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Dénombrement en milieu liquide : méthode du NPP - Grouper en nombre de 3 chiffres la suite des chiffres obtenue, en commençant par le chiffre obtenu

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et en milieu liquide 1 Principe des dilutions 1 1 Dilution décimale ou au dixième : 1/10 ou 10-1 1 1 1 Matériel • Un tube de diluant de 9 mL (eau distillée,  

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dénombrement des Escherichia coli présumés' par la technique indirecte par La technique de dénombrement en milieu liquide (méthode NPP) a été retenue 

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échantillons liquides avec les testeurs nomad Dénombrement des colonies la languette plus longtemps que nécessaire, sinon une perte de milieu à travers

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Le dénombrement certaines bactéries (coliformes fécaux)) renseigne sur la qualité *Mesure de la masse après culture sur milieu de culture liquide :

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Dénombrer les bactéries = donner le nombre de bactéries par unité de volume, très La méthode de dénombrement par NPP sur milieu de culture liquide est 

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de plus, offrant les avantages de la culture des bactéries en milieu liquide, tiale des organismes à dénombrer et du principe nême de Ia méthode de 

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est l'étape d'étalement sur le milieu de culture et la dernière correspond à à une collecte des particules aéroportées dans un liquide, le liquide de collecte Les résultats de dénombrement sont consignés pour exploitation ultérieure

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1 1 'tiNIV

ERSITf.

-D[ ,\ NANTES

Institut Universitaire de Technologie

de la Roche sur Yon

Département génie biologique

IFAEMEA

BIBL/OIHEQUE

LA IAEMBLAOE

Ifremer

Direction de l'Environnement

et de l'aménagement littoral

17390 LA TREMBLADE

VALIDATION INTERNE

DE

LA METHODE DE DENOMBREMENT

DES

ESCHERICH/A COL/PRESUMES

PAR IMPEDANCEMETRIE

)r' --------------------------------------------------------------, ) 1 1 ) 1 ) L-.

Promotion 2001-2002

Rapport de stage rédigé

par Géraldine KARSENTY

REMERCIEMENTS

PREAMBULE

INTRODUCTION

'0' 'AI

I!)I/ 1/

I) Présentation de l'Ifremer

El

Sommaire

3 4 5 7

1 ° Historique 7

2° Présentation de la station Ifremer de la Tremblade et du laboratoire DEL 8

3° Les partenaires principaux 9

4° Assurance qualité 10

II) Préparation des milieux de culture 12

III) Préparation des coquillages et de la solution mère 16

1 ° Choix de l'espèce de coquillage 16

2° La contamination des coquillages 16

3° Transport et réception des échantillons 17

4° Nettoyage des échantillons 18

5° Préparation de la solution mère 18

IV) Les techniques d'analyse

1 0 La technique indirecte par impédancemétrie directe al Pril/cipe bl

L 'al/alyseur microbiologique Malthus

cl EI/seme/lcemel/t dl Lecture des résultats 2 0

La technique du nombre le plus probable

al Pri/lcipe hl E/lsemel/ceme/lt cl lecture et repiquage 3 0 Les avantages et les inconvénients des deux techniques

V) Résultats et interprétations

1 0

Bilan des résultats pour les deux techniques

2 0

Etude statistique

CONCLUSION

LEXIQUE

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

TABLE DES ANNEXES

RECHERCHE DE GERMES DANS LES EAUX DE BALLASTS

2

Sommaire

20 20 20 22
23
25
26
26
26
27
29
30
30
30
32
33
35
36
63

Remerciements

Je tiens tout d'abord à remercier Monsieur Roger Kantin chef de laboratoire de la

Direction

de l'environnement et de l'aménagement littoral (DEL) de la Tremblade pour m'avoir ouvert les pOltes de son établissement et d'avoir pris en considération ma candidature. Je remercie également Monsieur Christian Auger, responsable assurance qualité et maître de stage pour avoir supervisé et dirigé mon séjour dans l'entreprise, ainsi que pour son aide

à la rédaction du rapport.

