Repiquage dune lignée cellulaire
Repiquage d'une lignée cellulaire Le repiquage est comme le changement de milieu, une opération à pratiquer régulièrement pour entretenir une culture cellulaire in vitro La plupart des cellules cultivées in vitro adhèrent au support qui leur est fourni Quand on met en culture
SITUATION PROFESSIONNELLE Repiquage de cellules sous DANS LE
Repiquage de cellules sous PSM Damien, étudiant de première année en BTS biotechnologies réalise le repiquage d’une lignée continue de cellules Vero en milieu DMEM complet (DMEM - glutamine – pénicilline - sérum de veau fœtal) Cette lignée est isolée à partir de cellules épithéliales de rein d’un singe vert
Chapitre 1 Les méthodes d’étude en biologie cellulaire
- Lignée cellulaire: lignée constituée de cellules de même type issue d’une culture primaire, constituée au moment du premier repiquage Il existe deux types de lignées cellulaires : les lignées finies et les lignées continues - Les lignées finies: lignées à durée de vie limitée entre 30 et 50 repiquages
Travaux Dirigés de Biologie Cellulaire
un nouveau récipient de culture avec du milieu frais Cette opération est appelée: repiquage • Culture de Lignées Cellulaires Une lignée cellulaire est une population homogène de cellules , stables après des mitoses successives, et ayant une capacité illimitée de division (entretien in vitro par repiquages successifs)
CULTURE DE CELLULES ANIMALES - Free
procéder à un repiquage ou passage, c'est à dire, redistribuer les cellules dans plusieurs flacons ou bien en jeter une partie et rajouter du milieu neuf : de cette façon les cellules disposent de nouveaux éléments nutritifs et de place pour adhérer A partir du premier repiquage on parle de lignée cellulaire
Culture des cellules animales - Free
Culture secondaire = culture obtenue par repiquage à partir d’une culture primaire (ou d’une autre culture secondaire) Lignée cellulaire = Une lignée cellulaire est une population homogène de cellules, stables après des mitoses successives, et ayant en théorie une capacité illimitée de division (entretien
CULTURE CELLULAIRE - univ-angersfr
Clone : population cellulaire issue de la division cellulaire, par mitose, d’une cellule unique Toutes les cellules d’un clone sont identiques Existe différentes méthodes pour obtenir des clones : "clonage par micromanipulation à partir de colonies obtenues en milieu semi solide Repiquage d’une colonie = 1 clone
Chapitre 1 M´ethodes d’Etudes en Biologie
19 Les cultures cellulaires A) Une culture primaire est issue directement d’un tissu B) Une culture secondaire est issue du repiquage d’une culture primaire C) Toutes les cellules en culture ont un nombre de divisions limit´e D) Une lign´ee cellulaire est issue d’une tumeur spontan´ee ou d’une immor-talisation
Culture cellulaire - Cours L3 Bichat 2012-2013
Culture cellulaire L'étude de l'organisme et de l'organe est le domaine du clinicien Le tissu et la cellule sont le domaine des anapath La biologie moléculaire est la recherche fondamentale, recherche du mécanisme d'une molécule dans une cellule, sur des cellules isolées a partir d'un organe ou a partir de culture cellulaire
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Repiquage d'une lignée cellulaire
Le repiquage est comme le changement de milieu, une opération à pratiquer régulièrement pour
entretenir une culture cellulaire in vitro.La plupart des cellules cultivées in vitro adhèrent au support qui leur est fourni. Quand on met en culture
des cellules adhérentes cultivant en monocouche, elles prolifèrent jusqu'à former un tapis unicellulaire
confluent, moment ou leur multiplication s'arrête. Pour maintenir la culture, il faut procéder au repiquage
des cellules, c'est à dire leur transfert dans y de nouveaux récipients et dans du milieu neuf, à une
densité cellulaire inférieure à celle de la confluence.1. Problème posé par le repiquage
1) Trypsination
Les cellules cultivées in vitro adhèrent au support et adhèrent entre elles grâce à la matrice
