[PDF] Thèse Florent Badiqué cellules cancéreuses alors que

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THESE

Pour obtenir le grade

de Docteur de l'Université de Haute Alsace,

Spécialité Biologie Cellulaire

Florent BADIQUE

Mécano-biologie de cellules cancéreuses

Institut de Sciences des Matériaux de Mulhouse, CNRS UMR 7361, Mulhouse

Unité INSERM U1113, Strasbourg

Thèse soutenue le 16 Décembre 2013

Rapporteur: Pr Benoit LADOUX Institut Jacques Monod, Paris Rapporteur: Dr Daniel ISABEY Institut Mondor de Recherche

Biomédicale, Créteil

Membre du jury: Dr Michelina PLATEROTI Centre de Génétique et de

Physiologie Moléculaire et

Cellulaire, Villeurbanne

Directeur de thèse: Dr Karine ANSELME Institut des Sciences des

Matériaux de Mulhouse

Co-directeur de thèse: Dr Jean-Noël FREUND INSERM, Strasbourg

Résumé: Le travail présenté dans cette thèse est le résultat d'une collaboration fructueuse

entre la chimie, la physique et la biologie. En effet, des matériaux avec des

propriétés physico-chimiques très contrôlées ont été mis à profit dans le but de

caractériser des fonctions cellulaires complexes. Nous présentons tout d'abord la création d'un outil permettant l'étude de la mécanotransduction cellulaire. L'originalité de cet outil est basé sur son activation par étirement permettant de lier réversiblement les cellules à la surface. Nous avons ensuite étudié des comportements de cellules souches et cancéreuses en réponse à des microtopographies sous forme de piliers. Cette approche a permis de définir un comportement cancéreux caractérisé par une déformation prononcée des corps et noyaux cellulaires. Nous montrons aussi que l'utilisation de cette surface couverte de micro-piliers permet de décrire la mécano-biologie de cellules cancéreuses. En effet, ce substrat à topographie contrôlée a permis de montrer que la chimie et la rigidité du substrat n'ont que peu d'incidence sur la déformation des cellules cancéreuses, alors que les éléments du cytosquelette sont primordiaux et que sans eux, la déformation n'est pas possible. Nous avons ensuite inhibé une à une des protéines de l'enveloppe et de la lamina nucléaire afin d'évaluer leur implication dans ces mécanismes de déformation. En parallèle, un séquençage total des ARN (Acides RiboNucléiques) de cellules

déformées et non déformées a été réalisé dans le but de visualiser d'éventuelles

modifications dans l'expression génique. Ces déformations des cellules cancéreuses entre les micro-piliers ont été comparées à celles que subissent les cellules lors de la traversée de membranes poreuses (Chambres de Boyden). Ces comparaisons nous ont permis d'identifier que plusieurs mécanismes peuvent aboutir à la déformation de cellules cancéreuses et en particulier de leurs noyaux. Nous montrons dans une dernière partie que la mitose cellulaire s'effectue sur les surfaces microstructurées. Nous décrivons une ségrégation des chromosomes qui semble être non parallèle. Toutefois, ces divisions atypiques ne causent pas davantage d'accidents mitotiques.

Mots clés

: Micro-piliers, cancer, déformation cellulaire, déformation nucléaire, mécanique cellulaire, mécanotransduction, cytosquelette, chambre de Boyden.

Abstract:

The work shown in this thesis is the outcome of a successful collaboration between chemistry, physics and biology. Indeed, materials with well controlled parameters have been used in order to characterize complex cellular functions. We first introduce the creation of one tool which allow the study of cells mechanotransduction. The originality of this tool is based on its activation by stretching which allow a reversible adhesion of cells to the surface. Then, we studied the behavior of stem cells and cancerous cells on micropillared surfaces. This approach allowed us to describe a cancerous behavior of cells characterized by strong deformations of cells bodies and nuclei. We also showed that the use of such micropillared surfaces allowed us to describe cancerous cells mecanobiology. Indeed, this substrate with a well controlled topography allowed us to show that substrates chemistry and stiffness have only little effects on cancerous cells deformation while cytoskeleton components are necessary. More specifically, the deformation is impossible without the cytoskeleton. We also inhibited the nuclear envelope proteins and nuclear lamina proteins in order to evaluate their involvement in cells deformation mechanism. In the same time, a total RNA (RiboNucleic Acids) sequencing of deformed and non deformed cells have been done in order to identify an eventual modification in gene expression. These deformations of cancerous cells between micropillars have been compared to the deformation of cells during the transmigration through porous membranes (Boyden chambers). These comparisons allowed us to identify several mechanisms which lead to cells deformation and more specifically to nuclei deformation. We showed in a last part that cells can divide on micropillared surfaces. We described a non parallel like segregation of chromosomes. However, these unusual mitosis didn't lead to supernumerary troubles in cell division.

