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Mémoire

Mastère en chimie analytique

LATIFA BEN SAAD

ÉTUDE DE LA SÉPARATION DES FLUOROQUINOLONES PAR HPLC: APPLICATION À ÉTUDE DE LEUR DÉGRADATION

PAR RAYONNEMENT GAMMA

19 /12/2013 devant les membres du Jury:

Dédicace

-H GpGLH ŃH PUMYMLO j "

A mes parents,

3RXU P·MYRLU VRXPHQXH PRXP MX ORQJ GH PHV pPXGHVB

3RXU P·MYRLU SHUPLVe G·rPUH TXL ÓH VXLVB

A PHV V±XUV

Pour tous les bons moments passés ensemble.

Pour avoir été toujours présentes à mes cotés TXMQG Ó·en avais besoin.

A mes frères,

4X·LOV PURXYHQP GMQV ŃH PRGHVPH PUMYMLO OM SUHXYH GH PRQ MPRXU HP PM

gratitude éternelle. A mes amis et à PRXV ŃHX[ TXH Ó·MLPH HP TXL P·MLPHQP.

Remerciements

Ce travail a été réalisé au Centre National des Sciences et Technologie Nucléaire

en Chimie Analytique à la Faculté des Sciences de Tunis. Je remercie infiniment Madame Faten BOUJELBANE-assistante au Centre National des Sciences et Technologies Nucléaires pour son encadrement, sa disponibilité ainsi Je remercie également Monsieur Fathi OUESLATI± recherche et des Technologies des eaux pour son aide et ses conseils. Mes vifs remerciements s'adressent à Monsieur Mohamed Taieb BEN DHIA de Conférences à la Faculté de Sciences de Tunis, qui a accepté de présider ce jury. Mes sincères remerciements s'adressent à Monsieur Mohamed SAMAALI leurs encouragements et leurs aides.

Sommaire

Introduction générale ............................................................................................................... 1

Chapitre I : Présentation des fluoroquinolones et leurs propriétés physico-chimiques .... 2 ............................................................................... 3

1. Présentation générale des fluoroquinolones.................................................................... 3

2. Structure chimique des fluoroquinolones ....................................................................... 4

............................................................................... 4 ................................................. 5

..................................................................................................... 5

ssification des quinolones ............................................................................................. 5

génération ................................................................................................... 6

.................................................................................................. 6

génération................................................................................................... 6

quatrième génération ................................................................................................. 6

.......................................................................... 6 -chimiques de Lévofloxacine ............................................. 7 -chimiques de Loméfloxacine ............................................ 8 -chimiques de Ciprofloxacine ............................................ 9 ............................. 11 Chapitre II : La chromatographie liquide à haute

performance HPLC ................................................................................................................ 13

........................................................................................................... 14

...................................................................................................................... 14

................................................................................. 14 .............................................. 15

..................................................................................................... 15

.................................................................................................................. 16

................................................................................. 16

b. La pompe ................................................................................................................... 17

La colonne ................................................................................................................. 17

............................................................................................................... 19

. 19 ............................................................................................ 22

5. Aperçu sur les paramètres chromatographiques de séparation ..................................... 24

Chapitre III .......... 28

....................................................................................................................... 29

...................................................................................... 29 ......................................................................................... 29

-Préparation des solutions ........................................................................................... 30

......................................................................................... 31 .......................................................................... 37 ................................................................................... 39

Chapitre IV ................. 42

................................................................................................................... 43

........................................................................................ 43 ........................................................................ 43 ............................................................................................... 43

.................................................................................................. 44

............................................................................................. 44 ............................................................ 45 ................................................................................................. 45 ..................................................................... 47 .................................................. 48 -à-vis des rayonnements gamma ....................... 49

........................................................................................................... 49

............................... 56 .............................................. 59

Conclusion générale ............................................................................................................... 63

Références bibliographiques

Liste des figures

-développée de la Lévofloxacine...................................................... 7

: Formule semi-développée de la Loméfloxacine ...................................................... 9

: Formule semi-développée de la Ciprofloxacine ..................................................... 10

: Spectre UV de la Ciprofloxacine ........................................................................ 31

nes enregistré dans les conditions opératoires : phase mobile : tampon phosphate (0,02M) ±acétonitrile (80/ 20 v/v)

à pH = 5 ; colonne Xterra RP-18 ........................................................................................... 33

: Chromatogramme du mélange des cinq fluoroquinolonnes enregistré dans les conditions opératoires : phase mobile : tampon phosphate (0,02M) ±acétonitrile (80/20 v/v)

