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DETERMINATION DES ACTIVITES GLYCOSIDASES
MANS LNS PRNPARATIONS NNRYÓATIQUNS
(Oeno 5/2007H OIV-Oeno 489-2012H OIV-Oeno 451-2012)
Introduction
Les enzymes de type glycosidases sont utilisées pour la révélation des arômeV TeV vinV à parWir Te leurV précurVeurV glycoVyléV. pas réellement opérante si le glucose est lui-même lié à un auWre Vucre (ce Afin Te meVurer la réelle efficaciWé Te la préparaWion enYymaWique pour révéler le poWenWiel aromaWique Tu raiVin ou Tu vinH il convienW Te compléWer apiofuranoViTaVeH arabinofuranoViTaVeH ß-M-galacWoViTaVeH rUamnoViTaVeH xyloViTaVe.
LNS PRNPARATIONS NNRYÓATIQUNS
(acWiviWé -M-glucoViTaVe) (NC 3.2.1.21 ± CAS n° 9001-22-3)
Spécifications générales
doivent être conformes à la résolution OENO 365-2009 relaWive aux VpécificaWionV généraleV TeV préparaWionV enYymaWiqueV qui figure TanV le
FRGH[ ¯QRORJLTXH HQPHUQMPLRQMOB
1. Origine
fermentation » Te la monograpUie générale Vur leV préparaWionV enYymaWiqueV.
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2 LeV préparaWionV enYymaWiqueV conWenanW ceV acWiviWéV VonW proTuiWeV par
5pIpUHQŃH HVP IMLPH MX FRGH HQPHUQMPLRQMO GHV 3UMPLTXHV ¯QRORJLTXHV 2HQR
16/04 et 17/04.
LeV enYymeV Tu Wype glucoViTaVe VonW uWiliVéeV pour révéler eW reUauVVer leV ajoutées avant la fin de la fermentation alcoolique, mais ne deviendront
3. Principe
incoloreH libère Tu glucoVe eW Tu para-NiWropUenol (p-Np) ; ce Ternier prenT une coloraWion jaune en préVence Te carbonaWe Te VoTium TonW on meVure
4. Appareillage
4.1 agitateur magnétique
4.4 cuves de 1 cm de parcours optique, à usage unique, pour
VpecWropUoWomèWreH pour meVure TanV le viVible
4.5 glace pilée
4.6 seringue de précision 500 ± 5000 µL
4.7 seringue de précision 100 µL
4.8 seringue de précision 1000 µL
4.9 spectrophotomètre
4.10 tubes eppendorf
4.11 fiole jaugée de 100 mL
4.12 pH mètre
4.13 chambre froide à 4°C
4.14 portoir métallique pour tubes eppendorf
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4.15 coton cardé
4.16 papier Kraft
4.17 agitateur de type vortex
4.18 chronomèWre
4.19 tubes en verre de 15 mL
5. ProTuiWV
5.1 Carbonate de sodium (Na2CO3 pur à 99H5% - PÓ J 105H99 gImole)
5.2 AcéWaWe Te VoTium (CH3COONa pur à 99% - PÓ J 82gImole)
5.3 AciTe acéWique (CH3COOH pur à 96% - PÓ J 60gImole)
5.4 -M-GlucopyranoViTe Te p-niWropUényle (ŃlukaH réf. 73676) à WiWre
5.5 -M-glucoViTaVe (Ńluka ; 250 mg ; 6H3 UImgH réf. 49290) à WiWre
libérer 1 mole de glucose par minute à pH 5 et 35 °C.
5.6 p-niWropUénol (p-Np) (C6H5NO3 pur à 99H5% - PÓ J 139H11 gImole)
5.7 Nau TiVWillée
5.8 PréparaWion enYymaWique commerciale à analyVer
6. SoluWionV
6.1 Tampon acéWaWe Te VoTium (100 mÓH pH 4H2)
distillée (5.7)
6.1.3 PréparaWion Tu Wampon acéWaWe Te VoTium J Óélanger 47H8 mL Te
ConVerver à 4°C
6.2 SoluWion Te -M-GlucopyranoViTe Te p-niWropUényle 4mÓ
ÓeWWre 0H096 g Te -M-GlucopyranoViTe Te p-niWropUényle (5.4) TanV 80 mL
Te Wampon acéWaWe Te VoTium (6.1.).
6.3 SoluWion Te carbonaWe Te VoTium 1Ó
(5.7) dans une fiole jaugée de 100 mL (4.11). La solution peut être stockée
à 4°C (4.13).
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6.4 SoluWion mère Te p-niWropUénol (p-Np) à 125 g/mL
La solution mère doit être préparée extemporanément.