Je remercie Monsieur Olivier Courtois responsable technique de l'unité microbiologique, Messieurs Jean Côme

Piquet, Didier Roësberg, et Mlle Elodie Muraro

techniciens microbiologistes pour leurs conseils lors des manipulations et leur aide et disponibilité tout au long de ce stage. Que Monsieur Daniel Masson responsable statistique, soit aussi remercié pour son aide lors de l'interprétation des résultats. Je garderai longtemps un agréable souvenir de l'ensemble de l'équipe du laboratoire pour son accueil et sa bonne humeur. 3

Préambule

Le laboratoire Ifremer DEL (Direction de l'environnement et de l'aménagement du littoral) de la Tremblade accrédité COFRAC' a mis en place la technique de dénombrement des Escherichia coli présumés par impédancemétrie dans les coquillages marins, technique utilisée en routine. Cette technique doit permettre d'obtenir des résultats équivalents par rapport

à ceux

obtenus à partir de la méthode de référence: la méthode NPP' (nombre le plus probable). Des analyses ont été menées les deux années précédentes par d'autres stagiaires de l'IUT génie biologique afin de vérifier la corrélation entre les deux méthodes.

La norme

NFV 08-1 06 concernant la technique indirecte par impédancemétrie directe a

été éditée

en janvier 2002 :

Elle prévoit que le contrôle

de l'étalonnage nécessite le dénombrement d'Escherichia. coli dans vingt échantillons de coquillages naturellement contaminés. Ce contrôle, décrit dans la norme doit être conduit en parallèle avec la technique NPP (Norme NF V 08-600 parue en octobre 2000). (Voir la description de l'étalonnage en annexe 1) Il est a noter qu'actuellement, au laboratoire de la Tremblade, la méthode de dénombrement des Escherichia coli présumés' par la technique indirecte par impédancemétrie directe est étalonnée par la méthode

NPP décrite dans la circulaire

DGALlSDHNN98-8137 du 19 Avril 1998 (Méthode qui demandait d'employer le bouillon lactosé bilié au vert brillant (BLBVB) comme milieu sélectif).

La révision

de cette circulaire a donné lieu à l'élaboration d'une nouvelle norme concernant le dénombrement des Escherichia coli présumés dans les coquillages marins vivants par le méthode

NPP (Norme NFV 08-600).

Cette norme datée d'Octobre 2000 est donc le document de référence pour ce type de dénombrement.

Le travail

à conduire pendant mon stage consistera à vérifier si l'équivalence entre l'étalonnage de l'analyseur microbiologique Malthus et la nouvelle norme de référence NF

V 08-600 est maintenue.

Les mots suivis du signe * sont expliqués dans le lexique enfin de rapport 4

Introduction

La région de Marennes Oléron est réputée aussi bien pour ses plages que pour sa production de coquillages et en particulier d'huîtres.

Depuis longtemps,

il est connu que les coquillages comestibles peuvent être vecteurs de maladies pour l'homme. Ce phénomène est en relation avec la capacité de survie de microorganismes entériques* dans l'environnement marin littoral et

à leur concentration dans

les coquillages filtreurs. ---. En effet, les coquillages de part leurs pouvoirs de filtration, d'absorption et d'accumulation des microorganismes sont traditionnellement considérés comme des témoins de la qualité des eaux de production. Actuellement, la protection de la santé publique repose sur la surveillance de la qualité

bactériologique des eaux marines côtières à l'aide de coquillages, qui sont donc de véritables

indicateurs de pollution.

Aujourd'hui encore,

il est matériellement impossible de rechercher et de dénombrer en routine tous les microorganismes pathogènes d'origines entériques qui pourraient contaminer le milieu marin en raison de la durée, des coûts, et de la disponibilité des teclmiques analytiques. Pour ces raisons, la surveillance bactériologique est essentiellement basée sur le dénombrement de groupes indicateurs·. Dans cette étude nous utiliserons les coliformes*

thermotolérants, germes tests de la qualité sanitaire de la demée, qui permettent d'évaluer

le risque de présence de germes pathogènes'. La bactérie Escherichia coli a été retenue comme germe indicateur de contamination fécale dans les réglementations officielles nationales ou communautaires relatives au classement des zones conchylicoles et à la qualité microbiologique des demées alimentaires. Les Escherichia coli sont défini comme des "coliformes thermotolérants* qui produisent de l'indole à 44°C en 24 heures». Dans la mesure où l'identification des coliformes thermotolérants par la méthode NPP est basée sur la détection de l'indole*, et que Escherichia coli est quasiment le seul à pouvoir produire de l'indole à partir du tryptophane, les coliformes thermotolérants détectés sont nommés :" Escherichia coli présumés ». 5

Introduction

L'Ifremer, pour ses analyses de routine utilisait la technique manuelle du nombre le plus probable (NPP), mais cette technique présentait de nombreux inconvénients. Depuis une quinzaine d'années environ des essais de développement de techniques instrumentales sont déployés pour y remédier. Parmi ces techniques, la technique de dénombrement des Escherichia coli. utilisant l'impédancemetrie est aujourd'hui pratiquée en routine par le laboratoire microbiologique de la Tremblade pour la surveillance du littoral.