à pH = 5 ; colonne PRISM RP-18 .......................................................................................... 33

....................... 35 : Variation des temps de rétention (tr) des fluoroquinolones par les deux

colonnes : ............................................................................................................................... 36

-18 et PRISM RP-18 .............................................................................................. 36

ntion des fluoroquinolones en fonction du pH ......... 38 conditions opératoires : phase mobile : tampon phosphate (0,02 M) ±acétonitrile (80/20,

v/v) à pH = 6 ; ........................................................................................................................ 39

-18 ............................................................................................................ 39

conditions opératoires ; phase mobile: tampon phosphate (0,02M) ±acétonitrile (80/20; v/v)

à pH = 3; ................................................................................................................................ 39

-18............................................................................................................ 39

................................................ 40 ramme du mélange des cinq fluoroquinolones enregistre dans les conditions opératoires ; phase mobile: tampon phosphate (0,02M) ±

à pH = 3; colonne Xterra RP-18 ............................................................................................ 41

....................................................................... 45 de la solution de Ciprofloxacine (100 ppm) avant irradiation (a) et après irradiation (b) : enregistrés avec; phase mobile : tampon phosphate (0,02M) ±

acétonitrile (80 :20 v/v) à pH = 3 ; colonne Xterra RP-18 (250 mm x 4,6mm ; 5µm) .......... 50

: phase mobile : tampon phosphate (0,02M) ±

acétonitrile (80/20 ; v/v) à pH = 3 ; colonne Xterra RP-18 (250mm x 4,6mm ; 5µm) .......... 51

mmes de la solution de Lévofloxacine (100 ppm) avant irradiation (a), après irradiation (b), enregistrés avec : phase mobile : tampon phosphate (0,02M) ±

acétonitrile (80/20 ; v/v) à pH = 3 ; colonne Xterra RP-18(250 mm x 4,6mm ; 5µm) .......... 52

(a), après irradiation (b), enregistrés avec; phase mobile : tampon phosphate (0,02M) ±

acétonitrile (80/20 ; v/v) à pH = 3 ; colonne Xterra RP-18(250 mm x 4,6mm ; 5µm) .......... 53

: tampon phosphate (0,02M) ±

acétonitrile (80/20 ; v/v) à pH = 3 ; colonne Xterra RP-18(250mm x 4,6mm ; 5µm) ........... 54

phosphate (0,02M) ±acétonitrile (80/20 ; v/v) à pH = 3 ; colonne Xterra RP-18 ................. 55

; phase mobile :

tampon phosphate (0,02M) ±acétonitrile (80/20 ; v/v) à pH = 3 ; colonne Xterra RP-18 .... 57

: Chromatogramme de la solution de dégradation de la Loméfloxacine (20ppm) avec une dose de 5kGy, enregistré dans les conditions opératoires suivantes ; phase mobile :

tampon phosphate (0,02M) ±acétonitrile (80/20 ; v/v) à pH = 3 ; colonne Xterra RP-18 .... 57

avec une dose de 5kGy, enregistré dans les conditions opératoires suivantes ; phase mobile :

tampon phosphate (0,02M) ±acétonitrile (80/20 ; v/v) à pH = 3 ; colonne Xterra RP-18 .... 57

les conditions opératoires suivantes ; phase mobile :

tampon phosphate (0,02M) ±acétonitrile (80/20 ; v/v) à pH = 3 ; colonne Xterra RP-18 .... 58

avec une dose de 5kGy, enregistré dans les conditions opératoires suivantes ; phase mobile :

tampon phosphate (0,02M) ±acétonitrile (80/20 ; v/v) à pH = 3 ; colonne Xterra RP-18 .... 58

fluoroquinolones (20ppm) avec une dose de 5kGy, enregistré dans les conditions opératoires ; phase mobile : tampon phosphate (0,02M) ±acétonitrile (80/20 ; v/v) à pH = 3 ;

colonne Xterra RP-18 ............................................................................................................ 59

; phase mobile : tampon

phosphate (0,02M) ±acétonitrile (80/20 ; v/v) à pH = 3 ; colonne Xterra RP-18 ................. 60

e avec une dose de 25 kGy, enregistré dans les conditions opératoires suivantes ; phase mobile : tampon

phosphate (0,02M) ±acétonitrile (80/20 ; v/v) à pH = 3 ; colonne Xterra RP-18 ................. 60

37: Chromatogramme de la solution de dégradation de Enrofloxacine avec une dose

de 25 kGy, enregistré dans les conditions opératoires suivantes ; phase mobile : tampon

phosphate (0,02M) ±acétonitrile (80/20 ; v/v) à pH = 3 ; colonne Xterra RP-18 ................. 60

