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Jury d"évaluation:Présidentedujury:OULMILamia(Maîtredeconférences"B»-UFM Constantine).Rapporteur:GACIMeriem(Maître-Assistante"A»-UFM Constantine)Examinatrice:ALATOURadia(Maîtrede conférences"A»-UFM ConstantineAnnée universitaire2016-2017

L"examen cytobactériologique des urineschez l"adulte Présenté et soutenu par:Bouakkaz HananeLe: 29/06/2017Boucherbit Sara

Résumé

RésuméCe travail a été réaliséau laboratoire d"analyses médicales HIBAafin d"isoler etidentifier les bactéries responsables des infections urinaires et étudier le profil derésistance aux antibiotiques des bactéries identifiées.Surune période de 9 semaines 112 bactéries sont isolées à partir des urines.L"examen cytobactériologique des urines nous a permis la détection des leucocytes,d"hématies et de germes. Grace à la galerie biochimique nous avons constaté que legerme le plus souventisoléest unEscherichia coli. Les 12bactéries identifiéesdans cette étude sont par ordre décroissant:Escherichia coliavec 66,07 %,Proteusmirabilisavec 8,03 %,Klebsiellapneumoniaeavec 7,14 %,Enterobacteraerogenes6,25 %,Enterobactercloaceae, Citrobacterbraakii, Citrobacterfreundii, Pseudomonasaeruginosa, Staphylocoqueà coagulasenégativeetStreptococcusspp.la proportion dechacun avec1,79 %;SerratiamarcescensetAcinetobacterbaumanniila proportion dechacun avec0,89%.Le sexe féminin estleplus touché par lesinfectionsurinaires que le sexemasculin,oùun sexe ratio est 0,27. La résistance des bactéries isolées aux différentsantibiotiques a montré une variabilité selon les souches.Les mots clés:Infection urinaire,Examen Cytobactériologique des Urines,Escherichia coli,Antibiogramme.

AbstractThis work was carried out in the laboratory of medical analyzes HIBA in orderto isolate and to identify the bacteria responsible for the urinary infections and to studythe antibiotic resistance profile of the bacteria identified.Over a period of 9 weeks, 112 bacteria are isolated from the urine.Thecytobacteriological examination of the urine allowed us the detection of leucocytes, redblood cells and germs.To the biochemical gallery, we found that the germ isolatedmost oftenis anEscherichia coli.The 12 bacteria identified in this study are indescending order:Escherichia coliwith 66.07%, Proteus mirabilis with 8.03%,Klebsiellapneumoniaewith 7.14%,Enterobacteraerogenes6.25%,Enterobactercloaceae,Citrobacterbraakii,Citrobacterfreundii,Pseudomonas aeruginosa,Coagulase-negative,StaphylococcusandStreptococcusspp.the proportion of each with1.79%;SerratiamarcescensandAcinetobacterbaumanniithe proportion of each with0.89%.The female sexis more affected by urinary tract infections than the male sex,where a sex ratio is 0.27.The resistance of the bacteria isolated to the differentantibiotics showed a variability according to the strains.Keywords:Urinary Infection, CytobacteriologicalExamination of Urines,Escherichiacoli, Antibiogram.

Liste des figuresFigure1:Anatomie de l"appareil urinaire..........................................................................2Figure2:Formestopographiquesdestypes d"infection urinaire.......................................12Figure3:Schéma récapitulatif des différentes étapes de l"ECBU.....................................19Figure 4:Profil numérique deKlebsiellapneumoniae.....................................................25Figure 5:Lecture de la bandelette urinaire.........................................................................28Figure 6:L"aspect de certains cristaux sous microscope optique rencontrés chez quelquespatients................................................................................................................................29Figure 7:Etat frais des urines (objectif X40)....................................................................29Figure 8:pourcentage des différents élémentsde l"examen cytologique.........................30Figure 9:Résultat d"une coloration de Gram (Bacilles à Gram négatif) (objectif X40)...31Figure 10:Répartition des échantillons selon le résultat de la culture.............................32Figure11:Répartition des infections urinaires selon le sexe.............................................33Figure12:Répartition des échantillons positifs en fonction de l"âge et du sexe..............34Figure13:Résultats de la galerie API10SpourEscherichia coli.......................................35Figure14:Pourcentage desbactériesresponsablesdes infections urinaires....................36Figure15: Pourcentagedes familles responsables des infections urinaires.......................37Figure16: Répartition des germes selon le sexe................................................................38Figure17: représentation graphique de taux de résistance deL"Escherichiacoli.............39Figure18: représentation graphique de taux de résistance deProteusmirabilis...............40Figure19: représentation graphique de taux de résistance deKlebsiellapneumoniae......40Figure20: représentation graphique de taux de résistance deEnterobacteraerogenes...41Figure21: représentation graphique de taux de résistance deEnterobactercloaceae......42Figure22: représentation graphique de taux de résistance deCitrobacterbraakii.............42Figure23: représentation graphique de taux de résistance deCitrobacterfreundii..........43Figure24:représentation graphique de taux de résistance deSerratiamarcescens..........44Figure25:représentation graphique de taux de résistance dePseudomonasaeruginosa.44Figure26: représentation graphique de taux de résistance deStaphylocoqueà coagulasenégative...............................................................................................................................45Figure27: représentation graphique de taux de résistance deStreptococcusspp..............46Figure28: représentation graphique de taux de résistance deAcinetobacterbaumannii..46

Liste des tableauxTableau 1:Les principaux constituants de l"urine............................................................4Tableau2:Répartition desélémentsde l"examen cytologique..........................................30Tableau3:Caractèresbiochimiquesdes souches isolées..................................................35

Liste des abréviationsAPI10S: Appareillage et Procédés d"Identification.ARA: ArabinoseATB:Antibiotique.Ca: oxalate de calcium.ECBU: Examen Cyto-Bactériologique des Urines.F: Femme.GLU: Glucose.GN: Gélose Nutritive.H: Homme.: Eau oxygénée.S: Sulfure d"Hydrogène.I: Intermédiaire;IND: Indole.IU: Infection Urinaire.LDC:LysineDéCarboxylase.ODC:Ornithine DéCarboxylase.ONPG:Ortho-Nitro-Phényl-Galactopyranoside.R: Résistance.S: Sensible.TDA:Tryptophane DésaminAse.UFC: Unités Formant des Colonies.URE: Urée.?l: microlitre.

GLOSSAIRE-Bactériurie :Présencede bactéries dans les urines. L'urine étant un liquide stérile, laprésence de bactéries peut être à l'origine de différentes pathologies, telles que les cystites, lespyélonéphrites ou encore les bactériuries asymptomatiques. La confirmation d'une infectionurinaire se fait devant une bactériurie significative, c'est-à-dire une bactériurie ne pouvant pasêtre imputée à une contamination bactérienne lors du prélèvement de l'échantillon urinaire.-Cystocèle: fait généralement suite à desgrossessesetaccouchementsmultiples ou difficiles; cela peut aussi être engendré par l'altération des tissus de soutien avec l'âge ou l'altérationdes muscles du périné. La cystocèle peut être à l'origine d'une difficulté à uriner, ou, aucontraire, une incontinence urinaire-Hématurie :Présence de sang dans les urines. En fait on dépiste la présence de globulesrouges en quantité anormalement élevée.-Leucocyturie :Présence de globules blancs (leucocytes) dans l'urine.-Lithiase :Affection caractérisée par l'apparition dans un conduit de l'organismed'une masseminérale, appelée calcul.-Pollakiurie :Fréquence excessive des mictions en petites quantités. Ces mictions ont lieu àintervalles fréquents et sont liées à une sensation de plénitude vésicale (impression de vessiepleine) qui n'est pas dueà une vessie pleine mais à une vessie présentant une irritation. Cettesensation s'accompagne d'une impression de plénitude même quand la vessie n'est pas pleine.-Pyurie :Présence de pus et de leucocytes altérés dans les urines.-Urétrite :Inflammationde l'urètre chez l'homme ou la femme, habituellement d'originebactérienne.

