[PDF] Cours N°1 Principes de Base de la Microscopie Electronique en

43 Le microscope optique

du microscope optique Le microscope optique est un instrument fragile qui doit être manipulé de manière sécuritaire Voici quelques conseils à garder en tête : † Tiens toujours le microscope à la verticale Si tu dois le déplacer, utilise tes deux mains : place l’une de tes mains sous le pied et l’autre sur la potence (fi gure 2)

La microscopie optique à sonde locale - EDP Sciences

Microscope Tunnel Optique appelé STOM (Scanning Tunneling Optical Microscope) ou PSTM (Photon Scanning Tunneling Microscope) par analogie avec le Microscope Tunnel Electronique Ce microscope fonctionne en transmission mais l'objet est éclairé en réflexion totale interne ce qui produit sur la surface de l'objet une onde évanescente de Fresnel

Le microscope optique 001 - IASI DENTAIRE

Le microscope optique est un instrument d'optique muni d'un système objectif et d'un système habituellement binoculaire qui permet de grossir l'image d'un objet de petites dimensions (ce qui caractérise son grossissement) et de séparer les

Cours N°1 Principes de Base de la Microscopie Electronique en

Electron Microscope Optical Microscope Eye Microscope - A device with a lens or series of lenses that enlarge (magnify) the appearance of an object Does not apply to SEM Image - Perception of an object using your eyes (vision) One can sense an object without vision (touch, etc ) Requires visible light Resolution is dependent the wavelength

Eléments de microscopie optique et électronique

en microscopie optique 1 3 1 Interaction onde-matière 1 3 2 Principe d’une lentille convergente 1 3 3 Trajet de la lumière dans un microscope 1 3 4 Limites de résolution 1 3 5 Anomalies des lentilles

Manuel dutilisation Microscope de laboratoire à lumière

Le microscope, en revanche, est conçu pour n’émettre presque aucune chaleur et il n’y a donc aucun risque de brûlure au contact de sa surface 1 3 Stockage Évitez d'exposer l'appareil à la lumière directe du soleil, à des températures trop élevées ou trop basses, à des secousses, à la poussière et à une humidité élevée

Quelques méthodes détude de la cellule Microscopes

systèmes optique~ qui permettent un grossissement Il-Notion de système grossissant : le microscope Les limites de l'observation à l'œil nu imposées par le pouvoir séparateur de l'œil ont été dépassées par l'invention d'un système grossissant à pouvoir séparateur plus petit, le microscope (micro= petit; scope = regarder)

Leica DM100 Manuel dutilisateur

Protégez le microscope de l'huile, des produits chimiques et de l'extrême humidité de l'air En cas d'utilisation en plein air, le microscope doit être protégé de la poussière et de l'humidité N'installez jamais les dispositifs électriques en plein air ; installez-les toujours à au moins 10 cm d'un mur et loin de toute substance inflam-

Organisation et fonctionnement des organismes

Organisation et fonctionnement d’un organisme pluricellulaire : l’Homme Capacités travaillées Activités Aides / indicateurs de réussite Observer une préparation microscopique montrant des cellules animales luminosité est bien réglée • Observer les différentes préparations microscopiques de tissus à votre disposition

[PDF] microscope optique et ses parties

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Microscopie électronique et traitement d'images

Cours N°1 Principes de Base de la Microscopie Electronique en Transmission et à balayage Master informatique spécialité IMA

Catherine Vénien-Bryan!

Institut de minéralogie et de physique des milieux condensés (IMPMC)! CNRS UMR 7590, UPMC!E-mail: catherine.venien@impmc.upmc.fr!

!"#$%&$'())*+'Electron Microscope Optical Microscope Eye

Microscope - A device with a lens or series of lenses that enlarge (magnify) the appearance of an object. Does not apply to SEM. !!Image - Perception of an object using your eyes (vision). One can sense an object without vision (touch, etc..). Requires visible light. Resolution is dependent the wavelength of illuminating source '!

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lampe filament lentille condenseur spécimen lentille objectif lentille projecteur image intermédiaire écran image microscope optique microscope électronique

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60x!660x!6660x!66000x

Bridget Carragher!

Clint Potter!Ron Milligan!Scripps Inst.!San Diego!

Observer des proteines en coloration négative ! (De Carlo et al.)!

