Trypanosoma cruzi : transducción de señales y transporte

A Estela Lammel, mi compañera en el laboratorio, de quien aprendí el trabajo con los parásitos ycon quien compartítantos momentos gratos de esta tesis A mi amiga y compañera de laboratorio Marisa Wainszelbaum, por ayudarme en todo cuanto pudo, por ser una amiga como pocas y por la energía contagiosa que transmite altrabajar

Vocabulaire et expressions de base en espagnol /Vocabulario y

Vocabulaire et expressions de base en espagnol /Vocabulario y expresiones básicas Fiche 1 - Nombres / números Fiche 2 - Couleurs / colores Fiche 3 - Formes géométriques / formas geométricas Fiche 4 - Salutations / saludos Fiche 5 - Formules de politesse Fiche 6 - Interrogations Fiche 7 - Mots utiles

La Santa Sede - Vaticanva

¿Queréis ayudarme a hacer un mundo más hermoso y acogedor? ¿Queréis ser testigos de mi amor en la Iglesia y en el mundo? Decidle "sí" con entusiasmo y llevad la alegría del Evangelio al nuevo milenio Pertenecemos más al nuevo milenio, al tercer milenio, que al segundo (En español) 4

Spanish : literature – Higher level – Paper 1

en el que se pudiese cambiar de dirección sin cambiar de sentido —como aviva, como oro, radarcomo , como ala—; un mundo con respuestas, más allá del pasado, en el que cada vida no pudiese encerrarse en un solo destino Ellos creían eso como yo creo en ti Que no te extrañe verte dentro de este poema: el amor se parece a las otras

Le présent de l’indicatif Exercice oral

No querer (ie) ayudarme No jugar (ue) con nadie Estar loco por tu móvil 10 – Tu rêves de vivre aux Etats-Unis Tu ne veux pas rester en France Je ne sais pas si tu as raison *Se construit comme ‘Gustar’

Francés - Magaliprofe

importante en el aprendizaje de un idioma era la calidad de lo aprendido, no la cantidad Esto lo vivenció Sam en sus primeros viajes en América Latina, Luca en su práctica en Rumania, Alejandra en su primer viaje a Inglaterra, Thibault en un intercambio universitario en Brasil y Elle durante el primer semestre de estudios en Francia

[PDF] Aide en français, classe seconde 2nde Français

[PDF] aide en hist 1ère Histoire

[PDF] aide en hist svp 1ère Histoire

[PDF] aide en histoire svp 6ème Arts plastiques

[PDF] aide en histoire! 2nde Histoire

[PDF] Aide en management sportif Bac +4 Management

[PDF] Aide en math 2nde Mathématiques

[PDF] AIDE EN MATH - ALGORITHME 2nde Mathématiques

[PDF] aide en math Dm SVP 1ère Mathématiques

[PDF] aide en math en ligne gratuit PDF Cours,Exercices ,Examens

[PDF] Aide en Mathématiques 2nde Mathématiques

[PDF] Aide en Mathématiques 4ème Mathématiques

[PDF] aide en maths 3ème Mathématiques

[PDF] aide en maths 3eme PDF Cours,Exercices ,Examens

[PDF] aide en maths en ligne PDF Cours,Exercices ,Examens

UniversidaddeBuenos Aires

FacultaddeCiencias ExactasyNaturales

"TRYPANOSOMACRUZI:TRANSDUCCIÓN DE

SEÑALESYTRANSPORTE ENDOCITICOENLA

INTERACCIONPARASITO-CELULAHUESPED"

Tesispresentadapara optaralTitulo deDoctorde laUniversidadde

BuenosAires

SilvinaElizabethWilkowsky

Director:Dra.Elvira L.Durantede Isola

'A'" ar."l "¿"233.11:3: .4É? EL!¿'L ¿iÉí E13ÉsHi'; LaL:ur ia,E:> : DepartamentodeMicrobiología, ParasitologíaeInmunología

