[PDF] [PDF] THÈSE DE DOCTORAT Dr Sirio DUPONT Professeur Associé

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Le rôle de la mécanotransduction dans la

progression, la plasticité et la résistance thérapeutique du mélanome

Margaux LECACHEUR

Centre méditerranéen de médecine moléculaire (C3M), INSERM du grade de docteur en Science de la Vie et de la Santé

Mention : Interaction Moléculaires et

Cellulaires

D

Dirigée par : Sophie TARTARE-DECKERT

Co-encadrée par : Christophe GIRARD

Soutenue le : 10 Décembre 2021

Devant le jury, composé de :

Dr Frédéric BOST, DR CNRS,

Université Côte

Dr Sirio DUPONT, Professeur Associé, HDR,

Université de Padoue

Dr Christophe GIRARD, CR CNRS,

Dr Julie GUILLERMET-GUIBERT, DR INSERM,

Université Paul Sabatier

Dr Lionel LARUE, DR INSERM,

Université Paris

-Saclay

Dr Sophie TARTARE-DECKERT, DR INSERM,

Université Côte

THÈSE DE DOCTORAT

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Le rôle de la mécanotransduction dans la

progression, la plasticité et la résistance thérapeutique du mélanome

COMPOSITION DU JURY :

Président du jury :

Dr Fréderic BOST, Directeur de Recherche CNRS, Centre Méditerranéen de

Rapportrice :

Dr Julie GUILLERMET-GUIBERT, Directrice de Recherche INSERM, Centre de Recherches en Cancérologie de Toulouse (CRCT), Université Paul Sabatier,

Toulouse III, Toulouse, France.

Rapporteur :

Dr Lionel LARUE, Directeur de Recherche INSERM, Institut Curie, Université

Paris-Saclay, Paris, France.

Examinateurs :

Dr Sirio DUPONT, Professeur Associé, HDR, Département de Médecine Moléculaire, Université de Padoue, Padoue, Italie Dr Christophe GIRARD, Chargé de Recherche CNRS Centre Méditerranéen de

Directrice de thèse :

Dr Sophie TARTARE-DECKERT, Directeur de Recherche INSERM, Centre

France

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RÉSUMÉ

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Le mélanome est le cancer cutané le plus agressif à cause de son importante

hétérogénéité, son fort potentiel métastatique et sa résistance thérapeutique. Malgré les

thérapies actuelles (thérapies ciblant la voie BRAF/MEK et immunothérapies), de nombreux p -tumorale et la plasticité des cellules de mélanomes

participent à la résistance thérapeutique. La plasticité des cellules de mélanome

correspond à leur capacité à osciller entre différents phénotypes cellulaires, du plus

différencié, exprimant le marqueur mélanocytaire MITF, au plus dédifférencié, créant

cib

La capacité des cellules cancéreuses à disséminer et à résister aux traitements

repose sur leur pouvo cellule cancéreuse interagit avec un environnement complexe composé de cellules stromales et de la matrice extracellulaire (MEC). La MEC, principalement produite par les fibroblastes, est un réseau dynamique en constant remodelage ayant des propriétés physico-

mécanotransduction. Plusieurs études ont montré le rôle de la rigidité de la MEC dans la

rigidité matricielle et le rôle de la mécanotransduction dans la biologie des mélanomes sont peu connus. Mon projet de thèse a consisté à étudier l'influence des modifications de la rigidité

matricielle tumorale dans la progression, la plasticité cellulaire et la résistance des

mélanomes aux thérapies ciblées. es thérapies ciblant la voie BRAF/MEK stimulent in vitro et in vivo la production et l'assemblage, par les cellules de mélanome,

d'une MEC riche en collagène qui contribue à une rigidification de la tumeur et à

l'échappement thérapeutique. Dans un deuxième cellules de mélanome aux changements de rigidité de la MEC, rencontrés par la cellule tumorale au cours de sa progression métastatique et en réponse aux thérapies ciblées. mélanome qui présentent un phénotype

dédifférencié mésenchymateux développent une mécano-addiction se traduisant par une

augmentation de leur prolifération, de leur migration/invasion et de leur résistance thérapeutique sur un support rigide. De façon inté aux collagènes à domaine discoïdine DDR1 et DDR2 comme responsables de ce mécano- -senseur transcriptionnel YAP. Ces travaux de thèse ont permis de montrer le rôle des DDR dans la

mécanotransduction et la progression du mélanome et dévoiler une nouvelle vulnérabilité

des cellules tumorales dédifférenciées. A terme, ils pourraient conduire au développement

de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant le dialogue entre le mélanome et son

microenvironnement matriciel.