: Chromatogramme de la solution de dégradation de Loméfloxacine avec une dose de 25 kGy, enregistré dans les conditions opératoires suivantes ; phase mobile : tampon

phosphate (0,02M) ±acétonitrile (80/20 ; v/v) à pH = 3 ; colonne Xterra RP-18 ................. 61

de 25 kGy, enregistré dans les conditions opératoires suivantes ; phase mobile : tampon

phosphate (0,02M) ±acétonitrile (80/20 ; v/v) à pH = 3 ; colonne Xterra RP-18 ................. 61

Liste des tableaux

: Propriétés physico-chimiques de la Lévofloxacine ................................................. 7

: Propriétés physico-chimiques de la Loméfloxacine ................................................. 9

: Propriétés physico-chimiques de la Ciprofloxacine .............................................. 10

Préparation des solutions standards ........................................................................ 30

-chimiques des colonnes utilisées ............................. 32

sur les deux colonnes HPLC .................................................................................................... 34

.. 40 : Les temps de rétention (t ....................................... 56

Introduction générale

1

Introduction générale

Les médicaments sont des substances chimiques ou naturelles, utilisés pour le traitement ou la prévention des maladies. Chaque médicament renferme des principes actifs fluoroquinolones, sujet de cette étude sont des médicaments appartenant au groupe des antibiotiques et ils sont prescrits généralement pour le traitement des infections urinaires. Pour étudier la dégradation de ces principes actifs, on choisit comme technique

analytique la chromatographie liquide à haute performance à polarité de phase inversée

solutions de dégradation de ces principes actifs après leur irradiation par le rayonnement gamma. Le premier chapitre est consacré à la présentation des fluoroquinolones et leurs propriétés physico-chimiques. Dans le second chapitre, on présente la technique de chromatographie liquide à haute performance et des paramètres de séparation. Dans le troisième chapitre, une méthode analytique permettant la séparation et Enfin concernant le dernier chapitre, la méthode ainsi optimisée sera appliquée pour analyser les solutions de dégradation des fluoroquinolones après exposition aux rayonnements gamma.

Chapitre I

Présentation des fluoroquinolones et de

leurs propriétés physico-chimiques Chapitre I : Présentation des fluoroquinolones et leurs propriétés physico-chimiques 3

I. Les antibiotiques en médecine humaine

Ils Ils ont pour objectifs la maîtrise des maladies et la prévention de la transmission des agents pathogènes aux autres; citons comme exemple les sulfamides, les fluoroquinolones[1].

1. Présentation générale des fluoroquinolones

Les quinolones qui comportent un atome de fluor sont appelées les fluoroquinolones antibiotiques qui forment une large classe d'antibactérien et sont obtenus par synthèse chimique à partir de la chloroquine. Le premier composé de ce groupe est l'acide nalidixique

qui a été décrit pour la première fois en 1962. Cependant, les premières quinolones

développées ont eu une application clinique limitée et sont utilisées pour traiter les infections

urinaires seulement [2] dans les tissus. Ils permettent donc de traiter de nombreuses infections génitales, urinaires,

gastro-intestinales et osto-articulaires. Les fluoroquinolones sont des antibiotiques à large

spectre bactérien et devenues très utilisées en médecine humaine et vétérinaire par rapport aux

autres antibiotiques 3 Chapitre I : Présentation des fluoroquinolones et leurs propriétés physico-chimiques 4

2. Structure chimique des fluoroquinolones

chimique des fluoroquinolones comporte une fonction cétone (C=O) et une fonction acide (COOH), qui ont une grande tendance à piéger les ions divalents comme les ions Ca FeMg" Les fluoroquinolones sont des molécules obtenues par synthèse chimique qui dérivent un carboxylate en position 3, un carbonyle en position 4 et un atome de fluor en position 6. groupe R est généralement un groupe pipérazine dérivant de la quinoléine [3.

3. Mode d'action des fluoroquinolones

bactérien. Elles bloquent la synthèse de l'ADN topo-isomérase II et IV [3] Lorsqu'elles sont diffusées dans le cytoplasme, les fluoroquinolones vont inhiber de

manière sélective la réplication de l'ADN bactérien. Les fluoroquinolones ciblent deux

enzymes parentes appartenant à la famille des topo-isomérases II et qui sont impliquées dans

chez les bactéries à Gram négatif. La topo-isomérase IV est une cible principale chez les

bactéries à Gram positif. Les nouvelles fluoroquinolones sont la Gatifloxacine et la

Moxifloxacine

Chapitre I : Présentation des fluoroquinolones et leurs propriétés physico-chimiques 5 des fluoroquinolones administrées par voie orale ou administrées par voie intraveineuse peut fournir des avantages significatifs en termes de réduction de

l'hospitalisation ou des frais de soins à domicile. L'utilisation de ces antibiotiques est très

efficace et très recommandée.