FacultaddeMedicina-UBA

fi-0(.1999 su(D(/d vo)"..1oia hal0-00....,o"n

1AMarcelo, porsuamor incondicional

Amispadresyhermanapor suapoyoy suayuda

Agradecimientos

ResumenenEspañol

ResumenenInglés Abreviaturas

INTRODUCCIÓN

EnfermedaddeChagas

Etapaaguda

Etapaindeterminada

Etapacrónica

ElparásitoUbicaciónsistemática

Estructurayestadios evolutivos

Ciclodevida

Elinsectovector

Adaptacióndelparásito alecosistema.

morfogénesisycaracterísticas delosestadíos

Transduccióndeseñales

Moléculasinvolucradasenlatransducciónde señales

Mecanismosdeestimulación delasseñales deCa

ProteínakinasaC

ProteínasG

AWN-ï

ProteínasGheterotriméricas

ProteínasGmonoméricas

Segundosmensajeroslipídicos

RelaciónentrePI3K yotrasproteínas celularesInteracciónconPKB InteracciónconFosfolipasa CyCa2+ InteracciónconRab 5

MATERIALESYMÉTODOS

Parásitos

Epimastigotes

Tripomastigotes

Tripomastigotesdecultivo

Célulasdemamífero

Macrófagosperitoneales

MacrófagosdeIa líneaJ774

MacrófagoshumanosCélulasVero

CélulasNIH3T3, L6E9,CHOCélulasNIH3T3 transfectadasconPKB Infeccióndecélulas demamíferocon T.cruzí

FraccionamientosubceIuIarde T.cruzi

24
26
30
33
33
34
34
36
36
36
36
38
38
38
39
40
40
41
41
41
42
42
42
43
Tratamientoyposterior infeccióndemacrófagos peritoneales conmoduladoresde segundosmensajeros

Moduladoresdel[0.2121i

Inhibidoresdeproteínaskinasas

Moduladoresdeproteínas G

Determinacióndela [Caz"]¡enmacrófagos peritoneales Tratamientodelos macrófagosperitonealescon Fura2AM

Cálculodela [Caz']¡

DeterminacióndeIa [Caz']¡enmacrófagos peritonealesinfectados oestimuladoscon fraccionessubcelularesparasitarias Determinacióndela [Caz']¡enmacrófagos peritonealesen presenciademoduladores deproteínasG Determinacióndeinfectividad demetacíclicospretratados conmoduladoresde proteínasG Determinacióndeinfectividad detripomastigotesde cultivo pretratadosconinhibidores dePI3K DeterminacióndeIa actividadPI3Ken célulasVero estimuladasconfracciones subcelularesparasitarias Determinacióndela actividadPI3Ken tripomastigotesdecultivo Determinacióndela actividadPKBen célulasVero estimuladasconfracciones subcelularesparasitarias

Gelesdepoliacrilamida paraproteína

44
44
45
45
46
46
48
49
50
51
51
52
55
55
56
Obtencióndelíneascelularesquesobreexpresan laproteína

SubclonadodeRab 7enel vectordeexpresión

paramamíferospcDNA 3.1/Hygro

Obtencióndelos fragmentosdeRab 7

MinipreparacionesdeDNA plasmídico

Reacciónencadena delapolimerasa

Preparacióndegeles paraDNA

PurificacióndelDNA amplificadoExtracciónconfenol cloroformo

Precipitaciónconetanol

Digestiónconenzimas derestricciónPurificacióndelinserto Rab7 ObtenciónyIinealización delvectorpcDNA 3.1/Hygro

Minipreps

Digestiónconenzimas derestricción

Purificacióndelvector pcDNA3.1/Hygro

Ligadodelos fragmentosRab7 enelvector

pcDNA3.1/Hygro

Transformacióndebacterias conIaconstrucción

Rab7-pcDNA3.1/Hygro

Preparacióndebacterias competentesparacongelar Transformacióndebacterias

Screeningdecolonias transformadas

Secuenciacióndelas construccionespcDNA-Rab7

(WT,822N.Q67L yN125I) 58
58
58
59
60
61
62
62
63
63
64
64
64
65
65
65
66
67
68
69
Transfeccióndecélulas demamíferocon laconstrucción pcDNA-Rab7