Key words:

Micropillars, cancer, cellular deformation, nuclear deformation, cellular mechanic, mechanotransduction, cytoskeleton, Boyden chambers. Remerciements: Dans un premier temps je souhaite remercier Karine Anselme et Jean-Noël Freund qui m'ont recruté à un moment difficile de ma formation. Ils ont su me guider et me conseiller tout au long de mon travail de thèse. Je me considère vraiment chanceux d'avoir eu l'occasion d'être formé au côté de brillantes personnes comme eux. J'ai pu ainsi m'intégrer à la communauté scientifique et profiter d'un environnement pluridisciplinaire propice à un travail de qualité. Je remercie aussi notre directrice de l'établissement Cathie Vix qui entretient dans l'institut un climat de travail très agréable et une qualité scientifique reconnue. Je remercie toutes les personnes qui m'ont permis au quotidien de travailler dans d'excellentes conditions. Je pense à Joelle Dangy, Sylvie Forget, Fabienne Sorgato, Eric Ehrhard, Louisa Idiri et Natalina Muller qui ont toujours répondu présents quand j'avais des questions d'ordre administratif. Pour les aspects techniques je veux saluer Luc Delmotte, Cyril Geney, Stephane Knopf, Fernand Wieder, Philippe Fioux, Simon Gree et Patrick Lamielle qui ont toujours été prompts à trouver des solutions efficaces là où le biologiste perdait pied. Je tiens aussi à remercier mes nombreux collaborateurs grâce auxquels j'ai appris énormément. Dimitar Stamov et Clemens Franz de Karlsruhe grâce à qui notre travail sur la mécanique cellulaire a pu être sublimé. Vincent Roucoules, Pierre Schaaf et surtout Jalal Bacharouche avec qui nous avons montré que l'adhésion

cellulaire peut être contrôlée par étirement d'un substrat. Je veux aussi dire merci à

Sylvain Gabriele, Marie Versaevel et Thomas Grevesse pour leur accueil chaleureux en Belgique et pour les discussions que nous avons eu. Merci à Mélanie Eichhorn, Eleonora Grespan, Gunter Reiter et Nicolas Elvassore pour leurs discussions et le travail effectué ensemble. Je tiens aussi à remercier nos collaborateurs de Copenhague, Trine Berthing, Sara Bonde, Kristian Andersen et Karen Martinez qui font un travail remarquable sur les nanofils. Merci à Gladys Pozza et Pierre Lutz pour leur collaboration. Je veux aussi remercier Olivier Soppera, Fabrice Stehlin et Arnaud Spangenberg pour nos nombreuses discussions qui m'ont permis d'apprendre

énormément. Merci aussi à Lili Wolfrom qui m'a aidé à évoluer au sein de l'Inserm à

Strasbourg. Je remercie aussi Maël Le Berre et Matthieu Piel pour les discussions que nous avons eu et pour le matériel cellulaire qu'ils ont mis à notre disposition. L'enseignement est une tâche difficile et je tiens à remercier Karine Mougin et Laurent Vonna qui m'ont guidé quand j'en avais besoin. Je veux aussi saluer tous les membres de l'équipe parmi lesquels je me suis fais de nombreux amis. Merci à Félix Sima, Victor Prévost, Doris Campos, Paolo Sima, Debora Tavares, Liliane Païva, William Querido, Emilia Kulaga, Judith Bohmler, Janina Moller, Lydie Ploux et Arnaud Ponche. Un mot en particulier pour Tatiana Bourgade avec qui j'ai beaucoup travaillé pour améliorer notre travail quotidien et ce n'était pas toujours gagné d'avance! Merci enfin à Jules Valentin, mon ami, mon témoin, c'est agréable de pouvoir compter sur quelqu'un les yeux fermés. Je remercie aussi les stagiaires que j'ai encadré, Thierry Bringard, Marine Boulangé, Lise Badiqué et Mathieu Veuillet qui ont effectué un travail de qualité au sein de notre groupe. Et en particulier Mathieu qui est aujourd'hui un membre de notre

équipe.

