.I-aphase gazeuse constitue un nouvel état de culture pour la cellule . -.. -.. 76

Z. Appréciation

de la viabilité cellulaire par la mesure de paramètres métaboliques : méthode au MTf, nTP intracellulaire et LDH cellulaire " 77

3. Appréciation

du nombre de cellules en culture, par des mesures d'ADN cellulaire .. ... -.. 78 a. Equipement antioxydant de la cellule " " " 80 C. ESSAIS DE LABORATOIRE : SUR GAZ SIMPLES ET SUR FUMEES DE

TABAC...

a a a . . . . r a ... . .. a .. .. . . ... . . . .a . a . .. . . .. .... .. . .. .... .... . . . . ... .. . ' " t ' t ' " ' ' t t t t Ez

I. RESULTATS

ET ANALYSE D'ESSAIS SUR GAZ SIMPLES.... ....82

1. Exposition

des cellules au dioxyde d'azote (NOz) - . . 82

2. Exposition

des cellules au dioxyde de soufre (SOz) . -. - -.. 82

3. Exposition

des cellules au chlorure d'hydrogène (HCl).... ..... 83 II. RESULTATS ET ANALYSE D'ESSAIS SUR FLIMEES DE TABAC ..... &I III. DISCUSSION DES RESULTATS DES ESSAIS DE I-ABORATOIRE . .. 84

1. Une

réponse linéaire du test biologique face aux gaz simples NOz, SOz et HCI ..... 84

2.IJne

réponse mitigée du test biologique face aux fumées de tabac (phase gazeuse) . . 86

3. Une

sensibilité comparable des méthodes MTT et ATP face à NO2, et une sensibilité plus fo{9 de la méthode

ATP face à SOz et aux fumées de tabac .. 87

4. Une

réaction similaire pour les trois types cellulaires.... .. 88 C. ESSAIS DE TERRAIN SUR DES FUMEES D'INCINERATION DE DECHETS 89 I. TOXICITE DES FUMEES TOTALES PAR LE TEST BIOLOGIQUE . -. -.. 89

1. Présentation

des graphes des résultats " ' " 89

2.Analysedesrésultats

"""' 90 II. CULTURE CELLUIAIRE SUR DES POUSSIERES DE FUMEES ....... 91

III. DISCUSSION

DES RESULTATS DES ESSAIS DE TERRAIN.. ... 92

1. Une

évaluation globale de la qualité des fumées. . . . . . 92 2. Conêlations négatives à la toxicité " ' 92

3. Conélations

positives à la toxicité... """' 93 4.

Impact des poussières de fumées. " " 93

D.

DISCUSSION GENERALE ET CONCLUSION94

I.

CHOIX DE CELLULES THP- I .... ..... 94

II. BONNE SURVIE DES CELLULES THP-1 EN PHASE GAZEUSE.. .....94 Irr. EMPLOI DU MTT POUR ESTIMER I,{ CYTOTOXICITE . ... e5

IV. APPLICATION

DU TEST BIOLOGIQUE FACE AUX GAZ SIMPLES, AUX FUMEES ET AUX

POUSSIERES ....... 96

V. MOBILITE

DU TEST DETERRAIN..

CONCLUSION

GENERALE9E

REFERENCES

BIBLIOGRAPHIQUES. . o. . ... .. . .. . . . . . .. ... .... . . . o .. . . . . . . . . . . . . . . .100

FIGURES

(schémas et graPhes)

Figure

1. Nature et répartition des déchets en France .-......2

Figure

2. Composition et variation des OM dans la CEE et aux USA. """'2

Figure

3. Devenir des ordures ménagères en France ......... 3

Figure

4. Répartition de la masse des déchets entre différents produits issus de la combustion :

màchefer, poussière de filtration et gazpurifié " " 6

Figure

5. Formules chimiques des PCDD et PCDF. ....... L7

Figure

6. Formule chimique de la 2,3,7 ,8 TCDD. ' ' ' l8

Figure

7. Répartition des métaux : fer (Fe), cuivre (Cu), zinc (Zn), plomb (Pb), cadmium (Cd) et

rnrr"urr (Hg) entre les produits issus de I'incinération. .... 19

Figure

8. Schéma des conditions d'exposition des cellules à I'atmosphère urbaine . - 28

Figure

9. Schéma expérimental de I'exposition des cellules aux gaz d'échappements de véhicule

diesel """' 28quotesdbs_dbs32.pdfusesText_38