[PDF] Expression et fonction du récepteur antigénique B membranaire sur

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UNIVERSITE TOULOUSE III - PAUL SABATIER

Ecole Doctorale Biologie-Santé-Biotechnologies

THESE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L"UNIVERSITE TOULOUSE III

Discipline : Biophysique

présentée et soutenue le 20 Juillet 2007 par

Aude SAULIERE

Titre :

ETAPES MEMBRANAIRES DE LA TRANSDUCTION DU SIGNAL PAR LES

RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G

ORGANISATION DYNAMIQUE DU RECEPTEUR μ AUX OPIOIDES HUMAINS A

LA SURFACE DE NEUROBLASTOMES

Directeur de thèse :

Laurence SALOME

Dominique MASSOTTE (Rapporteur)

Didier MARGUET (Rapporteur)

Jean-Philippe PIN (Examinateur)

Laurent MAVEYRAUD (Examinateur)

UNIVERSITE TOULOUSE III - PAUL SABATIER

Ecole Doctorale Biologie-Santé-Biotechnologies

THESE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L"UNIVERSITE TOULOUSE III

Discipline : Biophysique

présentée et soutenue le 20 Juillet 2007 par

Aude SAULIERE

Titre :

ETAPES MEMBRANAIRES DE LA TRANSDUCTION DU SIGNAL PAR LES

RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G

ORGANISATION DYNAMIQUE DU RECEPTEUR µ AUX OPIOIDES HUMAINS A

LA SURFACE DE NEUROBLASTOMES

Directeur de thèse :

Laurence SALOME

Dominique MASSOTTE (Rapporteur)

Didier MARGUET (Rapporteur)

Jean-Philippe PIN (Examinateur)

Laurent MAVEYRAUD (Examinateur)

à Lolo,

Trop tôt décédée pour voir cette thèse,

à Ghislain,

Venu de si loin.

REMERCIEMENTS

Je souhaite tout d"abord remercier le jury qui a accepté de juger et de corriger mon travail, de plus avec une soutenance durant la période estivale ! Je remercie André Lopez de m"avoir accueillie dans son équipe, et particulièrement pour l"attention qu"il accorde aux questions qu"on lui pose. Je remercie également Laurence

Salomé pour la liberté qu"elle m"a laissée dans ce travail, pour l"écoute dont elle a fait preuve

dans les moments difficiles, et pour son soutien constant. Merci également d"avoir décalé autant que possible nos réunions l"après-midi .... Arrivée à ce stade je ne peux que citer Laurence Cézanne, plus connue sous le surnom de Lolo. Les remerciements ne sont malheureusement plus de mise mais je veux conserver

son souvenir vivace et lui garder dans ce travail toute la place à laquelle elle a droit. S"il est

vrai que les morts ne meurent vraiment que lorsqu"on les oublie, alors tu es encore là.

Les longues heures / journées / semaines passées aux A3 auraient été bien plus

difficiles sans Sergueï. Merci à lui sans qui le FRAP ne serait probablement pas en état de marche ! Je n"oublierai pas de sitôt les heures de tests de son programme ironiquement appelé

" EasyFrap ». Merci pour les macros, l"initiation à la programmation ... et les pauses café !

Les p"tites bêtes sur lesquelles j"ai travaillé durant ces quatre années ont été mises en

place par Claire Millot et Gérald Gaibelet, merci à eux. Un merci supplémentaire à Claire

pour m"avoir enseigné tout l"art de la culture cellulaire et pour les manips complémentaires qu"elle a réalisé.

Merci également aux " extérieurs » qui ont permis la réalisation de cette thèse :

Nicolas Destainville, pour les équations et les réflexions SPTesques ; Nacer Benmeradi pour

la microscopie électronique et l"intérêt qu"il a porté à mes questions ; et Jean-Louis Druilhe,

qui a remis les Peltiers en état de marche. Il ne faudrait pas oublier les stagiaires qui sont passées entre mes mains lors de ces

quatre années et qui ont permis l"avancée de ce travail : les deux Aurélie (Garcia et Sacareau)

ainsi que Stéphanie Favarel. Un merci tout particulier à Carolina Varela-Chavez qui a mis en

place le " décapage » des cellules, et, puisque je ne t"ai pas écœuré de la recherche, bonne

