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© John Libbey Eurotext, 2014Journal Identification = ABC Article Identification = 0955 Date: May 17, 2014 Time: 11:5am

doi:10.1684/abc.2014.0955 265

Pour citer cet article : Dooms M, Chango A, Abdel-Nour A. La PCR quantitative (qPCR) et le guide de bonnes pratiques MIQE : adaptation et pertinence dansle contexte

de la biologie clinique.Ann Biol Clin2014 ; 72(3) : 265-9 doi:10.1684/abc.2014.0955

Synthèse

Ann Biol Clin 2014 ; 72 (3) : 265-9

La PCR quantitative (qPCR) et le guide de bonnes

pratiques MIQE : adaptation et pertinence dans le contexte de la biologie clinique Quantitative PCR (qPCR) and the Guide to good practices MIQE: adapting and relevance in the clinical biology context

Maxime Dooms

1

Abalo Chango

1

AÞf Abdel-Nour

2 1

DŽpartement SNES, Institut

Polytechnique LaSalle Beauvais, UnitŽ

de recherche EGEAL UP-2012.10.101,

France

2

Special Infectious disease unit, King

Fahd Medical Research Center, King

Abdulaziz University, Jeddah, Kingdom

of Saudi Arabia

Article recüu le 18 octobre 2013,

accept"e le 03 fŽvrier 2014 cesse croissante dans lÕobtention des rŽsultats dՎtudes et de diagnostics. Avec une telle utilisation, la question de la ÞabilitŽ et de la pertinence des rŽsultats et informations produits est posŽe. Cette revue offre une rŽponse documentŽe ˆ cette question : le guide de bonnes pratiques MIQE :minimum information cessus dÕextraction et de lÕanalyse de lÕinformation biologique y est traitŽe, avec pour chaque Žtape une rŽponse simple. Les contraintes techniques de la recherche ont ŽtŽ intŽgrŽes aÞn de permettre une application plus rŽaliste de lÕapplication du guide. Mots clés :bonne pratique, guide, MIQE, PCR, PCR quantitative Abstract.The qPCR has been introduced in clinical and biomedical research for over 10 years from now. Its use in trials and diagnostics is continuously increasing. Due to this heavy use, the question of relyability and relevance of qPCR results has to be asked. This review proposes a documented and evidence based answer to this question, thanks to the MIQE (minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments) guideline. The whole Simple answers are given, taking into account the technical constraints from clinical research in order to allow a realistic application of this guideline. Key words:best practice, guideline, MIQE, PCR, quantitative PCR La PCR quantitative (qPCR), dont l'ancienne appellation Ç PCR en temps rŽel È tend ˆ "tre abandonnŽe ˆ cause de la confusion induite par la terminologie anglaise RT-PCR un outil puissant pour lÕanalyse en biologie molŽculaire et ou ARNm principalement) pour caractŽriser lÕactivitŽ dÕun protŽines dans divers Žchantillons [1]. Son utilisation dans le cadre de la recherche et plus particu- comme le montre lՎvolution des publications depuis 2002 (figure 1). Ceci s'explique en grande partie par la faci- litŽ quÕoffre cette technique pour produire des rŽsultats a sensibilitŽ de la technique qui permet la dŽtection de varia- tions mineures des sŽquences dÕacides nuclŽiques (ADN, cDNA, ARN), et Žgalement ˆ sa spŽciÞcitŽ qui permet de discriminer quantitativement des cibles molŽculaires [2]. Actuellement, la PCR digitale en gouttelettes (ddPCR) se dŽveloppe et se dŽmocratise, offrant un pouvoir dis- criminant et une sensibilitŽ accrus [3]. Du fait de ces caractŽristiques techniques toujours amŽliorŽes, des diffŽ- en Žvidence. La question de la pertinence biologique de ces la sensibilitŽ progresse (figure 1).Tirés à part :A. Chango

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Synthèse

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2002 2004 2006 2008 2010 2012 2014