Je ne veux pas oublier ma famille, merci à tous d'avoir toujours cru en moi pendant ces années. Merci surtout à mes parents qui m'ont toujours soutenu moralement et financièrement. Je n'en serais pas là sans eux. Merci à mon frère et à ma soeur pour leur soutien. Un salut tout particulier à mon grand père paternel qui est quelqu'un de brillant et qui n'a malheureusement pas eu les mêmes moyens que moi dans sa vie.

Cette thèse est aussi pour toi grand père, tu l'as vécu à travers moi mais je sais très

bien que tu aurais pu faire plus fort si tu en avais eu l'occasion. Enfin, je souhaite remercier ma femme. La thèse reste un parcours semé d'embuches et elle a su m'encourager et me supporter les jours où le moral n'était pas au plus haut. Je peux dire aujourd'hui que je ne ressens un sentiment de plénitude que depuis que tu es entrée dans ma vie.

Sommaire:

I. Introduction: ......................................................................................................................................... 9

I.1 La cellule: ........................................................................................................................................ 9

I.2 Adhésion cellulaire: ...................................................................................................................... 10

I.3 Cytosquelette: .............................................................................................................................. 12

I.4 Noyau cellulaire: ........................................................................................................................... 15

I.5 Complexe LINC: ............................................................................................................................ 17

I.6 Mécanotransduction: ................................................................................................................... 18

I.7 Matériaux dédiés à la biologie cellulaire: ..................................................................................... 20

I.8 De la cellule saine à la métastase: ................................................................................................ 24

I.9 Propriétés mécaniques des cellules cancéreuses: ....................................................................... 27

II. Matériels, méthodes et mises au point: ............................................................................................ 28

II.1. Fabrication de surfaces constituées de micro-piliers en PLLA et en PDMS: .............................. 28

II.1.2 Moules de PDMS: ................................................................................................................. 29

II.1.3 Supports micro-structurés de PLLA: ..................................................................................... 29

II.1.4 Supports micro-structurés de PDMS: ................................................................................... 29

II.2. Cultures cellulaires: .................................................................................................................... 31

II.2.1. Cellules hMSC: ..................................................................................................................... 31

II.2.2. Cellules F/STRO-1+ A: .......................................................................................................... 31

II.2.3. Ostéosarcomes (SaOs-2, MG-63, OHS-4): ........................................................................... 31

II.2.4. Cellules TC7: ........................................................................................................................ 31

II.3. Marquages Cellulaires: ............................................................................................................... 32

II.3.1. Marquages de cellules fixées: ............................................................................................. 32

II.3.2. Marquage des cellules en vivant: ........................................................................................ 32

II.3.3. Marquages spécifiques en vivant: ....................................................................................... 33

II.3.4. Marquages non spécifiques en vivant: ................................................................................ 33

II.4. Imagerie des substrats et des cellules: ....................................................................................... 34

II.4.1. Microscopies à épifluorescence et confocale: .................................................................... 34

II.4.2. Microscopie électronique à balayage (MEB): ...................................................................... 34

II.4.3. Analyses des images: ........................................................................................................... 36

II.4.4. Logiciels d'analyse d'images: ............................................................................................... 36

II.4.5. Quantification de la déformation: ....................................................................................... 37

II.4.6. Quantification de la transmigration: ................................................................................... 37

II.5. Inhibitions moléculaires de protéines impliquées dans la mécanique cellulaire:...................... 38

II.5.1. Inhibition par les drogues: ................................................................................................... 39

II.5.2. Tests de cytotoxicité des drogues: ...................................................................................... 41

II.5.3. Mise en place des expériences d'inhibition par les drogues: .............................................. 42

II.5.4. Inhibition de protéines impliquées dans la mécanique cellulaire par les siRNA: ................ 48

II.6. Tests de transmigration dans des chambres de Boyden: ........................................................... 48

II.6.1. Mise au point des conditions de transmigration sur cellules SaOs-2: ................................ 48