Table des matièresIntroduction....................................................................................................1ChapitreI: Etude bibliographique1. L"appareil urinaire.....................................................................................21.1 L"appareil urinaire haut...........................................................................21.1.1 .Le rein................................................................................................21.1.2 .L"uretère..............................................................................................31.2. L"appareil urinaire bas..............................................................................31.2.1 .La vessie...............................................................................................31.2.2. L"urètre.................................................................................................31.2.3. La prostate............................................................................................32. Constitution physiologique des urines.........................................................43. L"infection urinaire....................................................................................53.1. Infection urinaire simple et compliquée....................................................53.2. Rechute versus récidive.............................................................................64.Germes responsables..................................................................................64.1. Escherichia coli...................................................................................64.2. Proteus mirabilis.................................................................................74.3. Klebsiella pneumoniae........................................................................74.4. Enterobacter........................................................................................74.5. Citrobacter..........................................................................................84.6. Serratia................................................................................................84.7. Staphylocoques....................................................................................84.8.Streptococcusspp.................................................................................84.9.Pseudomonas........................................................................................94.10. Acinetobacter baumannii..................................................................95. Mode évolutif..............................................................................................105.1. Selon le mode endémo-sporadique..........................................................105.2. Selon le mode épidémique.......................................................................10

6. Les maladies urinaires..................................................................................106.1. Cystite.......................................................................................................106.1.1. Cystite aigue simple.............................................................................106.1.2. Cystite aigue compliquée......................................................................106.2. Prostatite...................................................................................................116.3. La pyélonéphrite aigue..............................................................................117. Facteurs favorisants l"infection...................................................................127.1. Facteurs liés aux bactéries........................................................................127.1.1. Facteurs de virulence bactérienne.........................................................127.1.2. Adhérences bactériennes et colonisation...............................................127.2. Facteurs liés à l"homme............................................................................138. Moyens de défense de l"hôte......................................................................139. Réservoir de germes...................................................................................139.1. Réservoir endogène..................................................................................139.2. Réservoir exogène....................................................................................1410. Voies de contamination...........................................................................1410.1. Infection communautaire.........................................................................1410.2. Infection nosocomiale.............................................................................1411. Examen cytobactériologique des urines.................................................14ChapitreII: Matériels et méthodes1. Prélèvement.................................................................................................161.1. Chez les sujets coopératifs.......................................................................161.2. Chez les sujets non coopératifs...............................................................162. Transport des urines..................................................................................163. Manipulations au laboratoire....................................................................173.1. Etiquetage................................................................................................173.2. Examen macroscopique des urines.........................................................17

3.3. Examen à la bandelette urinaire..............................................................173.4. Examen cytobactériologique des urines..................................................183.4.1. Examen cytologique............................................................................193.4.1.1. Examen cytologique quantitatif.....................................................193.4.1.2. Examen cytologique qualitatif......................................................193.4.2. Examen bactériologique.....................................................................203.4.2.1. Ensemencement des urines...........................................................203.4.2.2. Dénombrement des microorganismes..........................................203.4.2.3. Observation des cultures et différenciation des colonies..............213.4.2.4. Identification bactérienne..............................................................21a. Recherche de la catalase..................................................................21b. Recherche de la coagulase................................................................21c-La galerie biochimique......................................................................22d-Antibiogramme.................................................................................25ChapitreIII: Résultats et discussion1. Examen macroscopique des urines...........................................................272. Examen à la bandelette urinaire...............................................................273. Examen cytobactériologique des urines........................................................283.1.Examencytologique...................................................................................283.1.1. Examen cytologique quantitatif.......................................................283.1.2. Examen cytologique qualitatif.........................................................313.2.Examen bactériologique...........................................................................313.2.1. Dénombrement..................................................................................313.2.2. Observation des cultures et différentiation des colonies..................323.2.3. Identification bactérienne..................................................................34

3.2.4. Antibiogramme....................................................................................393.2.4.1.Escherichia coli.................................................................................393.2.4.2.Proteus mirabilis................................................................................393.2.4.3.Klebsiella pneumoniae.......................................................................403.2.4.4.Enterobacter aerogenes.....................................................................413.2.4.5.Enterobacter cloacea..........................................................................413.2.4.6.Citrobacter braakii..............................................................................423.2.4.7.Citrobacter freundii.............................................................................433.2.4.8.Serratia marcescens.............................................................................433.2.4.9.Pseudomonas aeruginosa....................................................................443.2.4.10. Staphylocoquesà coagulase négative................................................453.2.4.11.Streptococcus spp................................................................................453.2.4.12.Acinetobacter baumannii....................................................................46Conclusion..............................................................................47Références bibliographiqueAnnexes

Introduction

Introduction

Les maladies infectieuses, sontlerésultatdu développementd"agent pathogènesmicroscopiques au sein d"un tissu ou d"un organequi sont d"origine bactérienne, viraleou mycosique, qui cause des maladies infectieuses. Parmi cesinfections on distinguel"infection urinaire qui représente la deuxième pathologie infectieuseaprès celle desvoies respiratoires (Perry etal., 2004).L'infection urinaire est un terme général qui comprend la colonisationmicrobienne asymptomatique de l"urine, et l"infection symptomatique avecl"inflammation des structures de l"arbre urinaire ( Kouta, 2009).L"examen cytobactériologique des urines (ECBU) est l"examen clé pour diagnostiquerl"infection urinaire, adapter la thérapeutique et suivre son efficacité(Courcoletal.,2005),cela en isolant les microorganismes responsables et on déterminant la sensibilitéou la résistance de ces germesidentifiés aux antibiotiques (Abalikumwe,2004).Pour cela on s"est intéressé au cours de cette étude à examiner les urines despatients suspectés ayant une infection urinaire. L"objectifde notre travail a portéprincipalement sur:-Isolement etidentification des bactériespotentiellement responsables desinfections urinaires.-Etudier le profil de résistance aux antibiotiques desbactériesidentifiées.

ChapitreIEtude bibliographique

Chapitre 1Etude bibliographique

1.L"appareil urinaireL'appareil urinaireest un appareil complexe qui implique plusieurs organes telsque lesreins,l"uretère,lavessie, la prostate et l'urètre(Figure 1)(Kamina, 2005).L'urine est fabriquée par lesreins puis est transportée par les uretères dans lavessie où elle est stockée.La miction permetl'évacuation de l'urine en passant parl'urètre qui débouche sur le méat urinaire(Hordéetal.,2014).

Figure1:Anatomie del"appareil urinaire (Ellatifi,2011).1.1.L"appareil urinaire haut1.1.1. LereinLe rein est un organestérileglandulaire pairsitué dans la région lombairedontla fonction importanteest lafiltration du plasma sanguinet lasécrétion de l"urine(Kamina,2005).C"estun organe rétropéritonéal,quisynthétisel"érythropoiétine(stimule l"érythropoïè se au niveau de lamoelle osseuse, et larénine (participe à larégulation de lapression artérielle,..)(Kohler,2011).