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qPCRqPCR + clinical Figure 1.Nombre d'articles publiés par mots clés (qPCR, qPCR + clinique) et par annŽe (source : NCBI). tant de noter que le recours ˆ la qPCR permet souvent de un dŽsagrŽment aussi mineur que possible pour le sujet ou le patient. En effet, le volume requis peut "tre extr"mement faecespour l'étude du microbiote colique [4]. MalgrŽ la performance reconnue de cette technologie, lÕutilisation courante ne doit pas occulter la rŽalitŽ bio- logique ŽtudiŽe. SÕil est en vŽritŽ assez facile de gŽnŽrer des donnŽes en qPCR, la garantie de leur qualitŽ et leur adŽquation avec la rŽalitŽ biologique ŽtudiŽe est autrement parfois passer sous silence lÕabsence de contr™le plut™t que de mentionner quÕelle nÕa pas effectuŽ ledit contr™le. Ceci nuit ˆ la transparence et laisse la suspicion sÕimmiscer dans la littŽrature scientiÞque. RŽcemment, une mŽthodologie visant ˆ rŽduire les mani- pulations nŽcessaires ˆ une bonne pratique a ŽtŽ publiŽe [5]. Cette mŽthodologie recourt ˆ lÕestimation de certains de qualitŽ valorisable ˆ sa juste mesure.

Utilité du guide de bonnes pratiques

MIQE Garantir la qualité des données proposées par la qPCR sup- pose, dÕune part, que lÕanalyse soit rigoureuse et, dÕautre problŽmatique est liŽe ˆ lÕutilisation de la qPCR et nÕest pas spŽciÞque au contexte clinique. Aussi il semble trivial de se rŽfŽrer ˆ un guide de bonnes pratiques cohŽrent qui de surcroit existe [7] : le guide de bonnes pratiquesMini- mum information for publication of quantitative real-time publication dÕexpŽriences utilisant la PCR quantitative). Ce guide publiŽ en 2009 offre une liste dÕinformations, essentielles ou simplement souhaitables, ˆ porter ˆ la propose une tracüabilitŽ de la rŽalitŽ biologique. Chaque tats, mais aussi leur comprŽhension et leur adŽquation avec une ou plusieurs rŽfŽrences qui dŽmontrent la pertinence de chacun. Le guide est souvent synthŽtisŽ par un tableau recherche apporte un c™tŽ pratique indŽniable. Ce tableau a aussi ŽtŽ adaptŽ dans une application pour tablettes et smartphones, MIQE qPCR (en anglais, disponible gratuitement sur lÕapp store, Apple). Initialement publiŽ en anglais, ce tableau est maintenant disponible en francüais poster.pdf).

Présentation du guide

Le MIQE guide propose par essence une ligne de trans- parence et non une norme. Il est donc lŽgitime de pouvoir en discuter la pertinence et le cas Žchant dÕy apporter des amendements pour sÕadapter ˆ un contexte, clinique par exemple. Sur le point de lÕadaptabilitŽ et de la pertinence, il est important de mentionner que le guide ne subit pas dÕadaptations par dŽfaut de pertinence. Ë lÕinverse, il tire sa pertinence (au-delˆ des rŽfŽrences bibliographiques sur lesquelles il sÕappuie) de son adaptabilitŽ et de sa prise en tes expŽrimentaux. LÕessentiel dans ce guide est la volontŽ profonde dÕoffrir de la transparence, de la lisibilitŽ et de la socle dÕinformations contribuant ˆ ces objectifs. Cette liste se prŽsente en diffŽrentes sections ˆ dŽtailler.

Nomenclature

ne rev"t que peu dÕintŽr"t eu Žgard ˆ lÕabsence de cette faute en francüais (alors quÕil est frŽquent en anglais de lire Ç quantitation È au lieu de Ç quantiÞcation È). En revanche,

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PCR quantitative et guide MIQE

(cycle threshold, cycle seuil) par les termes " Gènes de rŽfŽrence È, et Ç Cq È (Cycle de quantiÞcation) rev"t un De m"me lÕappellation qPCR est ˆ favoriser au dŽtriment confusion entre le fait que la PCR soit quantitative (real tion, RT), parfois jusque dans les publications. EnÞn, lÕemploi de termes gŽnŽriques comme Ç sonde ˆ hydrolyse È en lieu et place de Ç sondes TaqMan TM

È per-

met de sÕaffranchir de lÕutilisation de marques ˆ mauvais escient. PrŽciser la technologie dÕune sonde ˆ ßuorescence apporte plus dÕinformation et moins de confusion quÕune marque utilisŽe comme un gŽnŽrique (surtout quand la marque effectivement utilisŽe nÕest pas celle qui a donnŽ son nom). Eu Žgard ˆ lÕimportance que rev"t le vocabu- laire dans la comprŽhension dÕun texte et ˆ lÕinformation quÕil vŽhicule, lÕensemble des items de cette catŽgorie sont essentiels. LÕensemble de ces termes courants revus par le guide sont rapportŽs dans la section Ç nomenclature È du guide MIQE [7].