Dans une première partie

je présenterai l 'historique de l'Ifremer, puis la partie technique

comprenant: la préparation des milieux de culture, la préparation des échantillons et celle de

la solution mère. Par la suite j'étudierai les techniques d'analyses et enfin l'interprétation des résultats. 6 n Présentntion de l'lfremer

I) Présentation de l'Ifremer

1 0

Historique

L'Ifremer (Institut fj'ançais de recherche pour l'exploitation de la mer) est un

établissement public

à caractère industriel et commercial crée par le décret du 5 juin 1984. Il résulte de la fusion du Centre national d'exploitation pour les océans (CNEXO) et de

L'ISTPM (Institut scientifique et technique des pêches maritimes). Il est placé sous la tutelle

de ministères chargés de la recherche, des pêches et cultures marines, de l'équipement, du logement, des transports. L'lfremer est constitué de

78 laboratoires ou services de recherche

répartis dans 24 stations ou centres sur le littoral métropolitain et dans les

DOM-TOM.

L'institut scientifique et teclmique des pêches maritimes a été pendant 71 ans à la Tremblade au service du bassin de Marennes Oléron. Un historique sommaire peut être dressé:

1913: Création de l'AElO (Association d Encouragement des industries Ostréicoles et

conchylicoles française)

à la Tremblade.

1918: Création de l'OSTPM (Office Scientifique des Pêches Maritimes).

1928 :

Le laboratoire de l' AEIO de devient à la Tremblade l 'OSTPM.

1953 : Transformation de l 'OSTPM en ISTPM (Institut Scientifique et teclmique des

pêches maritimes).

1954: L'inspection sanitaire et le laboratoire de biologie sont individualisés à la

Tremblade.

1984 : Création de l'Ifremer.

Les Ifl'emer sont organisés en six directions différentes: + Direction de l 'EnvirorUlement et de l'Aménagement Littoral (DEL). + Direction des Ressources Vivantes (DRV). + Direction des Recherches Océanographiques (DRO). + Direction de la teclmologie Marine et des Systèmes d'Information (DTMSI). + Direction des Navires Océanographiques et de l'Intervention sous-marine (DNTS). + Direction des Moyens et Opérations Navales (DM ON). 7 n Présentation de l'ifremer

2° Présentation de la station Ifremer de la Tremblade

et du laboratoire DEL La station Ifremer de la Tremblade est implantée en Charente Maritime, dans le premier bassin conchylicole d'Europe, et son aire de compétence s'étend de la rive gauche de la

Charente à la rive droite de la Gironde.

La station est composée de 3 laboratoire

s: • Direction de l'environnement et de l'aménagement littoral (DEL) dont les missions principales consistent à mettre en oeuvre des réseaux de surveillance garantissant aux conchyliculteurs et aux consommateurs une qualité des eaux et des coquillages. • Direction des Ressources Vivantes/Laboratoire Conchylicole de Poitou-Charentes (DRV/LCPC) qui étudie, entre autres, la croissance des coquillages afin d'améliorer les productions du bassin de Marennes Oléron . • Direction des Ressources Vivantes/Génétique Aquaculture Pathologie (DRV/GAP)

qui travaille notamment sur les caractères génétiques des huîtres creuses et plates dans le but

d 'améliorer les populations présentes dans les bassins. Elle contrôle aussi les agents pathogènes.

Le laboratoire de la DEL contribue

à la corUlaissance des écosystèmes côtiers, au développement d'outils, de méthodes et de concepts utilisables par les acteurs de l'environnement. Il est a ussi le principal réseau d'observation et de surveillance de la qualité du littoral métropolitain, en mettant en oeuvre les réseaux de surveillance garantissant aux conchyliculteurs et aux consommateurs des informations fiables concernant la qualité des eaux et des coquillage s. 8

1) Présentation de l'lfremer

Parmi les réseaux opérés par le laboratoire, on distingue: + Le RNO (Réseau National d'Observation de la qualité du milieu marin) qui a pour objectifs d'évaluer, d'une part les niveaux et tendances des polluants, des paramètres généraux de la qualité du milieu et d'autre part, l'état de santé de la faune et de la flore. Le REPHY (Réseau de surveillance du phytoplancton et des Phycotoxines) qui surveille le phytoplancton toxique. Les résultats du

REPHY sont communiqués à

l'administration des Affaires Maritimes qui peut alors décider d'intelTOmpre la mise en marché des coquillages. + Le REMI ( Réseau de surveillance microbiologique) qui évalue le niveau de contamination des coquillages ( huîtres, moules, coques, ... Les concentrations en Escherichia coli présumés trouvées dans la Chair et le Liquide Intervalvaire (CLI) des coquillages constituent des indicateurs de pollutions fécales dans les eaux côtières. Les contaminations importantes peuvent indiquer une présence d'autres bactéries pathogènes pour l 'homme et des virus quand

à eux, sont difficilement détectables à

l 'heure actuelle.