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1.L"appareil urinaireL'appareil urinaireest un appareil complexe qui implique plusieurs organes telsque lesreins,l"uretère,lavessie, la prostate et l'urètre(Figure 1)(Kamina, 2005).L'urine est fabriquée par lesreins puis est transportée par les uretères dans lavessie où elle est stockée.La miction permetl'évacuation de l'urine en passant parl'urètre qui débouche sur le méat urinaire(Hordéetal.,2014).

Figure1:Anatomie del"appareil urinaire (Ellatifi,2011).1.1.L"appareil urinaire haut1.1.1. LereinLe rein est un organestérileglandulaire pairsitué dans la région lombairedontla fonction importanteest lafiltration du plasma sanguinet lasécrétion de l"urine(Kamina,2005).C"estun organe rétropéritonéal,quisynthétisel"érythropoiétine(stimule l"érythropoïè se au niveau de lamoelle osseuse, et larénine (participe à larégulation de lapression artérielle,..)(Kohler,2011).

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1.L"appareil urinaireL'appareil urinaireest un appareil complexe qui implique plusieurs organes telsque lesreins,l"uretère,lavessie, la prostate et l'urètre(Figure 1)(Kamina, 2005).L'urine est fabriquée par lesreins puis est transportée par les uretères dans lavessie où elle est stockée.La miction permetl'évacuation de l'urine en passant parl'urètre qui débouche sur le méat urinaire(Hordéetal.,2014).

Figure1:Anatomie del"appareil urinaire (Ellatifi,2011).1.1.L"appareil urinaire haut1.1.1. LereinLe rein est un organestérileglandulaire pairsitué dans la région lombairedontla fonction importanteest lafiltration du plasma sanguinet lasécrétion de l"urine(Kamina,2005).C"estun organe rétropéritonéal,quisynthétisel"érythropoiétine(stimule l"érythropoïè se au niveau de lamoelle osseuse, et larénine (participe à larégulation de lapression artérielle,..)(Kohler,2011).

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1.1.2.L"uretèreLes uretères sont les conduits amenant l"urine du rein à la vessie. Ils sont pairs,symétriques, longs et s"étendent de l"étage lombaire à la partie basse du pelvis.Ce sontdes conduits musculo-membraneux, doués de mobilité permettant defaire progresserl"urine des lombes jusqu"à la vessie. Ils sont originaires d"un diverticuledu canal de Wolff(Cloaque primitif)(Olivier et Freiss,2011).1.2. L"appareil urinaire bas1.2.1. La vessieLa vessie est une structurestérileen forme de sac composéde fibres musculo-membraneuses. Située dans lebassin, ellecontient l"urine entre chaque miction .souspéritonéale elle est située dans la partie antérieure du pelvis, derrière lepubis(Desgrandchamps etal.,2008).1.2.2.L"urètreL"urètre est leconduit par lequel, l"urine accumulée dans la vessie et chassée parles contractions vésicales s"écoule à l"extérieur(Lassa et Chiche,1932).Il est bref chez la femme, environ 3 cm, ce qui rend plus difficile la continence etl"exposeàdesépisodes defuite urinaire lorsque les tissus du pelvis ont été distendus:grossesse, vieillissement,...Chez l"homme, il est beaucoup plus long, et son trajetcomprend plusieurscoudures.Par conséquent, la continence est moins menacée,mais encontrepartie,l"évacuationestrendue plus difficile par la présence d"obstacles le long du trajet, notamment de laprostate(OliveretFreiss,2011).L"urètremasculin a une double fonction transporter l"urine ou le sperme hors del"organisme donc l"urètrefaitpartieà la foisdu système urinaire et du système génitale(Elaine et Marieb,2008).1.2.3.La prostateC"est uneglande quin"a aucune fonction hormonaletient pourtant une placeprépondérante tout au long de la vie de l"homme. Les problèmes de prostate ne touchentpas que les hommes du troisième âge. En effet, le contrôle qu"exerce la prostate en

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régulant la cadence mictionnelle ainsi qu"en s"intégrant àla vie sexuelle et reproductrice(notamment par la production d"une grande partie du liquide spermatique), montre sonimportance chez le jeune adulte(Bitton,2007).2.Constitution physiologique desurinesL"urine est composée de 95% d"eau dans laquelle les déchets du métabolismesont dissous. Les principaux constituants sont mentionnés dans le tableauci-dessous.Tableau1:Les principaux constituants de l"urine(Chouba etal,2006).Principauxconstituants d"urineVolume habituellesEau950 g/lUrée20à30 g/lChlorure6à10 g/lSodium5à6.5g/lPhosphates1.5à3g/lSulfate2g/lCréatinine1à1.5g/LAmmoniaque0.5à1g/lAcide hippurique0.5g/lAcide urique0.4 à 0.8g/lCalcium0.008à 0.3g/lLa présence d"urochromesest responsable dela coloration jaune des urines(Schaffler etMenche,2004).L"urine est normalement stérile, ne contient ni microbe, ni virus ni champignon(Chibane, 2010).Son odeur légèrement aromatiqueet dégage une odeur d"ammoniacattribuable à l"action des bactéries sur ses solutés. Certainsmédicaments, certainslégumes et quelques maladies(telquelediabète sucré) modifient son odeur(Elaine etMarieb,2008).

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3.2.Rechute versus récidiveL"IU peut récidiver après un traitement. La rechute indique un échecd"élimination des bactéries et est, de plus en plus fréquemment l"indice d"une résistanceauxantibiotiques, ou d"une anomalie anatomique au niveau des reins ou de la vessie, dela présence de calculs surinfectés, ou d"une prostatite chronique. La réinfection est unenouvelle infection avec un germe différent(François etal., 2013).Une IU aiguebasse simple traitée est rarement, lacause de complication chez lafemme non enceinte, même en cas de cystites récidivantes; il semble n"y avoir pas delésions rénales secondaires ni d"augmentation de la mortalité et l"évolution en IU hauteest rare(François etal., 2013).4.Germes responsablesCe sont des germes uro-pathogènes, ayant la capacité d"adhérer aux cellules del"urothélium, grâce à la présence d"adhésines reconnaissant certains récepteurs desmembranes cellulaires de l"urothélium(Chartier,2002).Les entérobactéries appartiennent à la famille des Enterobacteriaceae. Cettefamille est composée de bactéries rassemblées en raison de leurs caractères Communs:Bacillesà Gram négatif de dimensions 0,5?msur 3?m,mobiles grâceàuneciliature péritriche, se développent aisément sur milieux ordinaires; AérobiesfacultatifsFaisant fermenter le glucose avec ou sansgaz.Ne possèdentpas d"oxydaseetréduisent les nitrates en nitrites (Pilet etal., 1979).Les espèces pathogènes possèdent des pili communs (fimbriae) qui so nt desfacteurs d"adhésion (Guiraud et Rosec, 2004).4.1.Escherichia coliE.coliest une bactérieasporulée, fine et allongée à extrémités arrondies, mobilegrâceà une ciliature péritriche. Se développe en24h à 37°C sur les milieux gélosés endonnant de colonies rondes, lisses, à bords réguliers, de 2 à 3mm de diamètre, nonpigmentées.Sur les milieux lactosés, les colonies sont généralement lactose positif etsur gélose au sang elles peuvent être hémolytiques.