chance et bon courage pour ta thèse. Il n"y a pas que le travail dans la vie... je souhaite donc remercier Chantal pour ses rires et son vin (qui n"ont aucun rapport entre eux ...), sans oublier les discussions (longues,

longues, longues, ....) et café pris ensemble. Arrivent ensuite les collègues de thèse ... Noëlle

mon " mentor » alpha-Tien, Aurore, la réunionnaise de Poitiers (ou la poitevine de la

réunion ?), Aurélie, la plus Schtroumpfette et Laurent, le plus ... le plus quoi ?! Merci à lui

d"avoir accepter de partager son bureau avec moi, pour les coups de déprime et les crises de

rire. Une pensée particulière pour Aurélie, avec qui une amitié improbable, mais que j"espère

longue, s"est développée. Peut être un effet secondaire des journées passées dans le noir ?

Dans la famille thésard il reste la p"tite Chloé, les quelques mois qu"elle a passé ici m"ont déjà

permis d"apprécier son caractère ... et l"équation d"Einstein ! Un merci également aux autres membres de l"équipe, plus ou moins permanents :

Patrice, Fabrice, Catherine, Michèle, Evert ... Merci encore à Malika, toujours prête à

arranger au mieux nos déplacements, et aux services communs de l"IPBS. Trop nombreux pour être tous cités je voudrais remercier de manière globale les

membres actifs de l"association AlphaT. Une pensée particulière pour les trois vénérés

présidents sous lesquels j"ai exercé : Mag, Rami et Simon, ainsi qu"aux membres de la

com"colloque. Merci aux enseignants que j"ai pu côtoyer durant mes vacations et mes heures

d"ATER pour leur confiance et leur amitié, en particulier aux Auscitains Géraldine, Valérie,

Isabelle, Rémi, Robert (mon taxi préféré), Bruno, ... Je souhaite enfin remercier Geneviève Pratviel qui m"a fait découvrir et aimer la recherche. Est-il nécessaire de préciser que mes plus sincères remerciements et mes pensées les plus tendres vont à ma famille ? Pour faire court (et n"oublier personne) : merci à tous ceux qui ont supporté (dans tous les sens du terme) le Schtroumpf grognon que je suis pendant ces quatre années ! “Whatever we learn from models should be tempered by the fact that the cells are always right." (Edidin, 2003)

SOMMAIRE

Abréviations

Liste des figures

Avant propos

Chapitre I : Introduction :

Récepteurs couplés aux protéines G et membrane plasmique 1

1 - Les RCPG 3

1.1 - Structure

1.2 - Classification

5

1.3 - Le cycle de signalisation

6

1.3.1 - La fixation des ligands

1.3.2 - Les protéines G 8

® Le trimère

® Structure 9

® Cycle GDP / GTP 10

® Pré-couplage avec le récepteur 11

1.3.3 - Les effecteurs 12

1.3.4 - Internalisation consécutive à la fixation de l"agoniste

1.4 - Signalisation sans les protéines G 14

2 - Le récepteur µ dans la famille des récepteurs opioïdes

2.1 - Préambule

2.2 - Les différents membres de la famille

15

2.2.1 - Mu, delta et kappa (µ, d, k)

2.2.2 - Le cas particulier d"ORL1 16

2.3 - Les ligands opioïdes 17

2.4 - Les protéines G de liaison

18

2.5 - Effecteurs opioïdes et traitement chronique

19

2.6 - Système de signalisation sans les protéines G

20

2.7 - Dimérisation

2.7.1 - Au sein de la famille

2.7.2 - Avec d"autres récepteurs 21

3. La membrane plasmique 22

3.1 - Découverte de la membrane

3.1.1 - Ses constituants

3.1.2 - Ses rôles 25

3.1.3 - Les premiers modèles d"organisation membranaire

3.2 - Complexification des modèles : notions de domaines 26

3.2.1 - DRM ou raft

® Découverte

® Problèmes soulevés 27

® Rafts et dynamique 28

3.2.2 - De l"influence du cytosquelette cortical 29

3.2.3 - Interactions entre protéines 32

® Interactions directes

® Interactions à longue distance

3.3 - La mosaïque membranaire ... 34

4 - Organisation membranaire des RCPG 36

4 1 - Premiers modèles de rencontre des partenaires

4 2 - Analyse de la diffusion des RCPG

37

4.2.1 - A l"état basal

4.2.2 - Origine des diffusions observées 38

4.2.3 - Effets des ligands 40

5 - But de l"étude 41

Chapitre II : Techniques :

