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Protocole d'extraction d'ADN de Pseudomonas aeruginosa La qualité de l'ADN obtenu permet d'effectuer des PCRs et la technique de RFLP A partir de colonies sur boîte de milieu gélosé Prélever une anse pleine de colonies sur une boîte et les transférer dans un tube (plastique à vis de 15ml) contenant 3 ml de tampon ADN TE (Tris 10mM, EDTA

1mM pH8).

Vortexer pour resuspendre les bactéries.

Ajouter 3ml de tampon de lyse 2X (1% de SDS, 20mM NaCl, 20mM Tris pH8,

20mM EDTA) pour lyser les bactéries.

Ajouter la protéinase K à une concentration finale de 100µg/ml (solution stock de

10mg/ml conservée à 20°C) et incuber toute la nuit à 37°C.

Le lysat peut ensuite être conservé à 4°C. Dans certains cas, il peut être utilisé pour

une PCR après dilution au 1/50 dans de l'eau.

Extraction au phénol/chloroforme

Traitement au CTAB

Pour des bactéries contenant d'importantes quantités d'alginates, il est nécessaire de traiter le lysat après l'action de la protéinase K avec du CTAB. Diluer le lysat si nécessaire avec du tampon ADN TE pour diminuer la viscosité. Dans des tubes eppendorf de 2ml mettre 600µl de lysat SDS/protéinase K. Ajouter ensuite 100µl de solution de Nacl 5M (0,7M final) dans chacun des tubes puis agiter. Ajouter 40µl d'une solution de CTAB/Nacl (10% CTAB dans 0,7M Nacl) dans chacun des tubes puis laisser incuber 10 minutes à 65°C. Remarque : La solution de CTAB/Nacl étant très épaisse il est plus pratique de couper les pointes des cones pour aspirer plus facilement cette solution. Les étapes suivantes se feront sous la hotte chimie (sauf les centrifugations) : - Ajouter 750µl de chloroforme dans chaque tube puis agiter pour homogénéiser la solution. - Centrifuger à 13000g à 15°C pendant 15 minutes. - On récupère la phase supérieure sans aspirer l'interphase (voir schéma en fin de paragraphe) et on la transfère dans un nouveau tube de 2ml. - Ajouter 750µl de phénol saturé à pH 7,5 puis agiter pendant une minute pour bien homogénéiser. - Centrifuger à 13000g à 15°C pendant 15 minutes. - On récupère la phase supérieure et on la transfère dans un nouveau tube de 2ml. - Ajouter 750µl de chloroforme dans chaque tube puis agiter pour homogénéiser la solution. Cette 2

ème

extraction au chloroforme sert à éliminer le phénol qui n'a pas été éliminé à l'étape p récédente. - Centrifugation à 13000g à 15°C pendant 15 minutes. - On récupère la fraction supérieure et on la transfère dans un nouveau tube de 2ml.

Surnageant à

récupérer

Interphase à ne

pas toucher

Solution à

éliminer

Pour les étapes suivantes on ne travaille plus sous hotte : - Ajout de 2 volumes d'éthanol pur. On retourne plusieurs fois le tube et on peut voir apparaître un filament blanc ou un amas correspondant à l'ADN extrait. - Centrifuger à 13000g à 15°C pendant 15 minutes. - On retourne le tube afin d'éliminer l'éthanol et de récupérer seulement le culot d'ADN qui reste collé au fond du tube. Attention l'ADN peut se détacher du fond du tube et être éliminé avec l'éthanol, on utilise alors la pipette afin d'éliminer l'éthanol sans le culot. - Ajouter 500µl d'éthanol à 80%. - Centrifuger à 13000g à 15°C pendant 10 minutes. - On retourne le tube afin d'éliminer l'éthanol puis on laisse sécher les culots obtenus en laissant les bouchons des tubes ouverts. Après une nuit de " séchage » des culots à température ambiante, on ajoute 200µl de tampon ADN TE et on laisse le culot d'ADN se réhydrater pendant 2 à 3 heures. Ensuite on réalise une lecture de densité optique (DO) pour connaître la concentration d'ADN dans chacun des tubes. Lecture de densité optique (DO) par spectrométrie Cette lecture est réalisée à l'aide du spectrophotomètre Nano Drop® ND-1000 spectrophotometer (Labtech International) Il est possible d'obtenir les valeurs de DO ainsi que les spectres de 220 à 280nm.quotesdbs_dbs16.pdfusesText_22