La PCR en temps réel: principes et applications
cycle En pratique, il n’est pas rare que les réactions de PCR en replica donnent des taux différents d’amplicons Le développement de la PCR quantitative en temps réel a éliminé les variabilités traditionnelles associées à la PCR quantitative et permet la quantification du produit de la PCR de façon fiable et routinière
PCR en temps réel (PCR quantitative)
PCR en temps réel (PCR quantitative) But 1 Comprendre la difference fundamentale entre la PCR en temps réel and la PCR traditionnelle 2 Comprendre les calculs de base pour la quantification avec la PCR en temps réel 3 Comprendre les differences entre la PCR en temps réel et le transfert Northern Applications de la PCR en temps réel
L’AMPLIFICATION GÉNIQUE PAR PCR (Polymérase Chain Reaction)
Méthodes RT-PCR en temps réel utilisées au laboratoire RT-PCR en temps réel en deux étapes simplex pour détection Pan FA (détecte une cible dans une réaction) Les cibles : IRES et/ou 3D, et cible endogène : β-actine Sondes TaqMan® mauées FAM (en 5’) et TAMRA (en 3’)
Principe de lamplification par PCR
Une méthode quantitative : la PCR en temps réel Le principe de la PCR en temps réel repose sur la possibilité de suivre la quantité d’ADN présente dans la réaction à tout instant et non à la fin de la PCR (PCR en point final) Des sondes* fluorescentes se fixent : soit sur l’ADN double brin (ex : Technologie SYBR)
Rappel Détermination des conditions (amorces, t°C d
Quantifier l’ADN: la PCR quantitative 96 Replicates -1 00E-01 4 00E-01 9 00E-01 1 40E+00 1 6 11 16 21 26 31 36 Cycle Number Analyse temps réel Analyse point Final Detection de fluorescence au cours d’une PCR
Catalogue des analyses de Pathologie Moléculaire
visée théranostique avec perte d'expression en IHC PCR pentaplex + analyse de fragments N500 ¼ 25 Séquençage Sanger (exon 15) N408 ¼ Mutation spécifique V600E : PCR allèle spécifique en temps réel N408 ¼ Méthylation de hMLH1 Colon /Gynéco (Tumeurs MSI+ / MLH1-) PCR en temps réel N533 ¼ 45
Laboratoire de Contrôle des Reproducteurs Référence : PO
RT -PCR en temps ré el (méthode qualitative) – Sang Méthodes internes -Kit d’extraction VetMAX BTV4 IAH Typing Kit Applied biosystems -Kit d’amplification VetMAX BTV4 IAH Typing Kit Applied Biosystems Instruction de travail : AN RS /IT-P03(22) version 1 Présence ou absence du génome viral de la
Guide Mise en place de laboratoire de biologie moléculaire
Les tubes de PCR doivent être capuchonnés dès que l’éhantillon ait été ajouté [ou plaques de réaction 96 puits filmées] SALLE D’AMPLIFICATION ET D’ANALYSE DES PRODUITS D’AMPLIFICATION Cette salle doit être réservée à l’amplification PCR [ ] Le thermocycleur/appareil de PCR en temps réel doit y être installé
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