Plan d"expérience

Dans une expérience - et à plus forte raison dans une étude clinique Ð le plan dÕexpŽrience est une clŽ de lecture quÕil convient de prŽciser convenablement pour garantir au lec- liste nÕest encore une fois pas limitative, mais il semble que fournir les effectifs des groupes (en dŽbut et Þn dÕessai le groupes expŽrimentaux est un minimum indispensable. Par de communiquer le rŽalisateur effectif (interne ou presta- bution effective des diffŽrents auteurs. Dans un contexte de la biologie clinique, il est Žvident que ces informations initiales gagneront ˆ "tre complŽtŽes par dÕautres infor- mations complŽmentaires : intervention ou observation, en

Echantillonnage

Le contexte linguistique et expérimental étant posé, il Žchantillons analysŽs. Ceci est primordial dans la mesure o leur manipulation peut induire leur altŽration et poten- tiellement briser la cha"ne de lÕinformation biologique obtenu en qPCR. Parmi les informations ˆ fournir on citera la nature de lՎchantillon, la procŽdure dՎchantillonnage ayant conduit ˆ lÕobtention des Žchantillons, leur Žventuel leurs conditions de stockage (durŽe, tempŽrature, si perti- nent conditions physico-chimiques). La majeure partie des informations de cette catŽgorie sont essentielles. Seul le volume ou la masse dՎchantillon utilisŽ est souhaitable et non essentiel.

Extraction des acides nucléiques

Dans l'hypothèse où l'information soit arrivée intacte à ce stade de lÕexpŽrience, il est crucial de ne pas la dŽgrader lors de son extraction et de lÕextraire pleinement aÞn de ne pas commettre si lÕon peut dire un mensonge par omis- Žtape. PrŽciser que Ç les ARNm ont ŽtŽ extraits conformŽ- ment aux instructions du fabricant È ou Ç en suivant les prŽconisations de Doomset al., 2013 » ne suffit pas. Une publication est faite pour communiquer de lÕinformation scientiÞque, pas pour faire un jeu de piste. Un protocole dÕextraction est parfois complexe, offre plusieurs possibili- lÕarticle contienne elle-m"me un renvoi, voire quÕin fine l'information ne soit pas suffisante. Pour peu que le lec- teur ne soit pas abonnŽ ˆ la bonne revue ou que sa patience montre rapidement ses limites, lÕinformation sÕarr"te aux portes du processus de diffusion. Aussi, il est essentiel de centraliser les informations dans un rapport ou un tableau liŽ ˆ votre publication. Concer- nant les informations pour lÕextraction dÕacides nuclŽiques Þgurent celles du kit utilisŽ et/ou lÕinstrumentation asso- ciŽe ˆ lÕextraction, les Žventuelles modiÞcations apportŽes (en dŽtails, pas seulement Ç kit X modiގ È qui nÕapporte aucune prŽcision si ce nÕest que lÕinformation est perdue), lÕorigine des rŽactifs supplŽmentaires le cas ŽchŽant, les traitements de type DNAses ou RNAses, la vŽriÞcation dÕabsence de contamination (ADN ou ARN), la qualitŽ de lÕacide extrait (intŽgritŽ, puretŽ), la vŽriÞcation dÕabsence dÕinhibiteurs (par des sŽries de dilutions par exemple).

Rétrotranscription

est dans lÕimmense majoritŽ des cas nŽcessaire dÕeffectuer une rŽtrotranscription (que lÕon notera sans vergogne Ç RT È puisquÕayant mentionnŽ la PCR quantitative avec lÕappellation qPCR et non RT-PCR). Lˆ encore, la tracüabilitŽ de lÕinformation biologique est essentielle. Elle est de surcro"t assez facile ˆ assurer. Il sufÞt de mention- ner la quantitŽ dÕARN utilisŽe pour la rŽtrotranscription, lÕenzyme et sa concentration (ou simplement le kit utilisŽ), le type dÕamorces utilisŽes (oligo dT, amorces alŽatoires), les conditions (temps, tempŽratures, volume rŽactionnel). Bien que ce ne soit pas essentiel, la communication des Cq

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Synthèse

avant et après RT et les conditions de stockage des ADNc est souhaitŽe.