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Les principaux caractères positifs sont Indole +, ONPG +, Mannitol+ (Avril etal.,2000).E.coli, hôte normal de l"homme, souvent retrouvé en petit nombre dans lesurines saines (Pilet etal., 1979).4.2.ProteusmirabilisCe sont des bacilles à Gram négatif, mobiles, sont largement répandusdans lanature et ils sont isolés du sol, de l"eau, de l"intestin de l"homme et de nombreusesespèces animales.Proteusmirabilisest l"espèce la plus fréquemment isolée deprélèvementscliniques. C"est la bactérie la plus souvent isolée des urines et elle est àl"origine d"infections graves et parfois mortelles (Sougakoff etTrystram, 2003).En milieu géloséP.mirabilispeut envahir la surface dumilieu en formant desondes concentriques, cet essaimage est dueà la grande mobilité de la bactérie (Avril etal.,2000).4.3.KlebsiellapneumonieLes klebsielles sont desEnterobacteriaceae, bacilles à Gram négatif,immobiles, capsulées et fermentent de nombreux sucres avec production de gaz.Surmilieu gélosé, les colonies sont caractéristiques: sont volumineuses, bombées, brillanteset très visqueuses à cause de la capsule (Fauchereet Avril, 2002).LesKlebsiellapneumoniesont pathogènes,opportunistes très incriminésdansles infections nosocomiales, ellessontresponsablesd"infections diverses: infectionssuppuratives, urinaires, respiratoires, biliaires, hépatiques intra-abdominales,bactériémies, septicémies, infections de sites opératoires (Sekhri, 2011).4.4.EnterobacterCe sont des entérobactéries mobiles, capsulées ou non. Souvent rencontrées dansle sol et les eaux, ce sont des commensaux du tube digestif de l"homme et des animauxet sur la peau et les muqueuses(Pilet etal, 1979). Ils sont rarement pathogènes pour lesanimaux et l"homme mais ils peuvent exceptionnellement se révéler agents depleurésies, méningites ou pyélonéphrites, et pathogènes opportunistes peuvent êtreresponsables de septicémies, de méningites, d"infections urinaires, d"infectionsnéonatales.

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Les caractères biochimiques qui permettent de distinguer les deux espèces:Enterobacteraerogenes: (ADH-, LDC +),Enterobactercloacae: (AD H +, LDC-)(Avril etal.,2000).4.5.CitrobacterCes entérobactéries lactose + utilisent le citratecomme seule source de carbone.Sont des commensaux de l"intestin de l"homme etdes animaux (Guiraud et Rosec,2004).Citrobacterfreundiipeut être responsable d"infections urinaires, d"infections deplaies ou encore de septicémies. Germe fréquemmentisolé en milieu hospitalier(Sougakoff etTrystram, 2003).4.6.SerratiaC"est une bactérie saprophyte présente dans l"eau et les cavités naturelles del"homme, bacilleà Gramnégatif, mobile et aéro-anaérobiefacultatif. Sa température decroissanceestenviron de 22°C à 37°C, elle est responsable des infections urinairesnosocomiales, surtout chez les malades opérés ou sondés (Berche etal.,1991).4.7.StaphylocoquesSont des cocciàGram positif, non mobiles, asporuléset habituellement noncapsulés la plupart des espèces sont aéro-anaérobies facultatives qui tendent à segrouper en amas.Ilssont parfois désignés sous le nom de Staphylocoques à coagulasenégative et à catalase positive. Leur identification repose sur des caractèresbiochimiques (Nauciel,2000).Les Staphylocoques sont des bactéries très répandues dans la nature, aussi biendans l"air que dans le sol ou dans l"eau. Ce sont de commensauxfréquents de la peau etdes cavités naturelles de l"homme et des animaux. Ce sont des agents opportunistespathogènes (Guiraud et Rosec, 2004).4.8.Streptococcusspp.Ce sont des petitescocciàGram positif, immobiles d"environ 0,6?mdediamètre légèrement ovoïdeet disposés en très courtes chainettes, saprophytes de lapeau et des muqueuses.

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Les Streptocoques regroupent de nombreuses espèces, certaines sont desparasites de l"espèce humaine Streptocoques de groupe A, C et G de LANCEFIELD, etd"autres commensaux de la muqueuse buccale (Streptoc oque s du group e B etStreptocoques non groupableset non hémolytiques)ou de la muqueuse génitale (groupeB) ou de l"intest in (an cien Strept ocoqu e du gr oupe D ou Entér ocoques considérésmaintenant comme faisant partie d"un genre à part, le genreEnterococcus) (Dellaras,2014).4.9.PseudomonasLespseudomonassont desbacillesà Gram négatif, aérobies stricts, très mobiles.Fréquemment retrouvés dans le sol et dans l"eau, mais cela est sans conséquences pourles individus en bonne santé, en effet, ce sont des pathogènes opportunistesresponsables de nombreuses infections chez les patients immunodéprimés.Lespseudomonasont pu s"installer dans l"environnement hospitalier. Leséquipements qui fonctionnent en environnement humide. Ce sont des germes robustesqui poussent vite.Ils possèdent despigments, produisant des colonies caractéristiques vertes oubleu-vert, colorées par un pigment soluble dans l"eau, la pyocyanine. Les coloniessurgélose, ont une odeur caractéristique fruitée, rappelant l"odeur du raisin, qui est parfoisprésente au niveau des plaies ou d"autres sites colonisés de façon massive par cesgermes (Toder, 1999). Bactérie nosocomial possédantun pouvoir pathogène étendu, elleest responsable de nombreuses infections:pneumonie, gastro entérites infantiles etinfection urinaire l"espèce la plus fréquemment responsable d"infections humaines estPseudomonasaeruginosa(Wainsten, 2012).4.10.AcinetobacterbaumanniiEst l"agent fréquent de colonisation cutanée et muqueuse chez les patients hospitalisésen unités de soins intensifs. Cette bactérie responsable d"infectionsnosocomiales quiconcerne essentiellement l"arbre respiratoire, l"appareil urinaire, les plaies, et peuventévoluer vers une bactériémie. D"autres manifestations cliniques ont été observées(pleurési es, péritonit es che z l es dialy sés, méningit e, c es infections se manifestent

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souvent par bouffées épidémiques et son dues àdes souches multirésistantes (Lambert,2007).5.Mode évolutifL'infection urinaire évolue selon deux modes : endémique et épidémique5.1.Selon le mode endémo-sporadique: la bactérie en cause provient de la floreintestinaledu patient (Konan,1995).5.2.Selon le mode épidémique: la transmission se fait d'un patient sondé à un autrepar voie manu-portée, par manœuvre instrumentale ou par des solutions d'antiseptiquescontaminées. Ces épidémies surviennent dans les unités de soins caractérisées par :-Le grand nombre de malades sondés-Le mauvais entretien du système de drainage-L'infection urinaire asymptomatique non diagnostiquée servant de réservoir à labactérie(Konan,1995).6.Les maladiesurinaires6.1.CystiteEtat inflammatoire aigu ou chronique d"origine infectieuse, atteignant la vessieet responsable de la triade:brulures mictionnelles,pollakiurie, pyurie(Flam,1998).Lacystite n"existe quechez la femme. Chez l"homme, on considère qu"il s"agit d"uneprostatite (Pourcine, 2010).6.1.1.Cystite aigue simpleFemme entre 15et65 ans, sans facteur de risque, épisode isolé, en dehors de lagrossesse, en l"absence de diabète, sans insuffisancerénale, sujet non immunodéprimé,sans anomalie de l"appareil urinaire, sans résidu vésical, sans vessie neurologique , sanscalcul, sans sonde à demeure, sans intervention endoscopique récente(Flam,1998).6.1.2.Cystite aigue compliquéeA tous les âges en fonction des situations et facteurs de risque ci-dessous :-uropathie malformative ou obstructive-sondage urinaire

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-immunosuppression, diabète, insuffisance Rénale-grossesse-cystites à répétition (> 4 épisodes/an)-résiduvésical > 100 ml (Bitton,2007)6.2.ProstatiteEstune inflammation de la prostate causée par des agents infectieux (bactéries,champignons, mycoplasmes) ou pa r un e affect ion ( par exe mple rétrécisse ment del"urètre, hyperplasie de la prostate). Le germe en cause:Escherichia coli(Moreddu,2007).6.3.Lapyélonéphrite aigueEst une inflammation microbienne du bassinet associée à l"envahissement del"interstitium rénal par des trainées de néphrite interstitielle suppurative. Le terme depyélite ne devrait pas être utilisé, car lorsqu"existe une infection du bassinet on trouvetoujours une infection des zones adjacentes du tissu rénal.Unepyonéphrite est un abcèsdu rein.Ils"agit en fait le plus souvent d"un aspect évolutif de la pyélonéphrite, danslequel les lésions ont fini par s"excaver.Unepyonéphrose est l"infection des cavités et du parenchyme rénal en amontd"un obstacle.Il s"agit d"une affection chirurgicale, nécessitantdrainage de la voieexcrétrice dans les délais les plus brefs (Meyrier etal.,2007).