3° Les principaux partenaires de l'Ifremer

Les principaux partenaires de l 'Ifremer sont ceux qui participent à la gestion du domaine public maritime, aux contrôles de la qualité du milieu marin,

à la surveillance des

rejets de polluants divers, à la protection de la santé publique et à la qualité des produits consommés. >-L'Administration des Affaires Maritimes

Elle gère notamment les problèmes liés

à l'exploitation des ressources vivantes,

notamment les cultures marines. >-Les Sections Régionales Conchylicoles (SRC) Elles regroupent des membres de syndicats professionnels locaux et régionaux et elles ont diverses missions. Elles doivent formuler des recommandations en vue d'une bonne gestion des intérêts conchylicoles locaux et d'une meilleure adaptation de la production aux besoins du marché. >-La Direction des Services Vétérinaires (DSV)

Elle regroupe trois grands départements:

-santé et protection animales, -hygiène alimentaire, -installations classées pour la protection de l'environnement. Au sein du département de l 'hygiène alimentaire, une section est uniquement consacrée

à l 'hygiène des produits de la mer.

9

1) Présentation de l'Ifremer

Les Directions Départementales des Affaires Sanitaires et Sociales (DDASS), servICe

Santé et Environnement.

Les missions des DDASS comprennent, entre autres, la protection sanitaire de l'environnement et le contrôle de l'application des règles d'hygiène. Ce service surveille la qualité bactériologique des eaux de baignade aussi que les gisements naturels de coques faisant l'objet d'une pêche de loisirs. Elles effectuent également les contrôles sanitaires du fonctionnement des stations d'épuration ainsi qu'une assistance teclmique : le SATESE (Service d'Assistance Technique aux Exploitants de Station d'Epuration) qui est aujourd'hui limité à la validation de l'autocontrôle qu'effectuent les exploitants de stations d'épuration depuis 1996. Les Directions Départementales de l'Equipement (DDE)

Les Services Maritimes

de Navigation (SMN) des DDE et leurs Cellules de Qualité des Eaux Littorales (CQEL) supervisent les autorisations de rejets à la mer et contrôlent la qualité des eaux jusqu'à la limite d'influence des eaux marines. Ils sont chargées de piloter l'élaboration du Schéma de Mise en Valeur de la

Mer: c'est un document constitué de cartes

et de textes visant à rassembler des informations utiles et à donner les principes directeurs de l'aménagement du littoral de la zone concernée (aménagement physique, urbain, économique, ). Contrairement à son prédécesseur, le Schéma d'Aptitude à l'Utilisation de la Mer (SAUM), ce document a une valeur réglementaire: il est donc opposable aux tiers.

4° Assurance qualité

Afin de garantir des résultats d'analyse fiables, la direction de la DEL a mis en place une cellule qualité et lancé un programme de mise sous assurance qualité de ses laboratoires côtiers. La mise sous assurance qualité d'un laboratoire ou d'une partie de ses activités consiste, dans le principe, à mettre en oeuvre les moyens matériels, documentaires (manuel qualité, plan qualité, procédures, enregistrements, ... ) et organisationnels permettant de prouver que les

analyses ont été réalisées suivant toutes les conditions imposées par les différents protocoles

et documents de prescription, du prélèvement jusqu'à la diffusion des résultats.

Etre sous assurance qualité impose donc

de pouvoir retrouver, même des années après, toutes les preuves tangibles du bon déroulement d'une analyse d'un échantillon donné (provenance des produits utilisés, conditions de fabrication des milieux de culture, enregistrements ... Dans le but de répondre à un objectif d'accréditation par le COFRAC des analyses microbiologiques liées au réseau REMI, un laboratoire de microbiologie répondant aux nmIDes de qualité a été construit en 1998 par le laboratoire côtier DEL de la Tremblade. Il a été conçu suivant le principe de la marche en avant qui impose qu'il n'y ait ni

croisements entre les différents échantillons et milieux de culture ensemencés, ni retours en

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