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1 1
TECHNIQUES:
Principes de la
chromatographie 2
Définition
La chromatographie est une méthode physique de séparationbasée sur les différentes affinités d'un ou plusieurs composés à l'égard de deux phases (stationnaire et mobile). L'échantillon est entraîné par la phase mobile au travers de la phase stationnaire qui a tendance à retenir plus ou moins les composés de l'échantillon à l'aide de différentes interactions. L'échantillon est adsorbé puis désorbé sur la phase stationnaire, ou est plus ou moins solubledans la phase mobile. 2 3
Types de chromatographies
Type Critère de séparation
Adsorption Polarité
Partage Solubilité
Exclusion Taille des molécules
Échangeuse d'ions Charge ionique
Affinité Structure des protéines
Il est rare de pouvoir associer une méthode chromatographique à un seul phénomène. 4
Types de chromatographies
Chromatographie
échangeuse d'ions
Chromatographie
d'exclusion 3 5
Chromatographies d'adsorption
Phase mobile Nom
Gaz
Chromatographie en phase
vapeur (CPV) ou en phase gazeuse (GC)
Liquide
Chromatographie couche mince
(CCMou TLC) ou éclair
Liquide
Chromatographie liquide à haute
performance (CLHP ou HPLC) 6
Utilité de la chromatographie
Selon la quantité de produit appliqué en chromatographie, on s'en sert pour: •Analyser< 1 mg de produit par CCM, HPLC ou CPV •Séparer ou purifierles produits d'une réaction par chromatographie éclair ou HPLC (50 mg à 15 g) •Doserdes produits. L'analyse quantitative se fait avec un étalon interne ou après préparation d'une courbe de calibration. 4 7
Chromatographie d'adsorption: principe
La chromatographie d'adsorption est basée sur le partage des solutés entre l'adsorbant solide fixeet la phase mobile. Chacun des solutés est soumis à une force de rétention par adsorption et une force d'entraînement par la phase mobile. L'équilibre qui en résulte aboutit à une migration différentielle des solutés de l'échantillon à analyser, ce qui permet leur séparation. Les séparation sont basées sur le principe de polarité, c'est-à-dire l'existence de dipôles dans une structure moléculaire. Adsorbants possibles (du moins polaire au plus polaire): Papier, cellulose, amidon, carbonate de sodium, gel de silice, alumine, charbon activé. 8
Adsorbants
Les adsorbants sont sous forme de granules
calibrés. La séparation est meilleure, mais plus lente si les grains sont fins.
Plus un adsorbant est actif, plus il retient
fortement les composés polaires. La séparation se fait par ordre croissant de leurs forces d'interaction avec les composés polaires. 5 9
Polarité des groupements
fonctionnels neutres
Le gel de silice est polaire, il
a par conséquence une plus grande affinité pour les composés polaires:
Un composé peu polaire
est peu adsorbé.
Un composé polaire est
très adsorbé. R-H R-X R-NO 2
RORROR
O RR O RH O RNR 2 O ROH O R-NH 2
R-OH Ar-OH
Polarité croissante
Les molécules chargées ne migreront habituellement pas sur gel de silice, elles sont trop polaires. 10
Phase mobile
Une phase mobile liquide est appelée éluant.
C'est elle qui fait migrer les composés, son
choix est donc important. Il faut que le soluté soit solubledans l'éluant.
Il est possible de faire des mélanges de
solvants pour changer sa polarité.