7. PréparaWion Te la gamme éWalon Te p-niWropUénol (p-Np) Te 0 à
50 µgImL
Elle est constituée à partir de la solution mère de p-niWropUénol (p-Np) (6.4.) comme inTiqué TanV le Wableau 1. Tableau 1 J Gamme éWalon Te para-NiWropUénol
Quantité de p-NP (µg) 0 2 4 6 8 10
Concentration en p-NP (µg/mL) 0 10 20 30 40 50
Concentration en p-NP
(µmol/mL)
0 0,072 0,14 0,22 0,29 0,36
Volume de solution mère (6.4)
(µL)
0 16 32 48 64 80
Eau distillée (5.7) (µL) 200 184 168 152 136 120 blancV TevronW êWre préparéV exWemporanémenW.
8.1 SoluWion enYymaWique à 10 gIl
Placer 1 g Te préparaWion commerciale (5.8) TanV une fiole jaugée Te 100 un mélange Uomogène. Placer 10 mL Te la VoluWion enYymaWique à 10 gIl (8.1) TanV un Wube Te 15 mL (4.19)H boucUer avec Tu coWon carTé (4.15) recouverW Te papier OrafW (4.16) eW plonger le Wube TuranW 5 minuWeV TanV le bain TGeau à 100°C (4.3).
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9. ÓoTe opéraWoire
9.1 RéacWion enYymaWique J LeV WubeV VonW réaliVéV en Touble au minimum.
ManV 5 WubeV eppenTorf (4.10) numéroWéV Te 1 à 5H placéV TanV un porWoir (4.14) TanV Te la glace pilée (4.5) inWroTuire
100 µL Te la VoluWion Te -M-GlucopyranoViTe Te p-niWropUényle (6.2)H à
100 µL Te la VoluWion enYymaWique à 2 gIl (8.1)H enclencUer le cUronomèWre
(4.18)
30 °C (4.2)
TuranW 1 mn pour le Wube n°1
TuranW 2 mn pour le Wube n°2
TuranW 5 mn pour le Wube n°3
TuranW 10 mn pour le Wube n°4
TuranW 15 mn pour le Wube n°5
La réacWion eVW VWoppée en plaçanW cUacun TeV WubeV numéroWéV Te 1 à 5 imméTiaWemenW aprèV quGilV aienW éWé enlevéV Tu bain TGeau à 30°CH TanV un bain Te glace pilée (4.5)
9.2 MoVage Tu p-niWropUénol libéré
A parWir TeV WubeV eppenTorf conWenanW leV TifférenWV milieux réacWionnelV (9.1) seringue de précision (4.8), Placer le mélange réVulWanW TanV une cuve (4.4). (4.9) Opérer comme TécriW en 9.1 en remplaçanW la VoluWion enYymaWique à 2 gIl réaction enzymatique des blancs en même temps que celle de la solution enYymaWique.
9.4 Gamme éWalon
Opérer comme TécriW en 9.2 en remplaçanW le milieu réacWionnel (9.1) par leV TifférenWV milieux Te la gamme éWalon Te p-niWropUénol Te 0 à 50 µgImL (7).
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10. CalculV
situe alors dans la phase ascendante de la représentation cinétique J Figure 1 J CinéWique Te réacWion enYymaWique T=1 min T=2 min, T=4 min, T=6 min T=8 min T=10 min, T=12 min. AprèV avoir réaliVé la cinéWique Te réacWion enYymaWiqueH éWablir la courbe Te enzymatique et du blanc correspondant. PuiV calculer lGéquaWion (1) Te la TroiWe Te régreVVion en ne prenanW en compWe que leV poinWV Te la pUaVe aVcenTanWe (voir figure 1). cinétique de réaction enzymatique 0 0H1 0H2 0H3 0H4 0H5 0H6 0H7
02468101214
temps (min) absorbancephase ascendante plateau
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7 pour abscisse les différenWeV concenWraWionV Te la gamme éWalon Te p.niWropUénol (Te 0 à 0H36 µmoleImL) eW en orTonnée leV valeurV Te TenViWéV opWiqueV correVponTanWeVH obWenueV en 9.4. Calculer enVuiWe la penWe (QIT) Te la TroiWe Te régreVVion (2) réVulWanW Te la linéariWé TeV TonnéeV Tu grapUique. A parWir Te la TroiWe Te régreVVion (1) calculer lGabVorbance pour un WempV moyen T (par exemple 4 mn pour le caV Te la figure 1) en TéTuire la quanWiWé Q Te p-niWropUénol libéré (en µmoleV) pour ce WempV inWerméTiaire
à lGaiTe Te lGéquaWion (2).