Mots clés : Mélanome cutané, Mécanostransduction, Résistance thérapeutique, YAP, DDR

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ABSTRACT

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Melanoma is the most aggressive and deadliest form of skin cancer due to its heterogeneity, high metastatic potential, and therapeutic resistance. Despite existing therapies, including targeted therapies against the BRAF/MEK pathway or immunotherapies, patients may still undergo therapeutic failure. This occurs in part due to the onset of resistance to therapies. Melanoma intra-tumoral heterogeneity and melanoma cell plasticity contribute to therapeutic resistance. Melanoma cell plasticity is the ability of cells to switch between different cell phenotypes. For example, melanoma cells can switch from a differentiated state, where they express the melanocytic marker MITF, to a more dedifferentiated state, thereby creating tumor heterogeneity. This cell plasticity can be induced by targeted therapies. In this context, the acquisition of a dedifferentiated mesenchymal phenotype has also been described as an escape mechanism in response to therapies. The ability of cells to disseminate and to resist treatment is based on their ability to adapt to their microenvironment. Within the tumor, tumor cells interact with a complex environment composed of stromal cells and extracellular matrix (ECM). The ECM, mainly produced by fibroblasts, is a dynamic web that is constantly remodeled and its physiochemical properties can influence tumor architecture. Tumor cells can sense the tension from the ECM and respond to it by a process called mechanotransduction. Previous studies have shown the role of ECM stiffening in the progression and therapeutic resistance of several solid cancers. However, the role of ECM stiffening and the role of mechanotransduction in melanoma is not fully understood. My thesis project investigated the influence of ECM stiffening modifications on melanoma progression, plasticity and resistance to targeted therapies. In the first part of my thesis, results showed that targeted therapies against the BRAF/MEK pathway stimulate in vitro and in vivo melanoma cells to produce and assemble a collagen rich ECM that contributes to tumor stiffening and therapeutic escape. In the second part of my thesis, we analyzed melanoma cell response to substrate stiffness modifications, which melanoma cells might encounter during disease progression and in response to targeted therapies. We demonstrated that melanoma cells harboring a differentiated mesenchymal-like phenotype are more sensitive to changes in ECM stiffness, as depicted by an increase in their proliferation, migration/invasion and resistance to therapy on a stiff substrate. Interestingly, we identified that the collagen receptors DDR1 and DDR2 are responsible for this mechanophenotype, through the activation of the mechanosensory protein YAP, which was dependent on the actomyosin cytoskeleton. This work highlights the role of DDR in melanoma mechanotransduction and progression and unveils a novel weakness of dedifferentiated cells. This work could therefore lead to future developments of new therapeutic strategies that target the interaction between melanoma cells and their ECM microenvironment. Keywords : Skin melanoma, Mechanotransduction, Therapy resistance, DDR, YAP

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REMERCIEMENTS

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Pour commencer

Julie Guillermet-Guibert et Dr Lionel

Larue en tant que rapporteurs, au Dr Sirio Dupont

Frédéric Bost en qualité de président du jury, le Dr Christophe Girard comme encadrant de ma thèse et le Dr Sophie Tartare-Deckert comme directrice de ma thèse. Merci aux Dr Richard Tomasini et Dr Frédéric Luton

comités de suivi de thèse, pour les discussions très enrichissantes autour de mon

mais également pour aiguiller mon après-thèse.

Merci à Sophie aster 1

Merci pour ton implication et tes encouragements. Merci pour toutes les discussions la n ma carrière.

Merci à Christophe

us mes s collaborations projet. Comme tu me (voire même

bientôt 2 ኀኁኂ). Merci pour ton implication pour que ça puisse arriver. Merci pour tous

tes conseils et ton soutien au cours de mon master et de ma thèse pu en arriver là. Merci à Marcel pour les discussions scientifiques passionnées toujours riches en nouvelles hypothèses et idées .