Polarité croissante
Hexanes
CCl 4
Benzène, Toluène
Et 2 O CH 2 Cl 2 AcOEt
MeOH, EtOH
AcOH 6 11 Deux facteurs interviennent lors de l'interaction entre l'éluantet le soluté (mélange de composés à séparer): •la solubilité: on doit être en mesure de dissoudre le soluté dans l'éluant pour que la migration se fasse. •la polaritéde l'éluant va déterminer à quelle vitesse le composé migre. Moins un composé est polaire, moins il s'accroche à l'adsorbant, plus il migre avec l'éluant.Choix d'un éluant peu polaire Plus un composé est polaire, plus il s'accroche à l'adsorbant, moins il migre avec l'éluant. Choix d'un éluant polaire
Choix de l'éluant
12
Chromatographie sur couche mince
L'adsorbant (silice, 250 m d'épaisseur) est fixé sur une plaque (Al, verre) commercialement disponible. Le produit/mélange de produits est déposé sur la plaque à l'aide d'un capillaire. Les produits sont révélés après élution. 7 13
Préparation d'un capillaire
Au laboratoire, les capillaires sont préparés au départ de pipettes Pasteur: • Chauffer la partie centrale de la pipette dans la flamme d'une torche au propane en tournant le tube jusqu'à ce qu'il soit mou. • Retirer de la flamme et étirer la pipette. • Laisser refroidir et couper la partie fine du milieu. 14
Utilité des CCM
1.CCM analytiques(250 m, 2.5 x 7.5 cm)
• Vérifier la pureté d'un produit, quelques microgrammes suffisent • Suivre l'avancement d'une réaction • Vérifier l'efficacité d'une extraction liquide-liquide • Déterminer l'éluant pour la chromatographie éclair sur gel de silice
2. CCM préparatives(1000
m, 20 x 20 cm) • Purification de petites quantités de produit (jusqu'à ~100 mg sur une plaque de 20 x 20 cm). La bande qui contient le produit purifié est grattée, puis la silice est extraite avec un solvant. 8 15
Préparation de la CCM
ABC
1. On trace un trait à ~1 cm du bord inférieur de la plaque.
On marque les futur dépôts, espacés d'environ 0.5 cm.
On identifie chaque produit qu'on fera éluer.
2. Le produit/mélange doit toujoursêtre dilué dans
un solvant (Et 2 O, CH 2 Cl 2 , AcOEt...) assez volatil. Dans un vial, déposer 1 goutte ou 2-3 cristaux de produit + ~0.5 mL solvant. 16
Élution de la CCM
3. On utilise un capillaire pour déposer le produit sur la
plaque puis on laisse évaporer le solvant. On peut spotter
2-3 fois si l'échantillon est très dilué.
4. Élution: préparer une cuve d'élutionavec
•Bécher de 250 mL avec un papier absorbant à l'intérieur •Verre de montre Y verser 10 mL d'éluant (ex. 8 mL Hex + 2 mL AcOEt) Placer la CCM dans la cuve en veillant à ce que la ligne soit au-dessus du liquide. Faire éluer jusqu'à ~5 mm du bord et tracer un trait pour marquer le front de solvant. 9 17
Révélation de la CCM
•À l'oeil nu: si le produit est coloré •À la lampe UV: les molécules qui absorbent les UV à 254 nm seront visibles (noyaux aromatiques par exemple). •Avec un révélateur chimique:l'iode est le premier révélateur à tester, car il est non destructif. Il permet de révéler des doubles liaisons et les halogénures. L'iode est évaporé à chaud ou dans la hotte.
De nombreux autres existent: KMnO
4 , acide phosphomolybdique, vanilline, ninhydrine...
UV KMnO
4 18
Mesure du R
f
Produit moins polaire, moins accroché
Produit plus polaire, plus accroché
1et 0 entrevaleur solvantdefront du Hauteur migration deHauteur Rf
Le R f (rapport frontal ou rétention frontale) est caractéristique d'un produit dans un éluant donné et pour une phase stationnaire donnée. Ll 1 l 2 10 19
Influence de l'éluant
Lorsque la polarité du solvant augmente, le R
f augmente. Le R f augmente, puis diminue. Pour faire une séparation de deux produits par chromatographie, on cherche un éluant qui donne le plus grand R f possible, avec un R f pour le produit le moins polaire autour de 0,3.
Polarité de l'éluant
100% Hexane 95% Hexane5% AcOEt90%Hexane10% AcOEt80%Hexane20% AcOEt70% Hexane30% AcOEt
20
CCM bidirectionnelles
C'est une expérience qui permet de prouver si un produit décompose sur la silice, ou si un "spot" de la CCM contient en fait deux produits.
Si élué dans un autre solvant
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NOTIONS FONDAMENTALES DE CHROMATOGRAPHIE