MidiprepsTransfeccióndecélulas CHO

Determinacióndela expresióndeRab 7encélulas transfectadas Estudiosdeinvasión delT.cruzien célulasCHOque sobreexpresanRab7 InfeccióndecélulasCHOtransfectadascon T.cruzí

Inmunomarcaciónymicroscopía confocal

InmunomarcaciónparaRab 5yRab 7

InmunomarcaciónparaPKB

RESULTADOS

Modelodeinteracción T.cruzi-macrófago

Estandarizacióndelas técnicasdecultivo demacrófagos peritonealeseinfección delosmismos contripomastigotes metacíclicosysanguíneos InfeccióndeMO J774contripomastigotes metacíclicos ysanguíneos Determinacióndelos nivelesdeinfección enmacrófagos peritonealespretratadoscon moduladoresdeCa2+ DeterminacióndeIa [Ca2+]¡enmacrófagos peritoneales infectadoscontripomastigotes metacíclicos Determinacióndela [Ca2*]¡enmacrófagos peritoneales tratadosconfracciones subcelularesparasitarias 70
70
71
71
74
74
75
75
76
78
78
80
81
82
84
Efectodeinhibidores deIaproteína kinasaCen Iainfección demacrófagosperitoneales portripomastigotesmetacíclicos

Efectodecompuestosmoduladoresdeproteínas G

heterotriméricasenla infeccióndemacrófagos peritoneales portripomastigotesmetacíclicos Efectodelas toxinascoléricay pertussissobreIa capacidad peritoneales EfectodelMastoparán ylatoxina pertussissobrela [Ca2*]¡ demacrófagosperitoneales Determinacióndelos nivelesdeinfección encélulasde

mamíferopretratadascon inhibidoresdePI3K Determinacióndela actividadPI3Ken célulasestimuladas

conmembranasparasitarias Determinacióndelos nivelesdeinfección entripomastigotes decultivopretratados coninhibidoresdePI3K DeterminacióndeIa actividadPI3Kdel estadíotripomastigote Determinacióndela actividadPKBen célulasestimuladascon fraccionessubcelularesparasitarias Invasiónencélulas NIH3T3que sobreexpresanPKB Análisispormicroscopía confocaldela invasióndetripomastigotes decultivoen célulasNIH3T3quesobreexpresanmutantes dePKB Obtencióndelíneas celularesquesobreexpresan IaproteínaRab 7 PurificacióndelosfragmentosN125|y 067Lobtenidospor PCR

Obtencióndelvector pcDNA3.1/Hygrolinealizado

87
88
90
91
92
96
99
100
101
103
104
106
107
108
Screeningdelas coloniasobtenidaspor transformaciónconla construcciónRab7-pcDNA 3.1/Hygro

Preparacióndelas célulastransfectadas

DeterminacióndeIa expresióndelas proteínasRab7encélulasCHOtransfectadas Participacióndelas proteínasRab5 y7en lainvasióndel T.cruz¡

DISCUSIÓN

Estandarizacióndelas técnicasdecultivo demacrófagos peritonealesyJ774 einfecciónde losmismoscon tripomastigotes metacíclicososanguíneos ParticipacióndelCa2+ enIainteracción macrófago-parásito ParticipacióndeIa PKCenIa interacciónmacrófago-parásito Participacióndeproteínas Gheterotriméricasde la célula-huéspedenla interacciónmacrófago-parásito Participacióndeproteinas Gheterotriméricasdel T.cruz¡enla interaccióndelparásito-célula huésped Participacióndela PI3Kyla PKBdeIa célula-huésped enlainteracción parásito-célula ParticipacióndeIa PI3KdelT.cruz¡ enlainvasión alacélulahuésped

ParticipacióndeRab 5yRab 7enIa interacción

parásito-célulahuésped 109
110
111
112
120
121
124
126
129
130
133
quotesdbs_dbs5.pdfusesText_10

[PDF] Trypanosoma cruzi : transducción de señales y transporte