Page | 8

Merci à Ilona

stage de Master 1. Je me souviens de la première f aussi ma première fois en culture. On peut dire que je ne pouvais pas avoir une professeur plus efficace pour apprendre les bonnes pratiques. Merci pour ta patience que tu reproduis parfaitement un geste même quand tu eau » et le tour pour venir faire du sport avec toi pour exemple en me donnant un jour des cellules que tu allais jeter et qui a fait démarrer histoires et de le faire encore maintenant. Avec tous les moments passés au labo et en dehors, je peux dire que tu es vraiment devenue une amie. Je te souhaite beaucoup de réussite pour ton post- retravailler ensemble. Merci à Serena pour ta passion pour la recherche, qui est très vite contagieuse à ton contact. Thank you a lot for exchanging your new hypothesis and listening to mine. Thank you for answering my scientific and non-scientific questions very late in the night. I really like laughing with you. Especially, when we worked together during our first mice experiment (maybe a little bit because of something else). Thank you for

sharing with me your passion with cats and many others ΦΧΨΩΪΫ. Thank you for the good

moments in the lab and also outside the lab. Thank you for your kindness and your support at any time and hour of the day. I wish you all the best for your post-doc and I hope we will stay in contact. Merci à Christopher, pour ton enthousiasme depuis nos stages de Master dans passion dans tous les domaines de la science, pas seulement la biologie, les FRC et YAP. Merci pour tous les échanges et les bons moments au labo et en dehors. Merci de découvrir la biologie et le mélanome aux enfants et à leurs parents. Je te souhaite bon courage pour la suite de ta carrière de jeune chercheur.

Page | 9

Merci à Alexandrine pour ton soutien et ton aide depuis ton arrivée en Master 2 ! Merci pour tous les moments de fou rire passés au labo. Merci pour les momen et soutenue dans les différents moments de ma thèse. rage, ta détermination et le fait que tu ne ménages pas tes efforts. Je pense que tu iras loin dans le monde la recherche et je te souhaite bon courage pour la continuation de ta thèse. et le partage de tes anecdotes marrantes pendant la culture. Je me souviens encore de

découvrir. Merci pour les discussions scientifiques sur nos sujets de thèse qui ont

quelques points communs. Je te souhaite bon courage pour la fin de la thèse, tu y es presque. Je te souhaite aussi bonne chance pour la suite après la thèse. Merci pour les concerts en culture (avec Alexandrine). Merci pour vos revisites des chansons impatience et je vous en remercie.

Merci à Océane

Merci Lauren pour tes organisations super carré pour les repas sushi de pleins de bonheur pour ton nouveau départ. Thank you Ana for your wise advices and for listening to me. Thank you for exchanging about my side project. Thank you for all the discussions about non- scientific topics, you always find a nice topic to discuss during lunchtime. Merci à Caroline pour ton soutien et je te souhaite bon courage pour la suite de ta thèse.

Merci à Fred

Merci à Mickael pour les discussions et les échanges scientifiques. Le fait que je sois plus au bu sympa.

Merci à Virginie

Page | 10

Merci éga

Merci à Marie et Maéva

passé beaucoup de temps à échanger sur des manips de microscopie ou les problèmes lerie pour leur aide pour les expériences. Merci à Stephan Clavel, Nathalie Mazure et Sandrine Marchetti pour votre aide et vos conseils quand également au personnel de la gestion (Philippe, Marie, Carole) et également au personnel de la laverie.

En dehors du C3M, merci à Sabrina Pisano

Merci également à Cédric Gaggioli

e monde des fibroblastes et de la culture en 3D. Merci pour les échanges et pour ton expertise. Merci à mes amis (Marie, Fabien, Fadia, Olivia, Elisa, Baptiste, Sol, Vincent, Miguel, Lou, Prune, Laya, Phoebe) pour votre immense soutien et les bons moments passés ensemble. Enfin, je remercie ma famille : ma maman, mon papa et mon frère Kilian pour moments de ma thèse et bien avant. Mille mercis !

