La Liquide Chromatographie couplée à la Spectrométrie de
a LC : Liquide Chromatographie, une technique de séparation de molécules au travers d’un support solide par un fluide liquide appelé, phase mobile b MS/MS : Spectromètre de Masse à triple quadupoles en tandem, un instrument produisant des ions et pouvant les séparer dans une phase gazeuse selon le rapport de la masse sur la charge (m/e) 3
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Introduction chromatographie 1900: Invention de la chromatographie (Michel TSWETT) 1938 : Première chromatographie sur couches minces (Ismailov et Schraiber) 1952 : Naissance officielle de la chromatographie phase gaz (Martinet Synge, Nobel 1952) 1955 – 1960 : Age d’or de la chromatographie en phase gazeuse
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1900: Invention de la chromatographie (Michel TSWETT) 1938 : Première chromatographie sur couches minces (Ismailov et Schraiber) 1952 : Naissance officielle de la chromatographie phase gaz (Martinet Synge, Nobel 1952) 1955 – 1960 : Age d’or de la chromatographie en phase gazeuse Fin des années 60 : Naissance de la chromatographie en phase
Chromato en phase gazeuse CPG - Pharmaetudes
Avantages : o Détecteur quasi universel →répond à ttes les m* organiques (sauf formol et ac formique) o très sensible (du µg au ng) →détecteur par excellence en CPG Inconvénients : o Destruction de l’échantillon o Non spécifique (tous les cp organiques) c) Thermoïonique (ou NPD)
La Chromatographie en Phase Liquide CPL
La CLHP, Chromatographie Liquide à Haute Performance a donc été longtemps appelée Chromatographie Liquide sous Haute Pression Depuis 2004, l'UPLC, Ultra Performance Liquid Chromatography, avec PS de particules < 2 µm (cf "Notions fondamentales de chromatographie"
Chapitre IV mémoire fin d’études 2010
Sur l’appareil à chromatographie en phase gazeuse de marque Hewlett-Packard, le détecteur à conductibilité thermique n’utilise pas un pont de Wheatstone conventionnel Il n’y a qu’une résistance qui sert de référence et de mesure à tour de rôle En voici le schéma: Figure 2 14
Plan du cours - Paris-Est Créteil University
Avantages : répartition tridimentionnelle grande apaité d’éhange (porosité), résistant à la pression, bonne efficacité Inconvénient : stabilité médiocre en fonction du pH (à pH élevé, formation de silicates, solules dans l’eau) –stabilité pour 2 < pH < 9
Ingénierie de fragments danticorps de camélidés (nanobodies
chromatographie d’affinité et chromatographie échangeuse de cations----- 33 4 4 1 Purifiation de B03 à partir d’extraits périplasmiques : -----33
Tests de diagnostic rapide par immunochromatographie en zones
des TDR par immuno-chromatographie Nous étudierons TDR dans les maladies ayant un impact majeur en zones tropicales 3 TDR par immuno-chromatographie des maladies parasitaires 3 1 TDR du paludisme 3 1 1 La détection des antigènes du paludisme L'OMS recommande de diagnostiquer sans retard le paludisme au moyen d’un diagnostic
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Plan du cours
2.PrĠparation de l'Ġchantillon
3.Analyse des métaux
4.Analysedes polluants inorganiques
5.Analyse des polluants organiques
4. Analyse des polluants inorganiques
`Ils rassemblent: `La pollution par les matières azotées: `nitrate (nitrate); nitrite (nitrite); ammonium (ammonium)) `La pollution par le phosphore : `phosphate (phosphate) `La pollution minérale par des selsEspğces solubles dans l'eau
`Ubiquistes dans les différents milieux: sol, eau, air (particules) `Impact sur l'enǀironnement͗ `Pollution de l'eau ͬsol: `Toxicité pour la faune aquatique (ammonium, nitrite) et/ou pour les humains (nitrates, fluorure) `Pollution atmosphérique:`Toxicité des nitrates AEblocage de l'hĠmoglobine interdisant le transport d'odžygğne (aussi ǀrai pour les eaux riches en nitrates)