4. Les propriétés pharmacologiques des fluoroquinolones

ble,

Marbofloxacine. Elles pénètrent bien dans les tissus et leur volume de distribution est

par les voies rénales. Pour la plupart de ces substances, le métabolisme compte moins de 20%

5. Les effets indésirables

fluoroquinolones sont bien tolérées, mais leurs effets secondaires ne traitement et de la qualité du médicament administré. Ces effets secondaires nécessitent rarement un arrêt du traitement. La plupart de ces effets sont des troubles osto-articulaires, cutanés, digestifs et neurologiques, toutefois leur incidence peut varier suivant les composés [4.

II. Classification des quinolones

fluoroquinolones prend en compte le spectre antimicrobien et

leurs indications cliniques. Cette classification est un outil pour les médecins à utiliser lors de

la prescription de ces médicaments ou l'évaluation de nouveaux principes actifs introduits dans le marché. Un médicament de chaque groupe est similaire à une activité antimicrobienne. Avec chaque génération successive, un nouveau groupe important d'agents

pathogènes est ajouté à la couverture. Les quinolones sont habituellement classées en quatre

Chapitre I : Présentation des fluoroquinolones et leurs propriétés physico-chimiques 6

1. La première génération

n ont un spectre étroit et limité contre les bactéries et aussi contre les germes de type Gram négatif.

2. La deuxième génération

es fluoroquinolones de la deuxième génération sont les: Ciprofloxacine, Norfloxacine, Enoxacine, Loméfloxacine, Ofloxacine et Péfloxacine.

3. La troisième génération

génération contient les composés suivants : La Grépafloxacine, la

Sparfloxacine, la Témafloxacine et la Lévofloxacine. Les agents de cette génération ont une

activité accrue contre les bactéries et contre les pathogènes atypiques.

4. La quatrième génération

a les mêmes propriétés que les agents de la troisième génération mais avec une

couverture anaérobique beaucoup large. Les substances de la quatrième génération sont: la

Trovafloxacine, la Moxifloxacine, la Gémifloxacne, la Sitafloxacine, la Clinafloxacine et la

Gatifloxacine.

III. Présentation des principes actifs utilisés se lancer dans la manipulation proprement dite, il est nécessaire de connaitre

des informations sur le mélange à analyser (nature et mode de préparation) et aussi les

propriétés physiques et chimiques des composés à séparer (polarité, solubilité et pH). Les

Ciprofloxacine, la Lomefloxacine et la Moxifloxacine. Ces produits sont généralement Chapitre I : Présentation des fluoroquinolones et leurs propriétés physico-chimiques 7

1. Les caractéristiques physico-chimiques de Lévofloxacine

Lévofloxacine est un antibiotique de la famille des fluoroquinolones, commercialisé en Europe par le laboratoire Sanofi-Aventis sous le nom Tavanic®. Lévofloxacine est

aussi un bactéricide très efficace sur les bactéries gram-positives et gram-négatives.

action est d'empêcher la réplication bactérienne en bloquant les enzymes ADN gy-

rases nécessaires à l'ouverture de la double hélice d'ADN bactérienne, utilisé généralement

pour le traitement des infections pulmonaires. Ce composé est stéréo-chimiquement stable -chimiques sont regroupés dans le tableau 1 [6. Figure 3 : -développée de la Lévofloxacine

Tableau 1: -chimiques de la Lévofloxacine

1-yl)-1,4-dihydroquinoleine-3-carboxylique monohydraté

Formule brute C18H20FN3O4

Masse molaire

(g/mol)

361,36

Point de fusion (°C)

255-257

pka 6,1 - 8,7

Description

Poudre de coloration jaune claire

Médicament TAVINIC

Chapitre I : Présentation des fluoroquinolones et leurs propriétés physico-chimiques 8

2. Les caractéristiques physico-

noxacine est commercialisée en France sous le nom d'Enoxor ; ce principe actif est physico-chimiques sont regroupées dans le tableau 2 [7]

161833

3. Les caractéristiques physico-chimiques de Loméfloxacine

oméfloxacine est un antibiotique de synthèse fortement bactéricide de la famille des fluoroquinolones. Elle est active sur un grand nombre de germe de type gram positifs et gram

négatifs. La Loméfloxacine est administrée seulement par voie orale. Ces propriétés physico-

chimiques sont regroupées dans le tableau 3 [8] Chapitre I : Présentation des fluoroquinolones et leurs propriétés physico-chimiques 9