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SOMMAIRE

Page | 12

RÉSUMÉ ................................................................................................................... 2

ABSTRACT ................................................................................................................ 4

REMERCIEMENTS .................................................................................................. 6

SOMMAIRE ............................................................................................................. 11

ABREVIATIONS ..................................................................................................... 15

TABLE DES ILLUSTRATIONS ............................................................................. 23

INTRODUCTION .................................................................................................... 26

Chapitre 1 : Le microenvironnement tumoral .................................................... 28 I. Les principaux constituants du microenvironnement tumoral ................ 30 A. ............................................... 30

a) Les cellules de la lignée lymphoïde ..................................................... 30

b) Les cellules de la lignée myéloïde ....................................................... 31

B. Les fibres nerveuses ............................................................................ 33

C. ............................................ 33 a) Les cellules souches mésenchymateuses ............................................ 33

b) Les cellules endothéliales .................................................................... 33

c) Les péricytes ........................................................................................ 34

d) Les fibroblastes .................................................................................... 34

D. Les composants non cellulaires du microenvironnement .................. 40 a) Les composants non matriciels ........................................................... 41 b) La matrice extracellulaire (MEC) ....................................................... 42

Chapitre 2 : La mécanotransduction ................................................................... 56

I. Définition et rôles physiologiques.............................................................. 56

II. Les différents types de forces ................................................................. 58

a) Forces hémodynamiques ..................................................................... 59 b) Forces de contact cellule-cellule .......................................................... 59 c) Forces appliquées par le support ........................................................ 59

III. Méthodes de mesure des forces .............................................................. 60

IV. ........................................... 61 a) Hydrogels de protéines matricielles .................................................... 61

b) Matrices dérivées de cellules ............................................................... 61

c) Hydrogels synthétiques ....................................................................... 62

V. Les principaux acteurs de la mécanotransduction ................................ 63 A. Les récepteurs extracellulaires impliquées dans la perception des signaux

mécaniques .................................................................................................... 64

a) Les intégrines ...................................................................................... 64

b) Les récepteurs à domaine discoïdine .................................................. 68

c) Autres récepteurs mécanosenseurs .................................................... 73 B. Les acteurs intracellulaires des voies de la mécanotransduction ..... 74 a) 74 b) Le noyau peut sentir les forces mécaniques et y répondre ................ 84 c) Les coactivateurs transcriptionnels YAP/TAZ ................................... 87 d) Le cofacteur transcriptionnel MRTF .................................................. 94 VI. Rôle de la rigidité de la MEC dans les cancers ...................................... 97 A. Effet sur la prolifération cellulaire ..................................................... 97 B. ........................................................... 97 C. Impact sur la modulation du système immunitaire ........................... 98

D. dissémination métastatique .......... 98

E. Impact sur la résistance thérapeutique .............................................. 99 VII. Ciblage des principaux acteurs de la mécanotransduction ................. 100

Page | 13

A. Ciblage de la MEC ............................................................................. 101

a) Inhibition de la transformation des fibroblastes en CAF ................ 101 b) Inhibition de la réticulation du collagène et de sa synthèse ............ 102 c) ............................................................... 103 B. Ciblage des voies de la mécanotransduction .................................... 103

a) Voie des intégrines/FAK .................................................................... 103

b) Voie des Récepteurs à Domaine Discoïdine ...................................... 104 c) Voie des Rho GTPase/ROCK ............................................................. 105

d) Voie YAP/TAZ .................................................................................... 106

e) Voie MRTF ......................................................................................... 107

Chapitre 3 : Le mélanome cutané ..................................................................... 108

I. La peau, un organe mécanosenseur ........................................................ 108 A. .......................................................................................... 109

B. Le derme ............................................................................................ 109

C. ....................................................................................... 110 II. Le mélanome et les voies de signalisation associées à sa progression 111

A. Généralités sur le mélanome............................................................. 111

B. Facteurs de risques ............................................................................ 113

a) Les facteurs intrinsèques .................................................................. 113

b) Les facteurs extrinsèques .................................................................. 113

C. Progression du mélanome ................................................................. 115 a) Transformation du mélanocyte en mélanome métastatique ........... 115 b) Mutations initiatrices de la mélanomagenèse .................................. 115 c) Voies de signalisation impliquées dans la progression du mélanome117 D. Hétérogénéité phénotypique et plasticité cellulaire du mélanome . 125 a) Le switch phénotypique ou la plasticité phénotypique .................... 126 b) Marqueurs et caractéristiques du switch phénotypique .................. 127 c) .................................. 130

