[PDF] Mesure de l’activité enzymatique

Mesure de l’activité enzymatique

Mesure de l’activité enzymatique •Si nous nous plaçons dans des conditions expérimentales où [S] 0 >> [E] et [S] 0 >> K •la vitesse mesurée est la vitesse maximum et elle est proportionnelle à la concentration totale d'enzyme •C'est donc une méthode qui peut être utilisée pour

UNIVERSITE AIX-MARSEILLE Licences Sciences et technologies

après une étape de purification et l’activité enzymatique totale avant l’étape de purification On calcule ces paramètres étape par étape On peut aussi les calculer globalement (chiffres entre parenthèse) Etapes Activité enzymatique totale (U) Quantité de protéine totale (mg) Activité spécifique (U/mg) Facteur de

Méthodes de mesure des activités enzymatiques

I Principe de la mesure d’une activité enzymatique L’activité enzymatique se mesure par la vitesse de la réaction de transformation du substrat S en produit P : S → P (fig 1) Il est possible d’estimer la vitesse de la réaction de deux manières : • soit en mesurant la vitesse de disparition du substrat –;

A Principes de base

Mesure de l’activité enzymatique-dans cette section, nous traiterons des aspects plus pratiques de la mesure de l’activité d’une enzyme A Principes de base-l’activité enzymatique est influencée à la fois par des propriétés spécifiques à l’enzyme (concentrations des substrats, activateurs, et inhibiteurs) et par des effets

ENZYMOLOGIE (2)

L’activité enzymatique dépend fortement du pH Pour la plupart des enzymes, on observe une zone plus ou moins étroite de pH, entre 6 et 8, où la vitesse de la réaction est maximale Cependant, certains enzymes requièrent pour leur fonctionnement des conditions beaucoup plus drastiques ; par exemple la pepsine

ENZYMOLOGIE - est-usmbaacma

Cinétique enzymatique Calcul de l’équation de Michaélis-Mention Enzyme totale ( enzyme libre + enzyme l’activité enzymatique

La Cinétique enzymatique À Un substrat

Détermination de l’activité enzymatique En cinétique: Do= ε C l C= Do 1/ε 1/l Activité enzymatique en UI/l= ΔDo/Δt 1/ε 1/l Vt/Ve 10 6 Δt:temps de mesure en min ε: coefficient d’absorption molaire l: trajet optique Vt: volume du mélange réactionnel total ou se fait la mesure

Enzymologie - Université de Tours

En réalité, il existe une relation structure activité : il faut que la bonne liaison soit placée au bon endroit • accès possible ⇒ pb de conformation • réaction possible ⇒ pb chimique (grandeur et nature des forces en jeu) ⇒ il est fréquent qu’une enzyme intervienne non sur une molécule unique, mais sur une classe de substrats

4 Effet de la concentration d’enzyme

diminuer l'activité enzymatique Les inhibiteurs enzymatiques interagissent généralement avec l’enzyme elle-même, formant ainsi un complexe enzyme-inhibiteur (E·I) Dans certains cas, le mécanisme d’inhibition implique une réaction avec le substrat L’inhibition enzymatique peut être:

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enzymatique

DR AKSAS

1

ƒIl

2

Cette mesure consiste à évaluer la

3

L'actiǀitĠ d'une enzyme se mesure

1.d'un

d'apparition d'un

3.d'utilisation d'un

4

Méthodes de mesure

2 Méthode en point final ou " à deux points »

Méthodes cinétiques:

1. 5 Si expérimentales[S]0 et[S]0 la d'enzyme C'est doser d'enzyme 6

Conditions opératoires

et maximale a)0et déterminer contient. b) optimale c) [S]( activateurs 7

Le substrat

Le Pour Pour Il doitMais Un de on exige que S > 10 Km. 8

Température

En , C

SFBC(société

C 9

La durée de la mesure

AE = Vi en [ ] saturante de substrat

10 10

Le Témoin

Dans les méthodes " 2 points »

On Ce que .