II.6.2. Comparaison des capacités de transmigration des cellules MG-63, OHS-4 SaOs-2 et TC7: 50

II.7. Etude de l'expression génique des cellules déformées: ............................................................ 50

II.7.1. Extraction d'ARN:................................................................................................................. 50

II.7.2. PCR et séquençage d'ARN: .................................................................................................. 51

II.8. Synchronisation cellulaire: ......................................................................................................... 51

II.9. Ascension et déformation des cellules SaOs-2: .......................................................................... 52

II.10. Culture des cellules sur support activable par étirement: ....................................................... 52

II.11. Statistiques: .............................................................................................................................. 53

III. Résultats et Discussion: .................................................................................................................... 53

III.1 Développement d'une surface dont l'étirement active l'adhésion cellulaire: ........................... 53

III.2 Déformations cellulaires sur micro-piliers: ................................................................................ 82

III.2.1 Observation en dynamique de cellules hMSC cultivées sur micro-piliers: ......................... 84

III.2.2 Comportements des cellules cancéreuses sur micro-piliers ............................................... 85

III.2.3 Cinétiques de déformation des cellules SaOs-2 et TC7 sur micro-piliers: ........................... 87

III.3 Origine du comportement de déformation cellulaire: ............................................................... 89

III.4 Comparaison des comportements de cellules mésenchymateuses et épithéliales cancéreuses

sur micro-piliers: .............................................................................................................................. 108

III.4.1 Organisation du cytosquelette et adhésion des cellules SaOs-2 et TC7 sur micro-piliers: 108

III.4.2 Implication de chaque composant du cytosquelette: ....................................................... 113

III.5 Evaluation du rôle du complexe LINC dans le mécanisme de déformation: ............................ 124

III.6 Etude de l'expression génique des cellules déformées et non déformées: ............................. 129

III.6.1 Analyse de l'expression de gènes impliqués dans le cancer: ............................................ 129

III.6.2 Analyse de l'expression génique globale des cellules SaOs-2 et TC7 déformées: ............ 131

III.7 Nature et déroulement du mécanisme de déformation des cellules: ..................................... 133

III.8 Comparaison de la déformation entre micro-piliers aux chambres de Boyden: ..................... 139

III.8.1 Mise au point des conditions de transmigration avec les cellules SaOs-2: ....................... 140

III.8.2 Comparaison des capacités à transmigrer des cellules SaOs-2, MG-63, OHS-4 et TC7: ... 146

III.9 Divisions cellulaires sur micro-piliers: ...................................................................................... 150

IV. Conclusions et perspectives: .......................................................................................................... 154

Abréviations: ....................................................................................................................................... 161

Bibliographie: ...................................................................................................................................... 162

I. Introduction:

Le travail présenté dans cette thèse est le résultat d'une collaboration fructueuse entre la chimie, la physique et la biologie. En effet, des matériaux avec des

propriétés physico-chimiques très contrôlés ont été mis à profit dans le but de

caractériser des fonctions cellulaires complexes et en particulier la sensibilité des cellules à leur environnement. Les techniques biologiques classiques permettent de comprendre l'effet de la chimie sur les cellules. Toutefois, la sensibilité des cellules aux paramètres physiques est peu abordable avec les outils conventionnels de la biologie. C'est pourquoi des collaborations interdisciplinaires sont nécessaires à une compréhension plus globale. La cellule est parmi les éléments biologiques les plus étudiés depuis plus d'un siècle, toutefois sa diversité et sa complexité permettent encore de lui découvrir chaque jour de nouvelles propriétés et caractéristiques. ? ? ?La cellule: La cellule est connue comme l'unité du vivant depuis 1839 avec "la théorie de la cellule" établie par Theodor Schwann. Il avait en effet décrit la cellule comme constituant de base des végétaux et des animaux. Ces cellules décrites par T. Schwann ont été nommées eucaryotes en opposition aux cellules procaryotes. Les cellules procaryotes sont des organismes unicellulaires ne présentant pas de noyau. Les cellules eucaryotes quant à elles, sont pourvues d'un noyau qui renferme l'ADN (Acide Désoxyribo Nucléique). Les cellules eucaryotes peuvent être unicellulaires comme les levures, mais le plus souvent elles sont organisées en organismes pluricellulaires. Ainsi, les végétaux et les animaux sont constitués de cellules eucaryotes. Ces cellules contiennent différents organites comme les réticulum endoplasmiques lisses et granuleux, l'appareil de Golgi, la mitochondrie et le noyau. Ce dernier organite est considéré comme le plus important. En effet, l'ADN qu'il contient est la clé de la constitution et du fonctionnement de chaque organisme. La quantité et la nature de l'ADN sont les mêmes dans chaque noyau cellulaire d'un même organisme. Un être humain adulte est formé 10