Cible de qPCR

Arrivé à ce stade, pour peu que les informations men- tionnŽes ci-dessus aient ŽtŽ communiquŽes, le lecteur est en mesure dÕapprŽcier la conservation de lÕinformation. Reste ˆ lire cette information. Lˆ encore la transparence est de mise. LÕidŽal est bien entendu la prŽsence de des variants dՎpissage le cas ŽchŽant et la situation de la sŽquence cible (en particulier lÕemplacement vis-ˆ-vis des sŽquences introniques ou exoniques). La longueur et les structures secondaires pouvant inßuencer lÕefÞcacitŽ de lÕampliÞcation, ces informations sont Žgalement ˆ commu- niquer. Au-delˆ des aspects techniques liŽs ˆ la cible ˆ ampliÞer, il est important de sÕassurer quÕelle est bien spŽciÞque, quÕelle ne comporte pas dans le gŽnome ou le transcrip- mauvais ciblage produirait en effet un rŽsultat parfaite- ment lisible, mais sans lien sufÞsamment Žtroit avec le biologique.

Oligonucléotides

Ce sont eux qui vont permettre de lire l'information. Ils De la m"me facüon quÕil est essentiel dÕavoir une pharmacie efÞcace pour mettre en branle les traitements proposŽs par la mŽdecine, il est important de sÕassurer de la qualitŽ et de la pertinence des oligonuclŽotides pour une cible donnŽe. quent est la publication des sŽquences utilisŽes. Lors de lÕutilisation de kits commerciaux les rŽfŽrences de ces derniers doivent "tre fournies, en Žvitant dans la mesure du possible les boites noires qui proposent des essais pr"ts ˆ lÕemploi sans prŽcisions sur les sŽquences ou au moins leur contexte. Lors de lÕutilisation dÕamorces ou de sondes modiގes, il est crucial de communiquer prŽcisŽ- ment les modiÞcations effectuŽes. EnÞn, dans un but de lisibilitŽ de lÕexpŽrience et de reproductibilitŽ, les informa- tions sur le fournisseur et la mŽthode de puriÞcation des amorces/sondes doivent "tre transmises.

Protocole de qPCR

Pour filer la métaphore médico-pharmaceutique, nous sup- posons ici "tre en prŽsence dÕun bon diagnostic (contexte expŽrimental), dÕune bonne prescription (cible de qPCR) et dÕun traitement adaptŽ (oligonuclŽotides). Reste ˆ prŽci- ser le mode dÕadministration du traitement, ici le protocole de qPCR. Tous les ŽlŽments Žtant rŽunis, reste ˆ les faire rŽagir de facüon adŽquate. Les ŽlŽments essentiels sont la nature et la concentration de lÕenzyme utilisŽe, la quantitŽ dÕADN ou ADNc utilisŽe pour chaque rŽaction, la compo- sition du milieu rŽactionnel (tampon, concentration en Mg, rŽaction (machine utilisŽe, volume et programme de ther- mocyclage). Par ailleurs, en ce qui concerne la qualitŽ des plastiques pouvant inßuencer la rŽaction, il est bon de la prŽciser. EnÞn, dans un contexte clinique o la quantitŽ dՎchantillons ˆ manipuler est souvent importante, le fait est important. On peut en effet concevoir que lÕassistance dÕun automate permette de rŽduire les erreurs de pipetage et ainsi dÕaugmenter la rŽpŽtabilitŽ des rŽsultats. Cet effet croit avec la taille de la population analysŽe.

Validation de la qPCR

À ce stade, l'information brute est livrée. Il est tentant de passer directement ˆ lÕanalyse pour obtenir au plus t™t ce que lÕon pense "tre un rŽsultat. NŽanmoins, quelle serait la valeur dÕun rŽsultat issu de donnŽes brutes non validŽes ?

Nulle.

En complŽment Ð et non en remplacement ! Ð des infor- mations mentionnŽes ci-avant, des vŽriÞcations simples permettent de valider les donnŽes brutes. La qPCR est- elle bien spŽciÞque (vŽriÞable avec une courbe de fusion lÕutilisation de SYBR Green est-elle liŽe ˆ la crŽation dÕun produit de PCR (quelles sont les valeurs de Cq pour les Žchantillons tŽmoins) ? La qPCR est-elle efÞcace et Þable tout au long de la gamme de valeurs observŽes (quelles sont pour chaque essai les variations au long de la gammequotesdbs_dbs28.pdfusesText_34