Principes et instrumentations des deux techniques utilisées pour l"étude de l"organisation membranaire du récepteur μ 43

1 - Le retour de fluorescence après photoblanchiment : FRAP 45

1.1 - Principe

1.2 - Le FRAP à rayon variable : FRAPrv

47

1.3 - Détermination des paramètres

1.3.1 - Analyse individuelle des retours de fluorescence

1.3.2 - Analyse par rayon 48

® La fraction mobile

® Le coefficient de diffusion 49

® Tailles relatives de la cellule, de la zone d"observation et des domaines 50 ® Erreur sur les paramètres 51

1.1.3 - Analyse à deux populations

1.4 - Montage et conditions d"expériences 52

1.4.1 - Montage

1.4.2 - Limites et contrôles afférents à la technique 54

1.4.3 - Extrapolation du point I

PB 55

1.4.4 - Analyse sur système modèle

2 - Le suivi de particule unique : SPT 56

2.1 - Principe

2.1.1 - Principe général

2.1.2 - Différents types de marquage des molécules d"intérêts

2.2 - Montage 57

2.2.1 - Le contraste de Nomarski

2.2.2 - Appareillage utilisé 58

2.2.3 - Détection des particules d"or 60

® En post-traitement 61

® En temps réel 62

2.3 - Les colloïdes d"or 63

2.3.1 - Concentration stabilisatrice

2.3.2 - Fonctionnalisation simple couche et problèmes rencontrés

2.3.3 - Problème relatif à la présence de vésicules 65

2.3.4 - fonctionnalisation double couche et résolution des problèmes 66

2.4 - Analyse des trajectoires

68

2.4.1 - Le déplacement quadratique moyen

® Calcul

® Le D

1-2 69

® Différents types de diffusion simples

2.4.2 -Détection des zones de confinements 71

® Algorithmes de Simson et Saxton

® Modification de l"algorithme 72

® Détection des sauts entre domaines 75

2.4.3 - Résolutions spatiale et temporelle 76

® Limites de résolution

® Critères de reconnaissances des colloïdes immobiles 77 Chapitre III : La lignée cellulaire SH-SY5Y surexprimant T7-EGFP-hMOR : pharmacologie du récepteur et caractéristiques des cellules 81

1 - La lignée cellulaire : les SH-SY5Y 83

1.1 - La lignée sauvage

1.2 - La lignée transfectée stable

84

2 - Tests de fonctionnalité 86

2.1 - Liaison des ligands

2.2 - Transmission du signal à l"adénylate cyclase

88

2.2.1 - Inhibition de l"adénylate cyclase

2.2.2 - Effet de la toxine pertussique

3 - Environnement lipidique

92

4 - Internalisation due aux ligands 95

4.1 - Littérature

4.2 - Résultats

96

5 - Le cytosquelette 97

6 - Fluorescence totale des cellules et survie cellulaire

99

7 - Le glycocalyx

100

8 - Présence du récepteur dans les DRMs ?

102

Chapitre IV :

Analyse par FRAPrv et SPT de la diffusion latérale de T7-EGFP-hMOR 105

1 - Analyse à l"état basal 107

1.1 - Organisation à température ambiante

1.1.1 - Analyse par FRAP à rayon variable

® Résultats

® Modèles d"organisation latérale 109

1.1.2 - Influence du glycocalyx 111

® Premiers résultats de SPT

® Effet du glycocalyx sur la diffusion de µ* observée par FRAPrv 112

1.1.3 - Analyse en SPT, après dégradation du glycocalyx 113

® Les différents modes de diffusion observés ® Les trajectoires confinées 116 ® Variations du coefficient de diffusion avec la taille des domaines 117 ® Comparaison des résultats en présence et en absence du glycocalyx 120

1.1.4 -Un modèle d"organisation pour le récepteur µ* à 22°C 121

1.2 - Effet de la modulation de la température 122

1.2.1 - Analyse par FRAPrv *

® Diminution de la température : analyse à 14°C ® Augmentation de la température : analyse à 37°C 123

