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ENSC-2009 n°186

THESE DE DOCTORAT

DE L"ECOLE NORMALE SUPERIEURE DE CACHAN

Présentée par

Mademoiselle Mélanie BEDU

pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L"ECOLE NORMALE SUPERIEURE DE CACHAN

Domaine :

CHIMIE

Sujet de la thèse :

DÉVELOPPEMENT DE GUIDES D"ONDES PLANAIRES DE TiO2 OPTIQUEMENT ACTIFS POUR BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES. Thèse présentée et soutenue à Cachan le 13 novembre 2009 devant le jury composé de : Pr. H. Benisty Institut d"Optique Président

Pr. H. Girault L.E.P.A., EPFL Rapporteur

Dr. H. Rigneault Institut Fresnel Rapporteur

Dr. A. Pillonnet L.P.M.L., Univ. Lyon I Examinatrice

Dr. L. Martinelli Genewave Co-encadrant

Pr. P. Audebert P.P.S.M., ENS Cachan Directeur de thèse Laboratoire de Photophysique et Photochimie Supramoléculaires et Macromoléculaires

ENS CACHAN/CNRS/UMR 8531

61, avenue du Président Wilson, 94235 CACHAN CEDEX (France)

A Fabien Béteille,

A mes proches,

REMERCIEMENTS

R

EMERCIEMENTS

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REMERCIEMENTS

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TABLE DES MATIÈRES

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ABLE DES MATIÈRES

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TABLE DES MATIÈRES

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TABLE DES MATIÈRES

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TABLE DES MATIÈRES

ŸȌŴȌŴȌ 3"¹º¹Ɏ"´Ɏ¹µ²»º¯µ´¹Ɏ§·»"»¹"¹ ȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌ ŴŸųɎ

--$7$Ɏ(ɎȎɎ#N3 (+2Ɏ$7/N1(,$-3 47ȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌŴźźɎ

GLOSSAIRE

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LOSSAIRE

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GLOSSAIRE

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33 ɎȎɎº®Ô´µ¿²º¸¯¬²»µ¸µ§©Ôºµ´"Ɏ

CHAPITRE I : INTRODUCTION GÉNÉRALE

I

NTRODUCTION GÉNÉRALE

CHAPITRE I : INTRODUCTION GÉNÉRALE

CHAPITRE I : INTRODUCTION GÉNÉRALE

3,Ɏ"¹ºɎ»´"Ɏ

3,ȍɎ"¹ºɎ

CHAPITRE I : INTRODUCTION GÉNÉRALE

CHAPITRE I : INTRODUCTION GÉNÉRALE

Bibliographie

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CHAPITRE I : INTRODUCTION GÉNÉRALE

CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES

CHAPITRE II

P

ROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES

À ONDES ÉVANESCENTES

ŴȌ +$2Ɏ!(./4"$2ȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌ Ŵų

ŴȌŴȌ /1N2$-3 3(.-ȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌȌ Ŵų

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CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES

1. Les biopuces

1.1. Présentation

1.1.1. Généralités

1.1.2. Techniques de détection

CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES

1.1.3. Principe d"une expérience biopuce

CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES

Fonctionnalisation

" Spotting »

Extraction des acides nucléiques

Marquage

ÉchantillonSubstrat

Hybridation

Lecture

Image

Traitement des données

Information biologique

Identification de l'échantillon

Préparation du substratPréparation de l'échantillon

Fonctionnalisation

" Spotting »

Extraction des acides nucléiques

Marquage

ÉchantillonSubstrat

Hybridation

Lecture

Image

Traitement des données

Information biologique

Identification de l'échantillon

Préparation du substratPréparation de l'échantillon CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES

1.2. Biopuces à fluorescence

1.2.1. Introduction au phénomène de fluorescence

CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES ³Ö³"Ɏ Ôº§ºɎ Ô²"©º¸µ´¯·»"Ɏ 2

États vibrationnels

États électroniques

Croisement

inter système S0 S1 S2 Sn T1

Absorption

Conversion

interneFluorescence

Phosphorescence

λéxc

États vibrationnels

États électroniques

Croisement

inter système S0 S1 S2 Sn T1

Absorption

Conversion

interneFluorescence

Phosphorescence

Croisement

inter système S0 S1 S2 Sn T1

Absorption

Conversion

interneFluorescence

Phosphorescence

λéxc

CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES

1.2.2. Marqueurs et imagerie.

400 500 600 700 8000255075

100

Intensite (U. Arb.)

Longueur d'onde (nm)

Cy3 excitation

Cy3 émission

Cy5 excitation

Cy5 émission

NN NN

Cyanine 3

Cyanine 5

(a) Spectres d'excitation et d'émission(b) Structures CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES spots fluorescentsobjectifphotomultiplicateur lame dichroïque diaphragme filtre d'émission déplacement de la lame filtre d'excitation source imageur filtre d'émission spots fluorescents source objectifobjectif filtre d'excitation (a) Scanner confocal(b) Imageur grand champ spots fluorescentsobjectifphotomultiplicateur lame dichroïque diaphragme filtre d'émission déplacement de la lame filtre d'excitation source imageur filtre d'émission spots fluorescents source objectifobjectif filtre d'excitation (a) Scanner confocal(b) Imageur grand champ

1.2.3. Analyse des données

CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES 0 1 2

101001000

log Int. (U. Arb.)