14 cellules. Pourtant, toutes les

cellules n'ont pas la même fonction. En effet, l'information génétique n'est pas utilisée, exprimée, de la même manière dans toutes les cellules. L'expression génique est adaptée pour la fonction de chaque cellule. L'acquisition d'une fonction par une cellule est nommée différenciation. Cette dernière dépend en grande partie de l'environnement dans lequel évolue la cellule (Swift J., et al., 2013). La cellule est donc une unité de base pour tous les organismes pluricellulaires douée d'une sensibilité particulière pour son environnement. En effet, la cellule est capable d'évaluer les propriétés mécaniques et chimiques de son environnement afin de s'y adapter (Vogel V. and Sheetz M., et al., 2006; Geiger B., et al., 2009). Cette sensibilité à l'environnement provient de différents acteurs situés sur la membrane

plasmique des cellules incarnés par les protéines. Ces protéines représentent le

produit final de l'expression des gènes. Elles sont le plus souvent organisées en complexes et assurent la plupart des fonctions cellulaires. Des complexes protéiques localisés à la surface membranaire assurent les rôles d'adhésion cellulaire ainsi que de reconnaissance des propriétés chimiques ou physiques de l'environnement.

I.2 Adhésion cellulaire:

L'adhésion de la cellule dépend de sa capacité à trouver des sites d'ancrage dans son environnement extracellulaire. Pour la majorité des cellules (sauf cellules circulantes et cancéreuses), l'adhésion est nécessaire sous peine d'entrer en apoptose (mort cellulaire) (Hirschfeld-Warneken V.C., et al., 2008). De plus, l'adhésion est impliquée dans de nombreuses fonctions cellulaires comme l'étalement, la migration, la progression dans le cycle cellulaire, la prolifération et la différenciation (Clark E.A. et Brugge J.S., 1995; Garcia A.J., 2005; Cavalcanti Adam E.A., et al., 2006; Zemel A., et al., 2010). Les sites d'ancrage pour les cellules se situent dans des matrices extracellulaires ou à la surface d'autres cellules (Tseng Q., et al., 2011). La membrane cellulaire est pourvue de différents récepteurs, le choix

de l'utilisation d'un récepteur plutôt que d'un autre s'effectue spécifiquement en

fonction de la nature des ligands ciblés dans l'environnement (Cavalcanti Adam E.A., et al., 2006). Ces récepteurs membranaires peuvent être constitués de cadhérines dans le cas des liaisons intercellulaires ou d'intégrines pour les liens à la matrice extracellulaire. Les cadhérines sont le plus souvent impliquées dans des liaisons homophiliques, ce qui signifie qu'elles se lient à d'autres cadhérines sur une membrane cellulaire adjacente (Yamada S. et Nelson W.J., 2007). Les intégrines,

quant à elles, peuvent adhérer à différents ligands de la matrice extracellulaire

comme la vitronectine, la laminine, le collagène ou la fibronectine (sous-unité RGD (Arginine-Guanine-Aspartate)) (Clark E.A. et Brugge J.S., 1995; Mooney D.J., et al.,

1995; Garcia A.J., 2005). Les intégrines sont constituées d'une sous-unité α qui

donne la spécificité et d'une sous-unité β qui est impliquée dans le recrutement de protéines (Clark E.A. et Brugge J.S., 1995). En fonction du ligand ciblé, différentes

intégrines sont sollicitées, par exemple, α5 β1 pour la fibronectine, αv β3 pour la

vitronectine (Cavalcanti Adam E.A., et al., 2006). La fixation d'un ligand sur un