suivante J
AcWiviWé en UIg =
CVTQ1000u
Avec Q J quanWiWé Te p.niWropUénol formé en µmoleV penTanW un WempV T (min) V J quanWiWé Te VoluWion enYymaWique inWroTuiWe (mL) ici 0H1 mL C J concenWraWion Te la VoluWion enYymaWique (gIl) ici 2 gIl unité correspond au nombre Te nanomoleV Te proTuiW formé par VeconTe TanV leV conTiWionV TéfinieV par leV proWocoleV Te ToVageV eW Tonc J AcWiviWé en nkaWIg = (acWiviWé en U Ig) *(1000I60)
11. CaracWériVWiqueV
La répétabilité de la méthode est estimée par le biais de la moyenne TeV préparation enzymatique, dosé 5 fois. Ainsi, pour le dosage de la -M- GlucoViTaVe la moyenne TeV écarWV-WypeV TeV valeurV eVW Te 0H01 avec un
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8 (moyenne des écarts-WypeV TeV valeurV x 100) moyenne TeV valeurV TeV eVVaiV Ainsi, la méthode de dosage telle que présentée est jugée répéWable. Il a éWé uWiliVé 2 WeVWV qui onW permiV Te TéWerminer la bonne reproTucWibiliWé
Te la méWUoTe J
riVque Te première eVpèce eVW le riVque Te TéciTer que TeV WraiWemenWV effecWivemenW iTenWiqueV VonW TifférenWV. avions les moyenV Te la voir.
LeV réVulWaWV VonW TonnéV au Wableau 2.
Dosages Hypothèses
de variance
Probabilité Puissance
( = 5%) Test
Newman-
Keuls (*)
Test
Bonferroni
-D- glucosidase
Respectées 0,0285 42% Non
significatif Non significatif * TeVW Newmann-OeulV J ce WeVW Te comparaiVon Te moyenneV permeW Te conVWiWuer TeV groupeV UomogèneV Te WraiWemenWV J ceux apparWenanW à un même groupe VonW conViTéréV comme non TifférenWV au riVque Te première eVpèce cUoiVi
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9 ** Test de Bonferroni J auVVi appelé " WeVW Tu W corrigé »H le WeVW Te riVque Te première eVpèce cUoiVi. groupe (Test Newmann-OeulV non VignificaWif) eW conViTérée comme non
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DETERMINATION MN MIVNRSNS ACTIVITNS GLUCOSIMASN
MANS LNS PRNPARATIONS NNRYÓATIQUNS
ǃ-M-galacWoViTaVe (NC 3.2.1.23 ± CAS n° 9031-11-2) -L-arabinofuranoViTaVe (NC 3.2.1.55 ± CAS n° 9067-74-7) -L-rUamnoViTaVe (NC 3.2.1.40 ± CAS n° 37288-35-0) ǃ-M-xyloViTaVe (NC 3.2.1.37 ± CAS n° 9025-53-0)
SpécificaWionV généraleV
CeV acWiviWéV enYymaWiqueVVonW généralemenW préVenWeV parmi indicaWion conWraireH leV VpécificaWionV ToivenW êWre conformeV à la réVoluWion Oeno 365-2009 relaWive aux VpécificaWionV généraleV TeV préparaWionV enYymaWiqueV qui figure GMQV OH FRGH[ ¯QRORJLTXH
International.
1. Origine
milieux de fermentation » Te la monograpUie générale Vur leV préparaWionV enYymaWiqueV. LeV préparaWionV enYymaWiqueV conWenanW ceV acWiviWéV VonW exemple. Référence est faite au Code international des pratiques
°QRORJLTXHV OENO 16I04 eW 17I04.
LeV acWiviWéV glycoViTaVeV VonW uWiliVéeV pour révéler eW reUauVVer leV osidiqueTe leurV précurVeurV glycolyVéV. LeV enYymeV peuvenW égalemenW êWre ajouWéeV au moûWH maiV leurV efficienceV finaliVaWion Te la fermenWaWion alcoolique.
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3. Principe
Les préparations enzymatiques du commerce à activité xylose- permeWWanW enVuiWe la libéraWion TeV compoVéV aromaWiqueV ces enzymes peuvent hydrolyser la liaison de composés de VynWUèVe conVWiWuéV Te ceV TifférenWV compoVéV oViTiqueV eW Te p- nitrophénol. Ceci permet de mesurer ces différentes activités. HQ]\PDWLTXH GX quotesdbs_dbs29.pdfusesText_35
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