`Acidification des gouttes nuageuses (Sulfates et nitrates) `Impact radiatif des aérosols contenant des sulfates4. Analyse des polluants inorganiques
`Techniques applicables aux phases aqueuses: `Chromatographie ionique (Ionic chromatography) `Spectrométrie UV/Vis (UV/Vis Spectrometry) `Electrodes ioniques spécifiques (Ion-Selective Electrodes) `But: Séparer les espèces ioniques et les analyser `Principe: Affinité des espèces entre la phase stationnaire(colonne) et la phase mobile(éluant)AE par Ġchange d'ions `Applications: `Estimations des concentrations en espèces réglementées `Estimation des concentrations en espèces ioniques dans une phase aqueuse.4. 1. Chromatographie ionique
4.1. La C.I. d'Ġchanges d'ions͗ ThĠorie
Ex : échange anionique
entre la mobile et la stationnaire.Liaisons ioniques
Phase mobilePompe(s)Injecteur
COLONNE
Détecteur à
conductivitéSuppresseur
électrochimique
4.1. Chromato. Ionique:Appareillage
1) Les copolymères de synthèse (gel)
ͻGénéralement des copolymères polystyrène / divinylbenzène. ͻGrains chimiquement modifiés à leur surface par greffage de groupements à caractère : -acide (groupement sulfoné) échange cationique -basique (groupement ammonium quaternaire) échange anionique Avantage:grande capacitĠ d'Ġchange car sphğres de petite taille Inconvénient: mauvaise résistance mécanique utilisation à faible pressionSO3-NR3+
Echangeur A-Échangeur C+
4.1. Chromato. Ionique:Les phases stationnaires
2) Les résines pelliculaires
Avantage: bonne résistance mécanique (support compact et imperméable). Inconvénient͗ faible capacitĠ d'Ġchange. ͻPolymère appelé Latex, préparé à partir d'un monomğre porteur de fonctions organiques et déposé sous forme de pellicule continue (µ-sphères de 0.1-0.2 m) sur des -sphères en silice, en verre ou en polystyrène (support imperméable).ͻDiamètre entre 5 et 50 m.
4.1. Chromato. Ionique:Les phases stationnaires
3) Les silices greffées
Avantages: répartition tridimentionnelle grande capacitĠ d'Ġchange (porositĠ), résistant à la pression, bonne efficacité.Inconvénient: stabilité médiocre en fonction du pH (à pH élevé, formation de silicates,
solubles dans l'eau) -stabilité pour 2 < pH < 9 Particules de silice poreuse (2-5 m) pouvant servir de support pour fixer, par des liaisons covalentes, des chaînes alkylphényles, substitués par des groupements sulfonés ou ammonium quaternaire ([silice-R'-NR3]+OH-).4.1. Chromato. Ionique:Les phases stationnaires
Phase mobilePompe(s)Injecteur
COLONNE
Détecteur à
conductivitéSuppresseur
électrochimique
4.1. Chromato. Ionique:Appareillage
4.1. Chromato. Ionique:Les phases mobiles
`La phase mobile est généralement une solution aqueuse plus ou moins concentrée.`La rétention des analytesdépend de la concentration et de la charge des ions dissous dans l'Ġluant.
`Si la concentration d'ions compensateurs est forte, les ions de l'Ġchantillon sont moins retenus`Si la concentration d'ions compensateurs est trop faible, les ions de l'Ġchantillon se fidžent de faĕon permanente͊
`PossibilitĠ d'utiliser un gradient d'Ġlution pour les Ġchantillons complexes contenant des composants de forces ioniques variables
`Par ex., débuter avec une phase mobile très diluée avec introductionPhase mobilePompe(s)Injecteur
COLONNE
Détecteur à
conductivitéSuppresseur
électrochimique
4.1. Chromato. Ionique:Appareillage
1.Conductimétrie
2.Détection optique UV/Vis
`Rappels théoriques `La conductivité exprime la resistanceau passage d'un courantélectrique à travers un matériau.