hétérodimère d'intégrine initie le recrutement d'intégrines et de protéines

intracellulaires pour former un complexe protéique nommé point focal. Ce point focal est connu pour permettre l'adhésion cellulaire mais pas seulement. Les intégrines sont des protéines transmembranaires qui lient spécifiquement des ligands extracellulaires et qui permettent la formation de complexes protéiques intracellulaires (FigI.1). Leur petit domaine intracellulaire n'a pas d'activité enzymatique mais il permet le recrutement de protéines sur la face cytosolique de la membrane plasmique. Ces dernières sont soit impliquées dans la fixation du ???? ??: Schématisation d'un complexe d'adhésion cellulaire: représentée en terme structural avec l'organisation des principales protéines permettant la fixation du cytosquelette sur les intégrines. les protéines impliquées dans la signalisation intracellulaire se fixant aux intégrines.

E.A.et Brugge J.S., 1995.

cytosquelette (α-actinine, taline, tensine, vinculine) soit dans la signalisation intracellulaire (FAK (Focal Adhesion Kinase), paxilline) (FigI.1) (Clark E.A. et Brugge

J.S., 1995; Schwartz V.S. et Gardel M.L., 2012).

La construction du point focal est spécifique des ligands extracellulaires. La cellule peut donc adapter son comportement à son environnement grâce à ces reconnaissances. Ainsi, la signalisation en provenance des points focaux est toujours spécifique et conditionne le comportement cellulaire (Cuvelier D., et al., 2007). Geiger B., et al., décrivent que les points focaux permettent aux cellules d'évaluer la topographie, la rigidité et la biodiversité chimique de leur environnement (Geiger B., et al., 2009). Par ailleurs, la fixation du cytosquelette aux points focaux permet à la cellule d'élaborer une architecture interne sur la base d'adhésions solides. Ces constructions aboutissent à l'acquisition de la forme cellulaire qui est très souvent

liée à sa fonction. De plus, le réseau de cytosquelette contient des protéines

sensibles aux stress mécaniques (zyxine, p130cas, taline, vinculine et filamine A). Ces protéines permettent donc à la cellule d'évaluer les forces provenant du milieu extracellulaire afin de s'y adapter (Schwartz V.S. et Gardel M.L., 2012). Enfin, ces

liens physiques entre l'intérieur et l'extérieur de la cellule permettent à cette dernière

d'organiser sa matrice extracellulaire si cela est nécessaire. En effet, Hirschfeld- Warneken V.C., et al., ont par exemple montré que l'espace entre deux ligands permettant la construction d'un point focal ne doit pas excéder 58nm (Cavalcanti Adam E.A., et al., 2006). Pour s'affranchir de ce type de problème, la cellule a la capacité de construire des réseaux de fibronectine à partir de molécules en suspension. En effet, l'adhésion à la fibronectine est possible via les points focaux et le cytosquelette sous-jacent permet d'organiser les fibres néoformées (Pankov R., et al., 2000). Le réseau de cytosquelette est donc essentiel dans la mécanique cellulaire.

I.3 Cytosquelette:

Le cytosquelette est constitué de 3 composants majeurs classés en fonction de leur taille, les microfilaments d'actine (7 à 8nm), les filaments intermédiaires (10nm) et les microtubules (25nm). Le cytosquelette donne sa forme à la cellule et lui confère les capacités de se mouvoir, se déformer, se contracter et déplacer des organites ou de la matière dans son cytoplasme. C'est aussi ce réseau tridimensionnel qui confère à

la cellule ses propriétés mécaniques (Trickey W.R., et al., 2004; Ofek G., et al.,

2009). Chaque partie du cytosquelette a un rôle propre. Ces rôles sont toutefois

complémentaires et confèrent différentes fonctions à la cellule. Ainsi Sakai H., et al., ont par exemple montré que l'actine et les filaments intermédiaires sont tous deux impliqués dans la contraction de muscles lisses chez le rat (Sakai H., et al., 2009). Chaque constituant du cytosquelette a donc une constitution et des propriétés particulières. L'actine existe sous deux formes, actine G (globulaire) et actine F (Filamenteuse).

L'actine F est le résultat de la polymérisation en hélice gauche de l'actine G.