III. Les traitements du mélanome .............................................................. 133

A. Thérapies ciblées ............................................................................... 134

a) Les inhibiteurs de BRAFV600 .......................................................... 134 b) La combothérapie : inhibiteurs de BRAFV600 + inhibiteurs de MEK136

B. Immunothérapies............................................................................... 137

a) Les anti-CTLA-4 ................................................................................ 138

b) Les anti-PD-1/PD-L1 ......................................................................... 138 C. Combinaison Immunothérapies + Thérapies ciblées ....................... 139 IV. Les mécanismes de résistance thérapeutique ..................................... 139 A. La résistance thérapeutique intrinsèque .......................................... 139

a) Résistance aux thérapies ciblées ....................................................... 140

b) Résistance aux immunothérapies ..................................................... 145 c) Cross-résistance aux thérapies ciblées et immunothérapies ........... 147

B. La résistance extrinsèque .................................................................. 148

a) Résistance conférée par les facteurs solubles ................................... 148 b) ................................................. 150 C. Cibler le switch phénotypique pour améliorer la réponse thérapeutique 152

OBJECTIFS DE RECHERCHE ........................................................................... 153

RÉSULTATS ......................................................................................................... 156

Article 1 : A feed-forward mechanosignaling loop confers resistance to therapies targeting the MAPK pathway in BRAF mutant melanoma ............................ 157

Page | 14

Article 2 : Mechanical activation of the collagen receptors DDR1 and DDR2 promotes mesenchymal-like melanoma cells aggressiveness through

actomyosin/YAP pathway .................................................................................. 180

I. Contexte .................................................................................................... 180

II. Matériels et Méthodes .......................................................................... 181

III. Résultats ................................................................................................ 187

IV. Figures ................................................................................................... 192

DISCUSSION ........................................................................................................ 213

I. Les cellules de phénotype dédifférencié sont les plus sensibles aux changements de rigidité du microenvironnement tumoral ........................... 214 II. La rigidification du stroma tumoral rend les cellules de mélanome de

phénotype dédifférencié plus agressives ........................................................ 217

III.

mélanome de phénotype dédifférencié ........................................................... 220

CONCLUSION ...................................................................................................... 222

PERSPECTIVES ................................................................................................... 225

BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................. 233

ANNEXES ............................................................................................................. 282

Annexe I : Matrix Stiffening and EGFR Cooperate to Promote the Collective

Invasion of Cancer Cells .................................................................................... 283

Annexe II : Targeting DDR1 and DDR2 overcomes matrix-mediated melanoma cell

adaptation to BRAF-targeted therapy .............................................................. 299

Annexe III : The profibrotic miR-143/145 cluster promotes mesenchymal phenotypic plasticity associated with resistance to targeted therapies in melanoma ....... 327 Annexe IV : Invasive dedifferentiated melanoma cells inhibit JAK1-STAT3-driven actomyosin contractility of human fibroblastic reticular cells of the lymph node351

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ABREVIATIONS

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A

ABP : actin-binding protein

ADN : acide désoxyribonucléique

ADP : adénosine diphosphate

AFM : microscopie à force atomique

AMM : autorisation de mise sur le marché

ARN : acide ribonucléique

ǂ-SMA : ǂ-smooth muscle actin

ATP : adenosine triphosphate

B

Breg : lymphocyte B régulateur

C

CAF : cancer associated fibroblast

CAM-DR : cell adhesion mediated drug resistance

CAV1 : cavéoline 1

CCL : chemokine C-C motif ligand

CDK : cyclin dependant kinase

CDM : cell-derived matrix

CP4H : prolyl-4-hydroxylase

CSM : cellule souche mésenchymateuse

CXCL1 : C-X-C motif chemokine ligand 1

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D

DC : dendritic cell

DDR : discoidin domain receptor

DPEN : diphényléthylènediamine

DUB : déubiquitinase

E

EDNRB : endothelin receptor type B

EGF : epidermal growth factor

EGFR : epidermal growth factor receptor

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