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Figure2:Formestopographiquesdestypes d"infection urinaire(Moreddu,2007)7.Facteurs favorisants l"infection7.1. Facteurs liés aux bactéries7.1.1.Facteursde virulencebactérienne*Toutes les souchesd"E.coline sont pasuropathogènes. Il semblenécessairepour qu"une souche devienne pathogène, qu"elle soit du groupe O, qu"elle produise unehémolysine et une colicine et enfin qu"elle soit porteuse de l"antigène CAPA(CapsularAcidic Polysaccharide Antigène)7.1.2.Adhérencesbactériennes et colonisationLessouchesd"E.colipathogènesadhérentaux cellules de l"épithélium du basappareil urinaire par l"intermédiaire de pili. Il existe deux types de pili: les pili de type1sont présentes chez laplupart des bactéries uropathogènes.Lespili de type P sontretrouvéschez la plupart des souches d"E.coliresponsables de pyélonéphrite(Desgrandchamps, 2008).

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Figure2:Formestopographiquesdestypes d"infection urinaire(Moreddu,2007)7.Facteurs favorisants l"infection7.1. Facteurs liés aux bactéries7.1.1.Facteursde virulencebactérienne*Toutes les souchesd"E.coline sont pasuropathogènes. Il semblenécessairepour qu"une souche devienne pathogène, qu"elle soit du groupe O, qu"elle produise unehémolysine et une colicine et enfin qu"elle soit porteuse de l"antigène CAPA(CapsularAcidic Polysaccharide Antigène)7.1.2.Adhérencesbactériennes et colonisationLessouchesd"E.colipathogènesadhérentaux cellules de l"épithélium du basappareil urinaire par l"intermédiaire de pili. Il existe deux types de pili: les pili de type1sont présentes chez laplupart des bactéries uropathogènes.Lespili de type P sontretrouvéschez la plupart des souches d"E.coliresponsables de pyélonéphrite(Desgrandchamps, 2008).

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Figure2:Formestopographiquesdestypes d"infection urinaire(Moreddu,2007)7.Facteurs favorisants l"infection7.1. Facteurs liés aux bactéries7.1.1.Facteursde virulencebactérienne*Toutes les souchesd"E.coline sont pasuropathogènes. Il semblenécessairepour qu"une souche devienne pathogène, qu"elle soit du groupe O, qu"elle produise unehémolysine et une colicine et enfin qu"elle soit porteuse de l"antigène CAPA(CapsularAcidic Polysaccharide Antigène)7.1.2.Adhérencesbactériennes et colonisationLessouchesd"E.colipathogènesadhérentaux cellules de l"épithélium du basappareil urinaire par l"intermédiaire de pili. Il existe deux types de pili: les pili de type1sont présentes chez laplupart des bactéries uropathogènes.Lespili de type P sontretrouvéschez la plupart des souches d"E.coliresponsables de pyélonéphrite(Desgrandchamps, 2008).

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7.2.Facteursliésàl"hommeCes facteurs sont surtout représentés par :• Les modifications hormonales chez la femme (ménopause ; périodes pré-etpostemenstruelles).•Les infections gynécologiques àchlamydia ouàmycoplasmes, qui fragilisent lamuqueuse vaginale et modifient la flore bactérienne vaginale.• L"insuffisanceou surtout les excès d"hygiène périnéale.• Les anomalies anatomiques ou fonctionnelles de l"appareil urinaire (tumeurs, lithiase,reflux vésico-urétéral, diverticules vésicaux).•La stase urinaire par compression extrinsèque (grosse sse, prol apsus génital,hypertrophie prostatique).• Les corps étrangers (sondage ou endoscopie).• Certains terrains (diabète, immunodépression) (Bouvenot,2012).8.Moyens de défense de l'hôteTous les mécanismes de défense ne sont pas bien connus, maisquelques-unsontétésidentifiés (Lobelet claud, 2007).-Les mécanismes liés à la physiologie de l"appareil urinaire: le volume deflux urinaire, la vidange régulière et complète dela vessie 2 à 4 fois par jourquiestle moyend"expulsion des germes.-Les mécanismes liés à l"urinecomme le pH des urines et sonosmolarité.-Les facteurs biologiques surtous les mécanismesanti-adhérences des germesaux muqueuses et la sécrétion d"anticorps.-Les sécrétionsvaginales dela femme, et prostatiquesde l"homme.9.Réservoir de germes9.1.Réservoir endogèneLesréservoirs endogènes proviennent de l"organisme. L"infection d"origineendogèneou interne estdueà la propre flore du patient (flore vaginale) ; constituée parles microorganismes abrités par son corps. Habituellement le corps vit en symbiose aveccette flore;sauf dans certaines circonstances ou l"organisme va devenir sensible à cesgermes etdévelopper un état pathologique. Parmi ces circonstances on retrouve le plus

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souvent l"immunodépression du patient oula réalisation d"actes invasifs(Siebert etCrouzilles,2012).9.2.Réservoir exogèneLes réservoirs exogènes sont les éléments de l"environnement comme l"eau, lesaliments, les locaux ou encore une personne colonisée par un micro-organisme ; maisqui ne présente pas des signes pathologiques ;il est alors appelé " porteur sain ». Al"hôpital; il s"agit d"éléments tels que les surfaces externes, le matériel contaminé oud"autre patients infectés situés à proximité du patient (Brizon,1998).10.Voies de contamination10.1.Infection communautaireIl s'agit d'une infection urinaire survenant endehors d'une structure de soins(Marrhich,2008).10.2.Infection nosocomialeUne IU est dite nosocomiale lorsqu'elle est acquise dans une structure desoins,ou bien reliée à la prise en charge dupatient, et causée par desmicroorganismes dontl'origine est hospitalière. Elle peut concerner lespersonnes séjournant, visitant outravaillant à l'hôpital (Eilenberg,2005).Chezles patients sondésL'entrée des germes dans la vessie peut se faire de deuxfaçons :-soit par voie endo-luminale (à l'intérieur de la sonde),-soit par voie extra-luminale (sur la face externe de la sonde) (Maki, 1981).I.Examen cytobactériologique des urinesL"examencytobactériologique des urines (ECBU)est réalisé à partir du recueildes urines fraiches du matin en vue d"une étude:-cytologique: globules rouges, globules blancs, cristaux, cellules épithéliales-bactériologique: bacillesàGRAM négatif etàGRAMpositif et les cocci(Chalopin etChabannes, 2008).