Rotavirus

(Yeager Lab Scripps, San Diego)

Actin decorated with Dictyostelium S1

(Manstein Lab, Heidelberg Image: T. Wendt) b59%!h95*!$&*%'!;!

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Limite de résolution d'un instrument liée à la nature ondulatoire du rayonnement, phénomène de diffraction Disque d'Airy Pouvoir de résoluti on ou pouvoir séparat eur mesure la distance transve rsale minimale entre deux points dont les taches de diffraction peuvent être séparées critère de Rayleigh La résolution sera toujours égale ou inférieure au pouvoir de résolution, et c'est une valeur qui va dépendre des conditions expérimentales d'observation !

"6&.'!%8'--'n!?'!>/8#56@#'!('!(*[%&=H5#!>%57*'#0!('!-G*#l':*5#!(9!0%&F'0!('!-&!-96*@%'!&9!>&++&.'!m!>%5:*6*08!(G9#!5,+0&=-'P!?'!,5%(!('!-G5,+0&=-'!+'!=56>5%0'!&-5%+!-9*D6p6'! =566'!9#'!+59%='!-96*#'9+' P!<*!-&!-96*@%'!'+0! +9q+&66'#0!=5/8%'#0'M!5#!75*0!&>>&%&r0%'!('+!$%&#.'+!(G*#0'%$8%'#='!+9%!-G*6&.'P!

"6&.'!*(8&-'M!"6&.'!%8'--'! 1,21 !"n sin(#) d = !" = longueur d'onde n = 1 indice de réfringence # = demi-angle d'ouverture

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T°C d'utilisation Energie fournie pour franchir le mur de potentiel (eV) Dispersion en énergie

(eV)

Pression du vide

(mbar)

Brillance

(A/sr.cm!)

(sr :stéradian unité d'angle solide) Filament de tungstène

2700 4,1 Environ 1 <10

-4 5.10 8

Filament de LaB6 1500 2,5 1 - 0,6

10 -6

à 10

-8 5.10 9

à 10

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7'>#+d'!2H'/*->(J)&'(J#&+"%+'&)&'G%UF+OM!#'!K75*0L!>&+!!!-G8=/&#H-5#!5H'/*->(J)&'G%UF+O'O*#+QPF-"-&(Y'GOe->(OB!D"#0'%&=H5#!&7'=!9#!&056'!('!-!8=/&#H--5#!Db&+!('!=/&#.'6'#0!(G8#'%.*'P ! #'!=/&#.'!>&+!(9'!m!-&!6&++'!0%@+!8-'78'!(9!#53&9!=56>&%8'!m!-&!6&++'!('!-G8-'=0%5#!D?&!>/&+'!=/&#.'!D<&!0%&F'=05*%'!'+0!(87*8'!('!$&i5#!*6>5%0�'!Idk

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T%8h9'#='+!+>&H&-'+!45#0%&+0'!

H(k) = 2![(1-W)!sin% - W!cos%]

Avec: k = fréquence spatiale (espace réciproque 1/distance) % = 2&"(0,25"k 4 "Cs"! 3 - 0,5"!"$z"k 2

) W = pourcentage du contraste d'amplitude ! = longueur d'onde des électrons Cs = Constante d'aberration de sphéricité de la lentille $z = sous-focalisation durant la prise de vue

b)&(J#+('(J#&+I-J'IF&>Q)&'

Low-pass filter

Image

Pixel size: 5.5 Å

Low-pass filter High pass-filter

Image

Pixel size 5.5 Å

object CTF defocus 1 Image altered by CTF Image altered by CTF and contrast inverted X = CTF

Resolution limit 11 Å

object CTF defocus 2 Image altered by CTF Image altered by CTF and contrast inverted X =

Resolution limit

CTF

17 Å

object CTF defocus 3 Image altered by CTF X = CTF

25 Å

Image altered by CTF and contrast inverted

Resolution limit

object CTF defocus 4 Image altered by CTF X = CTF

Resolution limit 30 Å

Image altered by CTF and contrast inverted

FTC FTC

2

CTF defocus value-500 nm CTF defocus value-1000 nm Wiener Filter Wiener Filter CTF x filter CTFxfilter

defocus 1 defocus 2 After CTF correction CTF

Wiener Filter Wiener filter

CTF 1 CTF 1 2 N (CTF n x filter n CTF 2 CTF 2 2

Préservation de la structure

•"Avant l'acquisition d'images l'échantillon biologique doit être protégé contre la radiation et le vide poussé générés par le microscope électronique

-"les électrons interagissant avec la matière organique non-protégée détruisent irrémédiablement sa structure

Préservation de la structure en MET!