Figure 5 -développée de la Loméfloxacine

Tableau 3: ropriétés physico-chimiques de la Loméfloxacine

4.Les caractéristiques physico-chimiques de laCiprofloxacine

La Ciprofloxacine est un antibiotique de synthèse créé et commercialisé par le laboratoire Bayer sous le nom de Ciflox®. Elle appartient à la famille de la deuxième

génération des fluoroquinolones. Elle neutralise la réplication des enzymes bactériennes et

empêche toutes les multiplications cellulaires. Elle agit sur les ADN gy-rases et

particulièrement sur la topo-isomérase IV. Ces propriétés physico-chimiques sont regroupées

dans le tableau 4 [9 Chapitre I : Présentation des fluoroquinolones et leurs propriétés physico-chimiques 10

Figure 6: -développée de la Ciprofloxacine

Tableau 4 : -chimiques de la Ciprofloxacine

5.Les caractéristiques physico-

Chapitre I : Présentation des fluoroquinolones et leurs propriétés physico-chimiques 11 II. Les principaux travaux antérieurs effectués sur les fluoroquinolones centre La plupart des analyses des fluoroquinolones sont effectuées par la chaine HPLC à polarité de phase inversée en utilisant une colonne de type Zorbax Bonus RP-14

(5µm, 125mm×4mm). La détection de ces fluoroquinolones a été réalisée à la fois par un

détecteur à barrette de diode '$'DYHF 277 nm) et par un spectrométre de masse. Les Chapitre I : Présentation des fluoroquinolones et leurs propriétés physico-chimiques 12 Par ailleurs, le dosage de 15 fluoroquinolones, se trouvant dans une matrice urinaire humaine a été effectué par HPLC, en utilisant une colonne de type C18- RP et une phase

(20%) avec un débit de 1,5 mL/min. La détection des fluoroquinolones a été effectuée par un

et 0,8 ppm respectivement. La méthode a été validée et appliquée avec succès pour analyser

les médicaments à usage humain et vétérinaire [11. La Lévofloxacine et la Moxifloxacine ont été déterminées dans le plasma et dans le liquide amniotique par la chromatographie liquide à haute performance ( HPLC) en phase

inversée. Cette étude a été décrite dans la littérature, en utilisant une colonne Cune phase

La détermination des traces de résidus des antibiotiques de la famille des eaux de surface du fleuve Mondego a été effectuée par la chromatographie liquide à haute performance. On utilise une colonne de type Chromolith RP-C de dimension (100 mm x 6,4 mm) avec une détection par fluorescence aux longueurs d'onde d'excitation et d'émission de

278 et 450 nm respectivement 13.

Chapitre II

La PHŃOQLTXH G·MQMO\VH XPLOLVpH : la

chromatographie liquide à haute performance HPLC Chapitre II : : La chromatographie liquide à haute performance HPLC 14

I. La chromatographie

1. Historique

méthode est introduite en pratique dans les laboratoires par Kuhn et Elederer à Heidelberg en Allemagne. En quelques années, la chromatographie en phase liquide sur colonne devient une technique rendant possible de nombreuses découvertes concernant différentes disciplines. En 1938, Reichstein introduit la chromatographie liquide pour séparer des substances incolores. Avant les années 1970, un petit nombre de méthode chromatographique est utilisé dans les composées chimiques complexes [14].

2. Définition de la chromatographie

chromatographie est un ensemble de procédés applicables à des mélanges

moléculaires ou ioniques, basés sur des différences de distribution des solutés entre une phase

stationnaire et une phase mobile continue: les deux phases étant mises en contact intime et à contre courant. ¾ Les différentes méthodes chromatographiques Les différentes méthodes chromatographiques sont :

9 hromatographie en phase gazeuse CPG

9 hromatographie sur couche mince CCM

9 hromatographie en phase liquide CPL

9 hromatographie liquide à haute performance HPLC

9 hromatographie en phase supercritique CPS

Chapitre II : : La chromatographie liquide à haute performance HPLC 15 II. La chromatographie liquide à haute performance (HPLC)

1. Principe de la HPLC

dans la phase mobile liquide (éluant). Grâce à la répartition sélective des solutés entre la

phase mobile et la phase stationnaire, chaque soluté est donc soumis à une force de rétention

exercée par la phase stationnaire, et une force de mobilité due à la phase mobile. Suivant la

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