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diIntro d uct i onauPCRen temps réel temps réel

ParPhilipe Lampron,M.Sc.

Résumé

Fondements

duPCRentemps réel qPCR

Fondements

du PCR en temps réel qPCR

Théorie duPCRentempsréel

Typesdechimies

Méthode dequantification

d él

Acquisition

d er su l tats optimaux

Designexpérimental

Optimisation

etvalidation

Optimisation

et validation

Qu'est que lePCRentempsréel?

Détection

de l amplification d un produit basée sur la

Détection

de lamplification dun produit basée sur la fluorescence durant une réaction de PCR Mesure la quantité initial d'un acide nucléique en déterminant le nombre de cycle requis pour atteindre un niveau déterminé de produit Le PCR traditionnel (end point) est utilisé pour amplifierl ADN et l analyse au point terminal de la réaction sera lADN et lanalyse au point terminal de la réaction sera utilisée pour distinguer des produits.

PCR:Theorie vs.Realité

L'augmentation exponentielle du

produit est limitée;L'atteinte d'unplateauest incontournable

Augmentation

théorique e

LePCRtraditionnel (endpoint)

n'est pasapproprié pourla tifi ti

Realité

gADNCible quan tifi ca ti on

LePCRentempsréel permet laquantification

durant laphase Log quantification durant la phase exponentielle del'amplification #Cycle Analyse desdonnées:Ajuster leseuil deréférence

Le seuil de référence (threshold line) est une valeur de fluorescence à laquelle lescourbes sont comparées

Règlé empiriquement ou par un calcul statistique au dessus du background (méthode de la dérivée seconde)

Analyse desdonnées:Déterminer leCp

(crossingpoint) •Le Cp = nombre de cycles requis pour qu'une réaction defluorescence atteigne le seuil de référence T fluorescence atteigne le seuil de référence T •Corrèle fortement avec le nombre de copie de départ 10 8 10 6 10 2 10 4 T

Analyse desdonnées:Déterminer leCp

(crossingpoint) LeCpest linéaire aveclelogdunombre decopie initiale Lapente delacourbe standardpeut être directement corrélée àl'efficacité delaréaction :

Efficiency()=[10

(Ͳ1/slope) ]-1 L l t

332Effi i100%

L orsque l apen t e=Ͳ 3 32
Effi c i ency= 100%

Typesdequantification

Absolue

Détermine

une quantité initiale d un acide

Détermine

une quantité initiale dun acide nucléique cible

Requiert une courbe standard

14500 copies

Relative

Détermine

la différence (en nombre de 2.5 14500
copies

Détermine

la différence (en nombre de fois)d'une quantité initiale d'acides nucléiques entrelesdifférents échantillons

Performée avecou sanscourbe standard

11.52

Utilisée pourl'analyse del'expression de

gènes avecungène cible normalisé parun gène deréférence 00.5

Normal Treatment A Treatment B

Quantificationabsolue

10 8 10 6 10 2 10 4 TT

Quantificationabsolue

Quantificationabsolue

10 8 10 6 10 2 10 4 T

Quantificationabsolue

10 5 copies/puit

Quantificationrelative

Avec courbe standard Avec courbe standard Quantités utilisées pourmesurer ladifférence (ennombre defois)d'unacide nucléique cible etd'unacide nucléiqueréférence Ratiodugène cible sur gène deréférence utilisé pournormalisernormaliser

Aveclaméthode comparativedeLivak (2

ͲCtou Cp

Ct ou Cp est utilisé pour mesurer la différence en quantité Ct ou Cp est utilisé pour mesurer la différence en quantité d'unacide nucléique cible entrelesdifférents échantillons

Quantificationrelative

Quantificationrelative

Ctl Cp = 21.3 = 1.5ng / tube 1

A Cp = 22.8 = 0.5ng / tube 0.33

B Cp = 19.3 = 6.0ng / tube 4

T

Quantificationrelative:Résultats

7

Expression

56

Expression

normalisée

234012

Considérations enquantificationrelative

L expression des gènes de référence doit

être

Lexpression

des gènes de référence doit

être

constante entrelesdifférents échantillons Efficacité deréaction delacible etdelaréférencedoivent

être

calculée doivent

être

calculée

Méthode quirequiert une validation

Leschimies enPCRentempsréelé

lfl Bas es sur l a fl uorescence Aprèsl'absorbance decertaines longueurs d'ondes delalumière( excitation ),le fluorophore

émet

dela lumière une longueur excitation le fluorophore

émet

de la lumière une longueur d'onde plusgrande (émission) Lafluorescenceest proportionnelle auproduit amplifié

2chimies couramment utilisées:

SYBR GI SYBR G reen I

Sondes TaqMan

Chimie SYBRGreenI

Avantages

L'expérience nerequiert que desamorces

Analyse decourbe demeltingpostͲamplification

Dé t

Dé savan t ages Potentiel decontributionàlafluorescenceprovenant deproduits non spécifiques primer r dimers produits non spécifiques primer r dimers

Pasdemultiplexpossible

SYBRGreenI

LafluorescenceenSYBRGreenI(SGI)

l l' dbl b augmente l orsque l' AND d ou bl e b rin est produit

Lorsque l'ADNdb s'accumule aucoursdela

réaction plusdeSGIselieà O O O O de la réaction plus de SGI se lie l'ADN etlafluorescenceaugmente

Progression

Reaction

PCR O O O O O O O O O O O Oquotesdbs_dbs5.pdfusesText_9