Dans les méthodes cinétiques

On 11

Les unités enzymatiques

katalquantité seconde trop-

Launité

internationalequi catalyse minute 60
12

Les unités enzymatiques

Nombre

AEM

Nombre

AS

Elle enzymatique

13

Les unités enzymatiques

ƒLe=

/ Activité enzymatique totale de départ (x

ƒ Le=

spécifique de départ 14 1 manuelle 1. durée, 2.son 3.

Į .15

Méthode en point final ou à " 2 points »

Ladoit

Le lorsque nécessaire

¾soit

¾soit

zone0en

¾soit.

16

Méthode en point final ou à " 2 points »

Faire Ce (Exemple transformer 17

Méthode en point final ou à " 2 points »

Exemple:

LetĮ-;

-30. -Dinitro 18 ALAT

Méthode en point final ou à " 2 points »

C solution 19 2

Consiste de

La spécifiqueUV visible

tempsplus 20

Cinétique enzymatique en Ultra

LeNAD/NADH NADP/NADPH

employé La

UV NAD+/NADHqui

sont Ces Cette 21

Méthodes cinétiques

Dans continu, fixée La réactif) stabilise Elle

Ppermet

22

Cinétique enzymatique en Ultra

NAD considérés(réaction

AH2 + NAD+ A + NADH,H

AH2 + NADP+ A + NADPH,H

[NAD+ ] > 10 NAD 23

Cinétique enzymatique en

NADH NAD+, Si réduction NAD+,la; oxydation deDO. Le

NADPHİ -cm- 24

Cinétique enzymatique en

NADH-cm-

NAD+ 25

AEMesure

de 340nm

AE diminution

de A340nm LDH NADн et NADH2 prĠsentent un pic d'absorbtion ( surtout NAD+) a 260 nm alors on mesure électivement Le NADH2 a 26

A 340 nm ( UV) Si on mesure :

27

Cinétique enzymatique en Ultra Violet

Condition cte

permet Dans tampon à

NADH,H .

Puispyruvate

On La droite 28

Lactate déshydrogénase

(EC 1.1.1.27)

Lactate = substrat

Pyruvate = produit

NAD+/NADH = cofacteur

29

Cinétique enzymatique en

OnDO/min

déclenchée, Les On

T E 3 UI.l-

VTet VE en3

30

Cinétique enzymatique en

DO = İ

DO1 İ 1 1=1 İ

DO2 İ 2 2=2 İ

2-1=DO2 İ DO1 İ

0 31

Cinétique enzymatique en

= x x 6

A 340 nm İNADH,H + = -. cm-.l.

AE en 32
VE VT

Réactions enzymatiques couplées

déshydrogénase à NAD+ ou NADP+ et que ni S et ni P ne possèdent de propriétés spectrales, alors on couple la première R à une deuxième, catalysée par une déshydrogénase dont P est le substrat. S P PH2 33
E1

NADH,H NAD+

Réactions enzymatiques couplées

La 1ere R principale

La 2eme R indicatrice

34

Réactions enzymatiques couplées

Exemple

Acɲ-

AOANADH,H Malate NAD+

35
ASAT

Réactions enzymatiques couplées

A correspond NADH,H . Dans 36

Réactions enzymatiques couplées

AE1 = AE2

Pour 1. pendant en 2. Dans pourV 37

Etude de trois R couplées

on couple la 1ere même couplée à une R indicatrice. S P X XH2 38

NADH,H

NAD+ E1 V2 V1 E2 V3 E3

R principale

R auxiliaire R indicatrice

Etude de trois R couplées

ExempleCK

R

CréatineATP

R

ATPglucose+

R

G+ NADPH,H+

On 39
CK hexokinase G6P

Déshydrogénase

Cinétique enzymatique colorimétrique

Exemple: Dosage des phosphatases alcalines (PAL)

p Le Le2;

Dosage

enregistrement = İ VT E 6UI-

İ 405 - -.

40
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