L'organisation intracellulaire de ces microfilaments dépend en grande partie du type cellulaire. L'actine peut être organisée en fibres de stress qui traversent la cellule de part en part. Si ces fibres de stress passent au dessus du noyau cellulaire, elles sont nommées "actin cap" (Khatau S.B., et al., 2010). L'actine peut aussi être organisée de façon périphérique à la cellule sous forme de fibres ou de gels (FigI.2). L'actine est très souvent décrite comme le moteur cellulaire principal, en particulier grâce à sa liaison avec la myosine. En effet, le complexe acto-myosine est connu pour être à l'origine des contractions musculaires et de la plupart des mouvements cellulaires. Les mouvements acto-myosine-dépendants résultent d'un glissement entre les filaments d'actine et de myosine (Hawkins R.J., et al., 2011). L'actine est impliquée dans de nombreuses fonctions cellulaires comme la division, la motilité, l'endocytose, l'acquisition du phénotype et la contraction musculaire (Janmey P.A., et al., 1991; Bathe M., et al., 2008; Coffman V.C., et al., 2009; Verkhovsky A.B., 2010).

IntegrinesActine

Microtubules

Myosine

Filaments

intermédiaires de types I à IV

Membrane

plasmique ???? ??: Schéma de l'organisation intracellulaire du cytosquelette cellulaire Les filaments intermédiaires sont moins conservés d'un type cellulaire à un autre que les microfilaments. Cinq types de filaments intermédiaires existent. Les kératines trouvées essentiellement dans les cellules épithéliales constituent les types I et II. Leur particularité est qu'ils sont hétéropolymériques. La vimentine (cellules mésenchymateuses), la desmine, la GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) et la périphérine sont homopolymériques et constituent le type III. Le type IV des filaments intermédiaires inclut les neurofilaments, la nestine, la syncoiline et l'α-internexine. Et enfin le type V est spécifique des filaments intermédiaires nucléaires avec les lamines A, C et B (Chang L. et Goldman R.D., 2004; Eriksson J.E., et al., 2009; Polychronidou M. et Groβhans J., 2011). Tous les filaments intermédiaires ont une

structure centrale identique sous forme d'hélice α. Leur spécificité provient des

chaînes latérales qui sont très variables (Chang L. et Goldman R.D., 2004). La lamine B est essentielle dans la viabilité cellulaire, elle est donc retrouvée à un taux fixe dans la majorité des types cellulaires (constitutive) alors que les lamines A/C varient énormément et peuvent être absentes dans certains types cellulaires (Lee J.S.H., et al., 2007; Dahl K.N., et al., 2008). La polymérisation et l'arrangement spatial des filaments intermédiaires sont le plus souvent régulés par phosphorylation (Busch T., et al., 2012). L'organisation intracellulaire des filaments intermédiaires est

périnucléaire et s'étend jusqu'à la périphérie de la cellule (FigI.2) (Busch T., et al.,

2012). Les filaments intermédiaires sont reconnus comme les garants de l'intégrité

cellulaire. Ils ont en effet des propriétés mécaniques qui leurs permettent de préserver la cellule d'un stress mécanique brisant les microfilaments et les microtubules. Ils ont aussi des rôles dans la maintenance de la forme et du positionnement du noyau, l'expression génique, la réplication, la liaison aux autres parties du cytosquelette, la motilité, la polarisation et l'adhésion cellulaire (Janmey P.A., et al., 1991; Chang L. et Goldman R.D., 2004; Nieminen M., et al., 2006; Lee J.S.H., et al., 2007; Kumar N., et al., 2007; Dahl K.N., et al., 2008; Shimi T., et al.,

2008; Lund N., et al., 2010).

Les microtubules sont constitués des sous-unités de tubuline α et β arrangées en protofilaments puis en filaments de 25 nm de diamètre. La nucléation des microtubules s'effectue à partir du MTOC (MicroTubule Organizing Center) et

notamment grâce à la tubuline γ (Piel M. et Tran P.T., 2009). Leur organisation

intracellulaire est relativement conservée d'un type cellulaire à un autre, les microtubules émanent du MTOC ou centrosome et s'étendent jusqu'à la périphérie cellulaire (FigI.2) (Screpanti E., et al., 2010). Ces filaments peu flexibles et cassants ont un rôle primordial en association avec la dynéine et la kinésine dans le transport intracellulaire des organites, protéines et ARN (Hawkins R.J., et al., 2011). Ils interviennent aussi dans le positionnement du noyau au milieu de la cellule, les

propriétés viscoélastiques du cytoplasme, la mitose, l'orientation et le phénotype

cellulaire (Janmey P.A., et al., 1991; Piel M. et Tran P.T., 2009; Goldyn A.M., et al.,

2010; Dupin I., et al., 2011). Les propriétés mécaniques conférées par les éléments

du cytosquelette sont essentielles pour la cellule et en particulier pour protéger l'élément central, le noyau.