Chapitre 1Etude bibliographique

L"avantage de l"ECBU réside en:-affirmation dudiagnostic d"infection des voiesurinaires ou de pyélonéphrite(lors de pollakiurie, douleurs mictionnelles,urines troubles, fièvre sanscausesévidentes, douleurs lombaires avec fièvre, lithiase urinaire,...);-assurer un contrôle systématique chez les personnes à risque(commeporteur desonde urinaire, personnes diabétiques avec prurit urinaire, femme enceinte ...);-pour guider ou ajuster le traitement grâce à l"antibiogrammeet de contrôler sonefficacitéetévaluer la qualité des soins en matière de prévention des infectionsnosocomiales (indicateur objectif) (Chalopin et Chabannes, 2008).

ChapitreIIMatériel et méthodes

Chapitre 2Matériel et méthodes

Notre étude a été réalisée au niveau du laboratoire d"analyses médicales HIBA,situé dans lacommune d"El-khroub wilaya de Constantine.L"études"est étendue surunepériodede neuf semaines, du1mars au 2 mai 2017au niveau de la sectionbactériologie.1.PrélèvementLes prélèvements sont réalisés de préférencesur la premièreurinedumatinàdomicile ouà l"hôpital ettransportés rapidement aulaboratoireà 4°C.1.1.Chez les sujets coopératifsL"urine doit être recueillie dans un récipient stérile et sec ne contenant pas detraces de détergent ou d"antiseptique (Pilly, 2016).Après lavagehygiéniquedes mainset toilette soigneuse au savon ou antiseptique doux de la région vulvaire chez la femmeet du méat chez l'hommesuivi d'un rinçage,éliminer le premier jet (environ les20premiersmillilitres) d'urines pour ne recueillir dans lerécipientstérile que les urines dudeuxième jeten prenant soin de ne pas toucherlesbordssupérieursdu récipient(Carbonnellet al., 1990).1.2.Chez les sujets non coopératifsLe sondage vésicalest réservé auxgrabataires ; comateux ; oliguriques ou enrétention aigue. Il est réaliséavec une sondestérile, le manipulateur doit être muni decanaux stériles(Carbonnellet al., 1990).2.Transport des urinesLe transport au laboratoire doit être effectué dans des conditions adéquates,enrespectant la duréeet la température (moins de 2 heuresetà température ambiante)afind"éviter une éventuelle contamination qui par la suite gêneral"interprétation de l"ECBU(Bruyére etCariou,2008).Pouréviter la multiplication bactérienne, la mise en culturedoit êtreadressée rapidement au laboratoire ou une conservation de l"échantillon à 4°Cdoit être utilisée(Flam, 1998).

Chapitre 2Matériel et méthodes

3.Manipulationsau laboratoire3.1.EtiquetageAu laboratoire, les échantillonsreçussontsoigneusement étiquetés. Chaqueétiquette doit contenirlenom etprénomdu patient,lenuméro d"ordre,ladate,l"heureetl"âge.3.2.Examen macroscopique des urinesL'aspect et la couleur des urines, la présence ou l'absence de pus ou de sangdoivent être appréciés (El manni etal.,2004).Cet examen est porter sur la couleurd"urine; une urine jaune clair est normale mais un aspect trouble peut être dueàuneinfection urinaire ou la présence des cristaux qui sont d"origine alimentaire ouà la prisede certainsmédicaments(Konan,1992).3.3.Examen à la bandelette urinaireLes bandelettes urinaires ne sont utiles que chez les patients non sondés. Ellespeuvent être suffisantes dans la prise en charge des cystites simples chez la femme nonenceinte. Cependant l"examen cytobactériologique desurines (ECBU) est plus sensibleque les bandelettes urinaires pour diagnostiquer les infections urinaires. Elles sont utilesaussi pour le débrouillage en cas de symptômes atypiques(Pilly, 2014), mais elles neremplacent ni l"examen microscopique ni les cultures.Le test se compose d"une bandelette présentant des zones réactives de chimiesèche permettant de rechercher dans l"urine la présence qualitative et/ou semi-quantitative de différents paramètres tels que les leucocytes, les nitrites, le pH, lesprotéines, le glucose, les corps cétoniques, l"urobilinogène, la bilirubine, lesérythrocytes (ou le sang) et le poids spécifique (densité)(Borghinietal.,2002).Pour se faire, l"urine est correctement homogénéiséeen tournant lentement, àplusieursreprises, le gobelet. La bandeletteest immergéeuneseconde (au maximum)dans l"urine en humectant entièrement toutes les zones réactives.NB:Il nefautjamais verser l"urinesur la bandelette à l"aide d"une pipettepuis égoutterrapidement en passantla tranche de la bandelette sur un papier absorbant afin desupprimer l"excédent d"urine.

Chapitre 2Matériel et méthodes

La lecture de labandelette se faitvisuellement enlecomparantavec la gammecolorimétriqueindiquée sur l"emballage.-Après 1 minute, lire les résultats pour les nitrites, le pH, les protéines, le glucose, lescorps cétoniques, l"urobilinogène, la bilirubine et le sang.-Après 2 minutes, lire le résultat pour les leucocytes. Les résultatssont notésavec lesunités correspondantes sur le rapport d"analyse.L"interprétation des réactions chimiques est très sensible et peut engendrer des "faux positifs ». En particulier des médicaments, un apport alimentaire important ennitrites ou fortement coloré (betterave rouge),des quantités importantes de vitamine Cet des tracesd"antiseptiques ou de chloréxidine peuvent engendrer des résultatsfaussement positifs(Borghiniet al.,2002).3.4.Examen cytobactériologique des urinesC"est l"examen le plus utilisé pour détecter lesinfections urinaires. Après leprélèvement, l"échantillon sera examiné au microscope sans et avec une coloration deGram. L"urine est ensuite mise en culturepour la numération des germes etl"identification bactérienne.L"ECBU doit êtrepratiquéavant toute antibiothérapie. Il estréalisé en présence desymptômesurinaires, pour confirmer ou infirmer le diagnosticd"infection urinaire. Il peutêtreindiqué en absence desymptômedans le cas d"uneimmunodépression, geste urologique programmé, grossesse...(Pilly, 2014).Il repose sur un examen microscopique minutieux et une interprétationrigoureuse de la culture bactérienne.La réalisation de l'ECBU comprend les différentesétapes indiquées dans le schéma ci-dessous.

Chapitre 2Matériel et méthodes

Figure3:Schémarécapitulatif des différentes étapes de l"ECBU(Le REMIC,1998).3.4.1.Examen cytologique3.4.1.1.Examen cytologiquequantitatifL"examen microscopique est la meilleure méthode pour la détection deséléments présents dans l"échantillon d"urine tel que les hématieset les polynucléaires;les cristaux; les levures; les cylindres et aussi la présence de germes. Leurdénombrement est réaliséen déposant un volume précis d"urineentre une lame etlamelle, ensuite la lame sera examinéeà l"état fraissous microscope àl"objectif x40. Lenombredes éléments présentsest rapporté au ml.3.4.1.2.Examen cytologiquequalitatifLa coloration de Gram réalisée à partir du culot de centrifugationpermetd'observerles microorganismeséventuellementprésents et oriente le choix desmilieuxde culture selon leurs morphologies et leurs affinitésaux colorants.Une autre méthode peut aussi être réalisée avec une coloration au bleu deméthylène. Pour cela lesurines sont centrifugées pendant 15 minutes à 3.000 tours/min.Le culotestétalésur une lame, ensuitefixé par la chaleur puis coloré avec le bleu deméthylène. L"observation se fait au microscope optique à l'objectif à immersion (x100).