`Pour une solution, k = (cizi0i) `La conductance équivalente ionique (S.cm2.mol-1) représente la conductivité d'un ion de ǀalence Z ă 25°C :0= 1000.k/(C.Z)
Plus C , plus k
4.1. Chromato. Ionique: Les détecteurs
Détection par conductimétrie
Anions0 (S.cm2.mol-1)Cations0 (S.cm2.mol-1)
OH-198H+350
F-54Li+39
Cl-76Na+50
Br-78K+74
I-77NH4+73
NO2-72½ Mg2+53
NO3-71½ Ca2+60
HCO3-45½ Sr2+59
H2PO4-33½ Ba2+64
SCN-66½ Zn2+53
Acétate41½ Hg2+53
Propionate38½ Cu2+55
Salicylate30½ Pb2+71
ͻQuelques valeurs de conductivités ioniques équivalentes4.1. Chromato. Ionique: Les détecteurs
Détection par conductimétrie
peut détecter les acides faibles (peu dissociés). `Difficulté : reconnaître dans le signal global, la part due aux ions de l'Ġchantillon faiblement concentrĠs. `Besoin de systèmes thermostatés car forte variation de la conductivité avec la température. `Besoin d'Ġluants ayant une faible conductiǀitĠ mais une forte affinité pour la phase stationnaire.Phase mobilePompe(s)Injecteur
COLONNE
Détecteur à
conductivitéSuppresseur
électrochimique
4.1. Chromato. Ionique:Appareillage
B. C.I. avec suppression
chimiqueA. C.I. directe
4. 1. Chromatographie ionique: Les détecteurs
`ConductiǀitĠ correspond ă celle de l'Ġluant н celle des espğces ioniques séparées `Donc conductivité de fond élevée par rapport au signal de mesure forte contrainte pour les capteurs de conductivité, sensibilité faible `Forte dépendance de la conductivité avec T T doit être très constant (T 0.01C)A. Chromatographie ionique directe
B) Chromatographie ionique avec suppression chimique Na+A-Na+HCO3-
H+A- H2CO3 SO42- H+ H2O SO42- H+Vers détecteur
HCO3-+ H+--> H2CO3
Na+Na+
H2SO4+
Na2SO4
H2SO4 H2O A-Membrane
perméable aux C+Suppresseur à
membrane cationique (pour analyse des anions)4. 1. Chromatographie ionique: Les détecteurs
B. Chromatographie ionique avec suppression chimiqueNa++ HCO3-H2CO3+ H+
-Na+Na++ Cl-HCl+ H+
-Na+ H2CO3(acide faible) faiblement dissocié donc faible conductivité. `Pour l'Ġluant ͗ `Pour l'Ġchantillon ͗ HCl(acide fort), fortement dissocié, donc conductivité nettement plus grande que celle du sel initial. Signal à mesurer est 0-(Cl-) + 0+(H+) sur un faible fond de conductivité.4. 1. Chromatographie ionique: Les détecteurs
M+Cl- H+Cl- M+OH- H2O H2O H+ H2O H2O OH-Vers détecteur
OH-+ H+--> H2O
Cl- H2O M+Membrane
perméable aux A- (O2)(H2) anodecathode -H2OSuppresseur à
membrane anionique autorégénérée (pour analyse des cations) C) Chromatographie ionique avec suppression électrolytique4. 1. Chromatographie ionique: Les détecteurs
Comparaison de la sensibilité entre C.I. directe et avec suppresseurAnion Sensibilité avec
suppression de fond (ech- - phtalate-)Sensibilité après
suppression chimique (ech- + H+)Fluorure 16 404
Chlorure 38 426
Nitrate 33 421
½ Sulfate 42 430
Acétate 3 391
CationSensibilité avec
suppression de fond (ech+ - H+)Sensibilité après
suppression chimique (ech+ + OH-)Lithium-311237
Sodium-300248
Potassiun-276272
Ammonium-277271
½ Magnésium-397251Intérêt surtout pour la chromatographie anionique `Quel type de signal?4. 1. Chromatographie ionique:
ͻPremière colonne anionique développée par Stevens et Small : AS-1ComposĠe d'une rĠsine en polystyrğneͬdivinylbenzène(particules ~ 25 m) greffée d'un
groupement échangeur -NR3 (5%) Eluant initial : NaOH(transformé en eau par le suppresseur) -problème : faible affinité