Position (mm)

fond B signal mesuré S=F+B fluorescence F 0 1 2

101001000

log Int. (U. Arb.)

Position (mm)

fond B signal mesuré S=F+B fluorescence F bioσȌɎ 22
bioélecBσσσ++=Ɏ

BBFBFRSB

CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES

1.2.4. La chaîne photométrique

- $ɎȘ6Ȍ©³ ESPE

0=Ɏ

- 3 CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES surface fonctionnalisée Cs imageur ta, bin filtre d'émission T f source objectif ON1 objectif ON2 xzysubstrat spots fluorescents QE, θeE (W.cm-2) surface fonctionnalisée C s imageur ta, bin filtre d'émission T f source objectif ON1 objectif ON2 xzysubstrat spots fluorescents QE, θeE (W.cm-2)

1.2.5. Critères de performances

CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES

1.2.6. Limites des biopuces à fluorescence

ºµ»º"¹Ɏ ²"¹Ɏ ³µ²Ô©»²"¹Ɏ ³§¸·»Ô"¹Ɏ ¹µ´ºɎ "¾©¯ºÔ"¹Ɏ ©"Ɏ ·»¯Ɏ"´º¸§ae´"Ɏ »´Ɏ ¬µ´ªɎ Ô²"¼ÔɎ "ºɎ ²¯³¯º"Ɏ ²§Ɏ

CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES

2. Les biopuces à guide d"ondes

2.1. Excitation par ondes évanescentes

2.1.1. Principe

(b) Excitation conventionnelle(a) Excitation évanescente cibles marquéesde la solution d'hybridation sondes substrat cibles hybridées champ évanescent (b) Excitation conventionnelle(a) Excitation évanescente cibles marquéesde la solution d'hybridation sondes substrat cibles hybridées champ évanescent CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES

2.1.2. État de l"art des biopuces à ondes évanescentes

θL n2 n1>n2θ'i>θL x z yθi<θL

Rayon réfracté

Rayons réfléchisθr

θL n2 n1>n2θ'i>θL x z y x z yθi<θL

Rayon réfracté

Rayons réfléchisθr

CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES 12

Ș3$șɎ

iiii

TEnnnnnnrθθθθ22

12 2122
12

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12

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TMnnntθθ

coscoscos2121+=Ɏ CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES filtre d'émissionimageur objectif prisme source lentilleschambre d'hybridation mix d'hybridation spots fluorescents (a) Excitation évanescente par prisme substrat source lentillespots fluorescentsmix d'hybridationchambre d'hybridation filtre d'émissionimageur objectif (c) Excitation évanescente par le substrat spots fluorescents substrat guide d'ondes optiquemix d'hybridation chambre d'hybridationfiltre d'émissionimageur objectif (b) Excitation évanescente par un guide d'ondes mince optique source lentille filtre d'émissionimageur objectif prisme source lentilleschambre d'hybridation mix d'hybridation spots fluorescents (a) Excitation évanescente par prisme substrat source lentillespots fluorescentsmix d'hybridationchambre d'hybridation filtre d'émissionimageur objectif (c) Excitation évanescente par le substrat substrat source lentillespots fluorescentsmix d'hybridationchambre d'hybridation filtre d'émissionimageur objectif (c) Excitation évanescente par le substrat spots fluorescents substrat guide d'ondes optiquemix d'hybridation chambre d'hybridationfiltre d'émissionimageur objectif (b) Excitation évanescente par un guide d'ondes mince optique source lentille source lentille CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES (a) Zeptoreader(c) Scanner conventionnel(b) Profils d'intensité (a) Zeptoreader(c) Scanner conventionnel(b) Profils d'intensité CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES

2.1.3. Intérêt biologique

a. Cinétiques CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES b. Détermination des polymorphismes c. Simplification des protocoles CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES d. Optimisation des conditions expérimentales

2.2. Architecture optique des biopuces à guide d"ondes

2.2.1. Présentation générale

Guide d'ondes

xzysubstrat source primaire Coupleur onde guidéeFonctionnalisation de surface spots fluorescents champ évanescent

Guide d'ondes

xzysubstrat source primaire Coupleur onde guidéeFonctionnalisation de surface spots fluorescents champ évanescentɎ CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE DES BIOPUCES À ONDES ÉVANESCENTES

2.2.2. Le coupleur

a.

Description

0PP u c=ηɎ spots fluorescentsmodes utiles pertes spatiales substrat modes guidés utiles (Pu)quotesdbs_dbs35.pdfusesText_40

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