Chapitre 2Matériel et méthodes

3.4.2.Examen bactériologiqueLa mise en culture répond à un double objectif : isolement et numération desbactéries. C"est la seule méthode qui permet une identification exacte desmicroorganismes qui colonise l"urine. Une très grande majorité de bactériesresponsables d"infection urinaire ne sont pas exigeantes et sont cultivées sur géloseordinaire, gélose nutritive(Lacheheub et Bendagha,2016).3.4.2.1.Ensemencement des urinesA l"aide d"une anse calibrée,une goutte d"urine est ensemencée sur une gélosenutritive (GN) (annexe 1)parcetteméthodepour avoir des colonies bien isolées. Lalecture se fait après 24h d"incubationvoire48hà 37°C.3.4.2.2.Dénombrementdes microorganismesL'analysequantitative de la bactériurie peut être réalisée soit par la dilution desurines, soit par la technique de l'anse calibrée ou encore par la méthode de la lameimmergée (Le REMIC, 1998).Un milieu de culture est ensemencé à partir de l"urinehomogénéisée.Plusieurs types de milieux de culture peuvent être utilisés (milieuxchromogènes type CPS, CLED...) (Leroy et Mariani-Kurkdjian, 2004).Dans cette étude, on a utilisélatechniquede l"anse calibrée pour dénombrerlescolonies.L"état frais a un rôleimportant pour le choixdu milieu de culture;le milieuleplusutilisé est la gélose nutritive (GN),la majorité des bactéries responsables del"infection urinaire peuventêtrecultivéesurce milieu telqueles bacilles,les cocci etaussi les levures.Onutilisera une gélose au sang s'il y a présomption de bactériesexigeantes.L"ensemencement est réalisé en prélevant une goutte de l"échantillonà l"aided"une anse de platineet ensemencésur la surface de la GN.Selon l"observation de la coloration deGram, d"autres milieux peuvent êtreensemencéstels que: gélose au sang (Corynebacteriumurealyticum), gélose chocolat(Haemophilussp...), Sabouraud (Candida sp.). Après une incubation de 24 jusqu"à 48h( en fonct i on du germe ), l"anal yse microbiol ogique estpoursuivie en fonction del"interprétation cytobactériologique, des renseignements cliniques et biologiques etd"éventuels examens antérieurs (Leroy et Mariani-Kurkdjian, 2004).

Chapitre 2Matériel et méthodes

3.4.2.3.Observation des cultures et différentiation des coloniesL"observation macroscopique des cultures se fait en décrivant la forme et lataille des colonies, l"opacité et l"aspect de la surface, ainsi que la consistance et lapigmentation des colonies.3.4.2.4.Identification bactérienneL"identification de la bactérie est menée en fonctionde la morphologie descolonies, et des premiers caractères biochimiques d"orientation, propres à chaque espèce(production d"une catalase, d"une oxydase, fermentation de certains sucres, etc.)(Leroyet Mariani-Kurkdjian, 2004)(Le REMIC, 1998).a.Recherchedela catalaseLa catalase est une enzymeprésente chez la plupart des bactéries aérobiesstrictes et anaérobies facultatives,Elle décompose l"eau oxygénée formée, en eau et enoxygène.La recherche de cette enzyme estutiliséepour l"identification des bactéries àGram positif et pour le staphylocoque.Dans un tube à hémolysedeux gouttesd"eau oxygénéestabiliséesont déposées,puisàl"aide d"unepipette pasteurla suspensionbactérienneestajoutée. L"observationdurésultat est immédiate.Après l"addition d"eau oxygénée ; lorsque on observe un dégagement gazeuxcela signifie la présence de l"enzyme catalase. Par contre l"absence du dégagementgazeux signifie l"absence de l"enzyme.b.Recherchede la coagulaseLacoagulase est une enzyme capable de coaguler le plasma sanguin. Lamiseenévidence de la staphylocoagulaseest un critère d"identificationdes staphylocoques.Dans un tube à hémolyse stérile, 1 ml de plasma sanguinadditionnéde 1 mld"une suspension bactérienne de la souche à étudiersont déposés. Le mélange estincubéà 37°C pendant 4 à 5 heures.

Chapitre 2Matériel et méthodes

La réaction estconsidéréecomme positif lorsquele plasma est coagulé,donc lefibrinogène a été transformé en fibrine, cela permet de confirmerque le germe est unStaphylococcus aureus.Si le plasma ne coagule pas, cela indique une espèce autre queStaphylococcus aureus.c.La galerie biochimiqueLa galerie API 10S (Biomérieux ) e st une gale ri e de 10 mic rotubes p rêts àl"emploi contenant unsubstratdéshydraté, permettant de réaliser10testsbiochimiquesafin d"identifier des bacilles à Gram (-) appartena nt à l a famill e desEnterobacteriaceae.Elle ne doit pas être utilisée directement à partir des prélèvementsd"origine clinique ou autre. Les microorganismes à identifier doivent dans un premiertemps être isolés sur un milieu de culture adapté selon les techniques usuelles debactériologie. Cette galerie estune versionsimplifiée de la galerie API 20 E :10 tests aulieu de 20(la réaction del'oxydase constitue le 11ème test et la réduction des nitrates ennitrites (NO2) le 12ème):-ONPG:Ce test permet de rechercher la présence d'une enzyme intracellulaireβ-galactosidase(ONPG hydrolase) qui permet l'hydrolyse dulactose en glucose etgalactose(Veron,2000).-GLU:On recherche l'utilisation (pa r voi e oxydati ve ou fermentative ) duglucose, se traduisant par une modification du pH du milieu faisant virerl'indicateur coloré de pH présent.-ARA:On recherchel'utilisation d"arabinose se traduisant par une modificationdu pH du milieu faisant virer l'indicateur coloré de pH présent.-LDCetODC:Les décarboxylases bactériennes sont des enzymes quicatalysent les réactions dedécarboxylation desacides aminés.Elles sont misesen évidence grâce auxproduits alcalins formés (amines)détectés à l'aide d'unindicateur de pH.Cesenzymes ont un intérêt pour l'identification bactérienne(différenciation des entérobactéries et autres bacilles à Gram négatif).-CIT:Seules les bactéries possédantunecitrate perméase peuvent utiliser lecitrate comme seule source de carbone. La lecture de l"utilisation du citrate

Chapitre 2Matériel et méthodes

comme seule source de carbone est possible grâce à la présence d"un indicateurde pH (le bleude bromothymol)et un seul composé carboné (citrate de sodium).-H2S:Lamiseen évidence de laproductiond'H2S se fait grâce à la présencedethiosulfate de sodium et decitrateferrique(fer III). En effet, chez une souchedite H2S positif, le thiosulfate est réduit en anaérobiose en H2S.L'H2Sformé secombine aveccitratede fer présent pour former unprécipité de sulfure de fernoir.-URE:L"uréase est une enzyme hydrolysant l"urée.Dans le cas d"uneuréasepositive,la coloration rougesetraduitparune alcalinisation du milieu suiteàl'hydrolyse de l'urée etla formation ducarbonate d'ammonium.Si le milieupersisteorange cela signifie qu"il n"y aitpas d"alcalinisationet le test est alorsnégatif(Guillaume,2004).-TDA:Onrechercheune enzyme, laTryptophane Désaminase, en mettant enévidence la désaminationdutryptophane en acide indole-pyruvique et NH3,révélé par un précipité bruncaractéristique après ajout duchlorure de fer.-IND:Après addition du réactif de Kovacsdans la cupule, le diméthyl-amino-4-benzaldéhyde contenu dans le réactif de Kovacs réagit avec l'indole, produit del'activité de la tryptophanase, et forme un composé coloré en rouge(Guillaume,2004).-OX:On recherche la présence d"un cytochrome oxydase.-NO2:On recherche la présencedunitrateréductase.L'ensemencement se déroulede la façon suivante :Premièrement, lefond etlecouvercle d"une boitepréciserd"incubationsontréunis. Environ 3 ml d"eau distilléesont répartisdans l"alvéole pour créer uneatmosphère humide, lagalerieest placéedans la boited"incubation.Aprèsavoir préparé la galerie, etàl"aide d"une pipette pasteur,une ou deuxcoloniesbien isoléessur GNsont prélevées.Unesuspension bactérienneest doncréaliséeen homogénéisant soigneusement les bactériesdans le milieu.

