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LaQuantificationRelativeLa

Quantification

Relative

LightCycler

Roche Applied Science

1

LightCyclerRocheApplied Science

Real

Time,fluorescence

r based Real Time, fluorescence based quantitativePCR:asnapshotof currentproceduresandpreferences •93laboratoires 21
p a y sd'Euro p e

Australie

CanadaetÉtatsͲUnis

/pyp,,

Roche Applied Science

2

Analysed'expressiongénique

i

ButsetPr

Ͳrequ

i s

éidd/difféèéi

p r i o d e d etempset ouentre diffé rentssyst mesexp r i mentaux.

PréͲrequis:

Mesuresprécisesetreproductibles

Mesures

précises et reproductibles

Démarcheanalytiquerigoureuse

Roche Applied Science

3

QuantificationRelativeQuantification

Relative

Qtitéd'ARNdéfédl'é h till

fé Q uan tité d'ARN d er

éfé

rence d ans l'é c h an till on

Leratiorelati

f estunevaleurnormalis equicorrigepourla

Roche Applied Science

4

Paramètresetimpacts

Échantillon

DNA/RNA cDNA* Produit

Purification

desANPréparationdes

échantillonsReverse

transcription*Amplification Detection

Méthodede

Preparation

Stabilitéet

Méthode

d'extraction

Pureté

Variabilité

Efficacité

RT

EnzymeEfficacité

PCR

EnzymeMéthodede

détection

Linéaritéde

l'essai

Stabilité

et conservation desAN

Variabilité

Conservation

l'essai

Roche Applied Science

5 *RTapplications

RealTimePCRReal

Time PCR

Échantillon

SOURCESDEVARIABILITÉ:

Échantillonage

Échantillonage

Conservationduspécimen

Roche Applied Science

6

IsolationdesAcidesnucléiques

Méthode/Variabilité(rendement):

ͲMéthodessurcolonnes(HighPure)

Méthodes

basées sur particules magnétiques (Dynal) rMéthodesautomatisées (MagNAPureCompactetMagNAPureLC)

Roche Applied Science

7

Présenced'inhibiteurs

ADNcdil1:20

estla conditionquidld onne l es meilleurs résultats!!!

Roche Applied Science

8

Paramètresetimpacts

Échantillon

DNA/RNAcDNA*Produit

Purification

desANPréparationdes

échantillonsTranscription

Inverse*Amplification Detection

Méthodede

Preparation

Stabilitéet

Méthode

d'extraction

Pureté

Variabilité

Efficacité

RT

EnzymeEfficacité

PCR

EnzymeMéthodede

détection

Linéaritéde

l'essai

Stabilité

et conservation desAN

Variabilité

Conservation

l'essai

Roche Applied Science

9 *RTapplications

RealͲTimeqPCRRTiiR

everse T ranscr i pt i on

Reverse Transcription

•Choosetherightenzyme hhfhhh •For h ig h er%GC,per f ormt h eRTreactionat h ig h temperature •RTBuffer

ChoosetheRTkitandthePCRkitaccordingly

Choose

the RT kit and the PCR kit accordingly

Roche Applied Science

10

Impactduchoixd'amorçage

REF:Stahlbergetal.,

ClinicalChemistr

y 50
509
2004

Roche Applied Science

11 y,, •TravaillerauminimumenduplicataencommencantparlaréactiondeRTRoche Applied Science 12

TranscriptionInverse...

T RT PCRO RT PCR?

TwoͲstepRTͲPCR

Pl iétiPCRiblilétiRT

T woͲstep RT r PCR ou O neͲstep RT r PCR Pl us i eursr ac ti ons PCR poss ibl esv i auneseu l er ac ti on RT

Travailàpartirunpoold'ADNccommun

ConservationdesADNcàlongterme

Conservation

des ADNc long terme

OneͲstepRTͲPCR

contamination

Rapide

Roche Applied Science

13

Rapide

Amorçagespécifique

ChoosingReferenceGenes

ffk De f initiono f House k eepingGenes cellularfunction

Assumptions:

- normalvs.tumortissueortreatedvs.untreatedcells

Endogenouscontrolforquantitativeassays

Roche Applied Science

14

Sélectiond

ungènedomestiqueapproprié

Sélection

dun gène domestique approprié entroiscritères...

Normalversustumeur

Nonstimuléversusstimulé

Détectionspécifiquedel

ARN

Détection

spécifique de lARN

Pasdepseudogène!

Roche Applied Science

15

Gènesdomestiques

l Exemp l es Gene

GenomicStructure/PseudogenesRegulationeg

ßͲactin multigenefamily;>20genes;1activelocus:hormonesoftyroidgland

20pseudogenes:stomachtumor

gͲactin multigenefamily;pseudogenes GAPDH multigenefamily;10Ͳ30genes;>200inmouse:lung,pancreatic,coloncancer mostlypseudogenes :insulinEGF Gene

Genomic

Structure/Pseudogenes

Regulation

e g mostly pseudogenes insulin EGF

5.8S,18S,28SRNA pseudogenes

ß2Ͳmicroglobulin nopseudogenes:NonͲHodgkinlymhoma abnormalexpressionintumors

G6PDH nopseudogenes:kidney,stomachtumor

:hormones,oxidantstress, growthfactors

PBGD nopseudogenes

aldolase pseudogenes

HPRT pseudogenes

U3,U8,... Pseudogenes

ornithine :tumors decarboxylase

LC15/02 SelectionofHousekeepingGenes

Roche Applied Science

16

Sélectiond'ungènedomestique

partir de quantités

égales

de matériel extrait

PréͲtraitement(temps0)

PostͲtraitement

RTͲPCR(préalablementoptimisé!)

AnalysedesCp

Analyse

des Cp chaqueéchantillon.

Roche Applied Science

17

SelectionofaHousekee

p in g Gene pg

Analysis

with the different tissues or cell lines

Setupreplicatesofeachsample(n

5) Set up replicates of each sample (n 5)

Foreachtissue:

PreͲtreatment(time=0)

PostͲtreatment

RTͲPCR(ensureitisoptimized)

Anal y sisofC p yp AgoodreferencegeneshouldhaveasimilarCpforeachsample.Eiith ftt

Roche Applied Science

18 E xpress i on i s th ere f orecons t an t

SelectionofaHKGene:withanUnknown

StartingTemplateAmount

o

Monitortarget/referenceratio.

Mustfindatleast2housekeeping

genesthatgivethesameratio ativeRatio genes that give the same ratio variationamongdifferentsamples Rel

IFNͲgamma/HPRT

IFN gamma/ß2M IFN gamma/ß2M

IFNͲgamma/PBGD

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