1.2.2 - Analyse par SPT à 37°C 124

1.2.3 - Diffusion de sondes lipidiques, analyse par FRAPrv 127

® Résultats 128

® Comparaison avec la littérature 129

1.2.4 - Un modèle d"organisation pour le récepteur µ* à 37°C 130

1.3 - Influence du cytosquelette d"actine sur la diffusion de µ* 133

1.3.1 - Etude en fonction de la température par FRAPrv

1.3.2 - Etude à température ambiante par SPT 136

1.3.3 - Comparaison des résultats et modèle d"organisation 139

1.4 - Influence des protéines G sur la diffusion de µ* : étude en fonction

de la température par FRAPrv 140

1.4.1 - Dynamique des récepteurs µ* à 22°C

1.4.2 - Dynamique des récepteurs µ* à 14°C 141

1.4.3 - Dynamique des récepteurs µ* à 37°C 142

1.4.4 - Origine des domaines et modèle d"organisation 143

2 - Analyse par FRAPrv de la dynamique de µ* en présence de ligands

145

2.1 - Effet des antagonistes

2.2 - Effet des agonistes 146

2.2.1 - La morphine

® Effet de la morphine sur l"organisation de µ*

® Origine de ces domaines 148

® Modèle d"organisation des récepteurs µ* activés par la morphine 149

2.2.2 - Le DAMGO 150

® Effet du DAMGO sur l"organisation de µ*

® Analyse à deux populations et modèle d"organisation 152

® Origine de ces domaines 154

2.2.3 - Comparaison de l"effet des deux agonistes sur l"organisation

membranaire de µ* 155

Chapitre V : Conclusions et Perspectives

157

Références bibliographiques

167

Annexes

Matériel et méthodes 187

Articles 201

“Diffusion of the mu opioid receptor at the surface of human neuroblastoma SH-SY5Y cells is restricted to permeable domains." “Functional membrane diffusion of G-protein coupled receptors."

ABREVIATIONS

AR acide rétinoïque

AC adenylyl cyclase

ADN acide desoxyribonucléique

AMPc adenosine monophosphate cyclique

B max nombre total de site de liaison

BSA albumine de sérum bovin

CD cytochalasine D

CHO cellules d"ovaires de hamster chinois

CMH complexe majeur d"histocompatibilité

CTAP peptide D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr-NH 2

D coefficient de diffusion

d, DOR récepteur delta opioïde

DAMGO peptide [D-Ala

2,N-Me-Phe4,Gly-ol5]-enkephaline

DIC contraste différentiel interférentiel DMEM dulbecco"s modified eagle medium (cf. materiels et méthodes)

DO densité optique

DPN diprénorphine

DRM detergent resistant membrane

EGFP enhanced green fluorescent protein

FCS spectroscopie à corrélation de fluorescence GDP/GTP guanine diphosphate / guanine triphosphate

GM1 ganglioside

GPI (ancre) ancre glycosylphosphatidylinositol

GUV giant unilamellar vesicle

K d constante de dissociation K i constante d"inhibition k / KOR récepteur kappa opioïde

µ / MOR récepteur mu opioïde

µ* récepteur transfecté T7-EGFP-hMOR HEK human embryonic kidney (cellules embryonnaires de rein humain) hMOR récepteur mu opioïde humain

NBD N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)

NOP / ORL1 récepteur à la nociceptine / opioid like receptor NRK normal rat kidney : fibroblastes de rein de rat

PBS tampon phosphate

PC phosphatidylcholine

PE ---------------ethanolamine

PI ---------------inositol

PIP

2 ---------------inositol-diphosphate

PS ---------------serine

PTX toxine pertusssique

r rayon des domaines RCPG récepteur couplé aux protéines G ROI region of interest : zone de travail sur une image

SH-SY5Y lignée de neuroblastomes

SM sphingomyéline SMT single molecule tracking : suivi de molécule unique

SVF sérum de veau fœtal

T7 peptide signal (11 acides aminés)

TPA 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate

TX100 détergent triton X-100

Abréviations FRAP

c rayon de la cellule D exp coefficient de diffusion expérimental D réel ---------------------------- réel, recalculé à partir de Dexp D libre ---------------------------- réel à longue distance D conf ---------------------------- réel dans les domaines FRAP retour de fluorescence après photoblanchiement FRAPrv ---------------------------------------------------------- à rayon variable

F(t) -------------------------- normalisé

I (t) intensité de fluorescence en fonction du temps

M fraction mobile

M

I fraction immobile

M

P fraction mobile permanente

P proportion de chaque population

PM photomultiplicateur

quotesdbs_dbs35.pdfusesText_40

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