Chapitre 2Matériel et méthodes

La suspension bactérienne estintroduitedans les tubes de la galerie à l"aide de lamême pipette(pour éviter la formation de bulles d"air au fond des tubes, la pointe de lapipette est posée sur le côté de la cupule en inclinant légèrement la boite d"incubationvers l"avant).Pour le testutilisation ducitrate, letube etlacupulesonttous les deuxremplis.Par contre pourles autres testsuniquementletubeest rempli.Pour les tests LDC,ODC, UREEetH2Sl"anaérobioseest créée en remplissantles cupules parl"huile deparaffine. La boite d"incubation est ensuite refermée etincubéeà37°C pendant 24h.Après incubation,la lecture de la galerie doit se faire en se référant au tableau delecture (voir annexe2).L'identification est obtenuesoit par une approchedichotomique, soit parutilisation du codage API (profil numérique)ou parapproche probabiliste utilisant unlogiciel informatique.Dans cette étudela détermination du profil numériqueest réalisée(ex: 7504Klebsiellapneumoniae)Sur la fiche derésultats, les tests sont séparés pargroupes de trois et une valeur1, 2 ou 4 est indiquéepour chacun.Si le test est positif, la valeur indiquée est attribuéedans la case (1, 2 ou 4) mais si le test est négatif, la valeur "0" est attribuée.Comme il aété déjà mentionné auparavant, la galerie API 10S comportant 10 tests,en additionnantà l'intérieur de chaque groupe lesvaleurs correspondant à des réactions positives, unprofil numérique à 4 chiffres est obtenu. (La réaction del'oxydase constitue le 11èmetestet la réduction desnitrates en nitrites (NO2) le 12ème).Identificationest réaliséeàl'aide du profil numérique, la rechercheduprofilsefaitdans la liste de la notice(voir figure 4).

Chapitre 2Matériel et méthodes

Figure 4:Profilnumérique deKlebsiellapneumoniaed.AntibiogrammeLorsqu"une bactérie est isoléeàpartir d"un prélèvement ;On doit cherchersasensibilité aux antibiotiques. Ce test est capital, il permet de choisir un antibiotiqueadéquat pour le traitement de l"infection urinaire.La première étape à réaliser dans l"antibiogramme est la préparation etl"ajustement de l"inoculum.A partir d"une culture de 24heures sur le milieu de culture ordinaire (GN),uneou plusieurscoloniesbien isoléessontprélevéesetémulsionnéesdansuntubecontenant5ml d"eau physiologiquestérile de manière à réaliser une suspensiond"opacité équivalente à celle de l"étalon 0.5 de l"échelle de Mac Farland qui correspondà 1-3. 108bactéries/ml.Au fait il existe deux méthodes d"ensemencement possibles: ensemencement dumilieu par inondation préconisée par Sanofi Diagnostics Pasteur, et ensemencement dumilieu par écouvillonnage qui est la méthode de Kirbey-Bauer.Dans cette étude on a utilisél"ensemencement d"écouvillonnage qui consiste àplonger un écouvillon stérile dans la suspension, il est ensuite sorti du tube en l"essorantdoucement sur les paroisinternes du tube. Une boite contenant le milieu decultureMuller Hinton est ensemencée en traçant des stries sur toute la surface de lagélose parl"écouvillon. La boite est ensemencée 3 fois en la tournant de 60°à chaquefoisafin d"assurer une bonne distribution de l"inoculum.A la fin,l'écouvillonest passésur les bords de la gélose.Les disques d'antibiotiques sont posés sur les boîtesà l"aided"une pince stérileen appuyantlégèrement pour assurer le contact avec le milieu.Onpeut placer au maximum six disques sur une boîte.Les boites sont laissées pendant3minutes à température ambiante pour une meilleurediffusion de l"antibiotique àpartirde son disque, puis incubéespendant24heuresà 37°C.

Chapitre 2Matériel et méthodes

Figure 4:Profilnumérique deKlebsiellapneumoniaed.AntibiogrammeLorsqu"une bactérie est isoléeàpartir d"un prélèvement ;On doit cherchersasensibilité aux antibiotiques. Ce test est capital, il permet de choisir un antibiotiqueadéquat pour le traitement de l"infection urinaire.La première étape à réaliser dans l"antibiogramme est la préparation etl"ajustement de l"inoculum.A partir d"une culture de 24heures sur le milieu de culture ordinaire (GN),uneou plusieurscoloniesbien isoléessontprélevéesetémulsionnéesdansuntubecontenant5ml d"eau physiologiquestérile de manière à réaliser une suspensiond"opacité équivalente à celle de l"étalon 0.5 de l"échelle de Mac Farland qui correspondà 1-3. 108bactéries/ml.Au fait il existe deux méthodes d"ensemencement possibles: ensemencement dumilieu par inondation préconisée par Sanofi Diagnostics Pasteur, et ensemencement dumilieu par écouvillonnage qui est la méthode de Kirbey-Bauer.Dans cette étude on a utilisél"ensemencement d"écouvillonnage qui consiste àplonger un écouvillon stérile dans la suspension, il est ensuite sorti du tube en l"essorantdoucement sur les paroisinternes du tube. Une boite contenant le milieu decultureMuller Hinton est ensemencée en traçant des stries sur toute la surface de lagélose parl"écouvillon. La boite est ensemencée 3 fois en la tournant de 60°à chaquefoisafin d"assurer une bonne distribution de l"inoculum.A la fin,l'écouvillonest passésur les bords de la gélose.Les disques d'antibiotiques sont posés sur les boîtesà l"aided"une pince stérileen appuyantlégèrement pour assurer le contact avec le milieu.Onpeut placer au maximum six disques sur une boîte.Les boites sont laissées pendant3minutes à température ambiante pour une meilleurediffusion de l"antibiotique àpartirde son disque, puis incubéespendant24heuresà 37°C.

Chapitre 2Matériel et méthodes

Figure 4:Profilnumérique deKlebsiellapneumoniaed.AntibiogrammeLorsqu"une bactérie est isoléeàpartir d"un prélèvement ;On doit cherchersasensibilité aux antibiotiques. Ce test est capital, il permet de choisir un antibiotiqueadéquat pour le traitement de l"infection urinaire.La première étape à réaliser dans l"antibiogramme est la préparation etl"ajustement de l"inoculum.A partir d"une culture de 24heures sur le milieu de culture ordinaire (GN),uneou plusieurscoloniesbien isoléessontprélevéesetémulsionnéesdansuntubecontenant5ml d"eau physiologiquestérile de manière à réaliser une suspensiond"opacité équivalente à celle de l"étalon 0.5 de l"échelle de Mac Farland qui correspondà 1-3. 108bactéries/ml.Au fait il existe deux méthodes d"ensemencement possibles: ensemencementquotesdbs_dbs35.pdfusesText_40

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