•"Specimens fins (0.5 um), particules isolées et cristaux 2D haute résolution -"Coloration négative -"Cryo-microscopie électronique •"Specimen épais: cellules et organismes - Tomographie électronique cellulaire

Negative staining

=J-L#J#Q)&')I'(;-'+L->%"-&'

Propriétés de la coloration négative

•"Bon contraste •"Contraste d'amplitude (lié à la perte d'électrons au passage du

faisceau dans l'échantillon et les diaphragmes des lentilles à cause de la diffusion (élastique) augmentée d'électrons par les atomes lourds)

•"Les images ne montèrent pas fidèlement les structures internes du

matériel biologique mais seulement les surfaces moléculaires accessibles au colorant -"Utile pour les études structurales à basse résolution, 20Å au mieux (pour calculer

un modèle initial 3D qui sera raffiné par la suite en utilisant les images de haute résolution i.e., les images de la cryo-MET à faible dose d'électrons et sans colorant)

•"Il peut y avoir des artéfacts du à l'utilisation d'un colorant:

accumulation du colorant, légère déformation du spécimen. Une couche de glace vitreuse se forme dans les trous du carbone

Condition physiologique Contraste de phase

Supports d'observation

Plongeur (guillotine) à déclenchement manuel

La cryo-MET sur spécimen congelé-hydraté

Protocole de préparation des échantillons

Frozen-hydrated specimen -Cryo Electron Microscopy! Severe irradiation damage: a dose higher than 20 electrons/Å 2 causes severe irradiation damage. We need to work at low dose of electrons, typically 15 ' D sa e! : ek!' D sa e!!!!!! fk!' D sa e!!!!!!!!!!!!! zk!' D sa e!!!!!!!!!!!!!!!! uk!' D sa e Very low contrast: Reduction of noise by averaging

e!!!!!!!!!!!!!^!!!!!!!!!!!!!!!dk!!!!!!!!!!!!!!e^!!!!!!!!!!!ekk!!*6&.'+! Tobacco Mosaic Virus Sachse et al., 2007. J. Mol. Biol. 371:812-35

TOMOGRAPHY CELLULAIRE !

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Electron tomography - Examples (1)

Electron tomography can reveal heterogeneity of complex assemblies. Use of cryo-ET to reveal the heterogeneity of the core of

HIV-1 virions in size and shape.

A) Slice through the computed tomogram. HIV-1 particles

were purified, inactivated, mixed with 10 nm colloidal gold and vitrified. The virions have an approximately spherical shape, with diameters between 106 and 183 nm.

B) Projection image of the same area with visible gold fiducial markers. C) Three-dimensional structure of three virions segmented

from the tomogram shown above a central slice through it. Viral membrane, blue; density between the membrane and the core, yellow; viral capsid, red. The core was revealed by removing computationally half of the blue and yellow densities. The scale bars are 100 nm. (Briggs et al (2006). Structure

14:15-20)

Electron tomography - Examples (3)

Nuclear envelope with nuclear pore complexes at 8-9 nm resolution.

When the sample contains many identical copies of the same structure, particle volumes e xtracted from tomograms can be averaged or traditional si ngle-par ticle analysis strategies (classification and averaging) can be used to average projection images from identical particles and, thus, improve the signal-to-noise ratio and the resolution of the reconstructed volume. Combination of single-particle and electron tomography techniques

Beck et al (2004). Science 306, 1387-1390.!

Electron tomography - Examples (2)

Projection Central slice of the 3D reconstruction Cut-away views of surface renderings

Herpes simplex virus 1 (HSV-1). Size: 200 nm. Resolution: 7 nm. Vaccinia virus (Intracellular mature virus-IMV). Size: 360 nm. Resolution: 5 nm. Human immunodeficiency virus (HIV-1). Size: 130 nm. Resolution: 4 nm.

Grunewald et al (2003). Science 302:1396-1398. Cyrklaff et al (2005). Proc Natl Acad Sci USA 102:2772-2777. Briggs et al (2006). Structure 14:15-20.

Microtubules rat brain tissue

Garvalov BK et al, J Cell Biol. 2006 11;174(6):759-65quotesdbs_dbs8.pdfusesText_14