extracellulaire. Le repiquage des cellules nécessite leur décollement du support et leur séparation les
unes des autres, ce qui est obtenu par action d'une enzyme protéolytique, la trypsine. Son action est
inhibée par les ions calcium et par le sérum de veau foetal (SVF).Conséquences:
- avant de faire agir la trypsine, toute trace de calcium et de SVF doit être éliminée: étape du
lavage du tapis cellulaire- une fois que l'enzyme a individualisé les cellules, il faut que l'action de la trypsine soit arrêtée
par addition de SVF avant que les cellules ne soient abîmées. Il faut donc contrôler l'action de la trypsine
en stoppant son activité dès que le tapis cellulaire s'est individualisé du support.2) Numération
Le repiquage des cellules dans le milieu neuf doit se faire à une densité inférieure à celle de la
confluence. Connaissant la surface de la boite et la quantité de cellules à repiquer pour obtenir une
croissance optimale, il faut après trypsination dénombrer les cellules vivantes et mortes pour déterminer
avec précision le volume de suspension cellulaire à introduire dans une nouvelle boite de culture (lors
d'un repiquage de routine, l'étape de numération devient souvent inutile).3) Préparation du milieu de culture
Les cellules sont cultivées en milieu DMEM. Ce milieu doit être complété au moment de l'emploi de la
manière suivant: produit à ajouterconcentration initialeconcentration finale volume à ajouter pour 500mlSVF5% (5 à 10%)
Antibiotique (pénicilline +
streptomycine)Pénicilline: 10 000U/mlStreptomycine: 10 000µg/ml20 U/ml
300 mg/L
glutamine (accessoire pour DMEM)200 mmol/L300mg/mL (Mglutamine = 146g/mol)Calculer les volumes de SVF, d'antibiotiques et de glutamine à ajouter pour obtenir les concentrations
voulues.2. Protocole du repiquage d'une lignée cellulaire
Toutes ces opérations auront lieu sous hotte à flux laminaire, mise à part la numération, en respectant
les conditions de " bonnes » manipulations.1) Observation des cellules au microscope inversé
-Observer l'aspect des cellules au microscope inversé.Fanny Demay - BTS BioAnalyses & Contrôles1/2
-Distinguer cellules mortes et cellules vivantes. -Vérifier que le tapis cellulaire est uniforme et confluent. -Noter la couleur du milieu.2) Lavage du tapis cellulaire
-Éliminer le milieu par retournement (ou par tout autre moyen respectant les règles d'asepsie).
-Laver le tapis cellulaire en introduisant 5mL de PBS sans Ca2+ (ou 2mL de trypsine 0,25% + EDTA pour les cellules difficiles à décoller).-Agiter doucement la boite pendant 30sec et éliminer tout le liquide à l'aide d'une pipette Pasteur.
3) Trypsination
-Introduire 1,5 à 2mL de trypsine 0,25% + EDTA. -Bien répartir sur tout le tapis cellulaire. -Laisser agir à l'étuve.-Examiner la bouteille toutes les 1 à 2 minutes à l'oeil nu et au microscope inversé pour surveiller
le décollement du tapis cellulaire du support et l'individualisation des cellules qui deviennent rondes. -Si besoin, aider le décollement en tapant sur la boite.-Dès que décollement et individualisation se sont produits, arrêter l'action de la trypsine.
4) Arrêt de la trypsination
-Introduire 3mL de milieu de culture complété (l'action de la trypsine est stoppée par le SVF).
-Disperser soigneusement les cellules par aspiration et refoulement à la pipette.-A chaque refoulement, envoyer le liquide sur le fond de la bouteille pour finir le décollement des
cellules.5) Numération
-Prélever 0,4mL de suspension cellulaire dans un tube à hémolyse stérile afin de réaliser une
numération en présence de 0,1mL de bleu Trypan (concentration finale: 0,2%) en cellule deMalassez.
6) Mise en culture dans de nouvelles boites
-Calculer le volume de suspension cellulaire et le volume de milieu à introduire dans chaquebouteille de sorte que les cellules en culture sont placées à une densité finale d'environ 4.104
cellules par cm de; surface (bouteille de 25cm2 de surface contenant 10 ml de milieu). -Ajouter du milieu de culture complété à qsp 10 mL.-Placer les bouteilles à l'étuve à 37°C et à 5% CO2. Dévisser d'un quart de tour les bouchons.