I.4 Noyau cellulaire:

Le noyau est l'organite principal, il contient la presque totalité de l'ADN cellulaire. Sa forme ovoïde ou sphéroïde est le plus souvent invariable, il existe des cas particuliers notamment pour des cellules du système immunitaire où les noyaux peuvent être plurilobés. Le noyau est délimité par deux membranes lipidiques nommées externes et internes. La membrane externe est en continuité avec le réticulum endoplasmique. La membrane interne est caractérisée par la présence de nombreuses protéines intégrales (enchâssées dans la membrane) (Polychronidou M. et Groβhans J., 2011). De plus elle est soulignée par la lamina nucléaire qui est essentiellement constituée de lamines. Les membranes lipidiques du noyau sont ponctuées par des pores nucléaires (Rowat A.C., et al., 2008). Ces pores nucléaires permettent le passage de macromolécules entre le cytoplasme et le nucléoplasme (FigI.3) (Tzur Y.B., et al.,

2006). Le noyau est mécaniquement rigide comparé au reste de la cellule. Cette

propriété provient en grande partie de la lamina nucléaire qui maintient l'intégrité du

noyau (Rowat A.C., et al., 2008). Le noyau contient ainsi l'ADN mais aussi des protéines et des ARN (Acide RiboNucléique) afin d'assurer différentes fonctions comme compaction, réplication, transcription de l'ADN et épissage des préARN (Cremer T. et Cremer C., 2001).

L'intérieur du noyau est organisé en différents compartiments liés à la fonction qu'ils

assurent. Ainsi on décrit le nucléole pour la production des ribosomes; les "PML bodies" ou "Nuclear bodies" enrichis en protéine impliqués dans la régulation de la transcription, la réparation de l'ADN et l'apoptose; les corps de Cajal assurant la maturation des ARN et les régions riches en chromatines. Les régions riches en chromatine sont séparées en euchromatine et hétérochromatine (Lanctôt C., et al.,

2007). En effet, au sein de l'euchromatine la compaction de l'ADN est faible et les

gènes sont actifs alors que l'hétérochromatine est très compactée et inactive

(Hameed F.M., et al., 2012). Des chercheurs tentent de cartographier la structure interne du noyau, il semblerait que l'expression génique soit liée à l'emplacement des chromosomes au sein du noyau (Cremer T. et Cremer C., 2001; Lanctôt C., et al., 2007). Des modifications dans l'emplacement et la conformation des chromosomes ont déjà été identifiés lors de différenciations cellulaires (Cremer T. et Cremer C., 2001; Rowat A.C., et al.,

2008). De plus, il semblerait que l'application de forces sur le noyau puisse

provoquer une déformation locale influant sur l'expression génique (Rowat A.C., et al., 2008). Les forces mécaniques appliquées sur l'enveloppe nucléaire proviennent de l'environnement cellulaire. Elles sont transmises au noyau via les points focaux, le cytosquelette et le complexe LINC (LInker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton) (Lombardi M.L., et al., 2011). ???? ??: Schéma du noyau selon Tzur Y.B., et al., 2006

I.5 Complexe LINC: Le complexe LINC constitue le lien physique entre le cytosquelette et le nucléosquelette (Starr D.A., 2007). Il est composé de plusieurs protéines dont les

nesprines et les SUN. Les nesprines sont localisées dans la membrane externe du noyau alors que les protéines SUN sont dans la membrane interne (Schirmer E.C. et

Foisner R., 2007; Lombardi M.L., et al., 2011).

Les nesprines ont toutes un domaine transmembranaire KASH (Klarsicht ANC-1 and SYNE1 homology) de 30 acides aminés dédié à la liaison aux protéines SUN. L'extremité N-terminale des nesprines leur permet de se fixer directement ou indirectement à chaque composant du cytosquelette. Ainsi les nesprines 1 et 2 peuvent lier les microfilaments d'actine. La nesprine 3 lie les filaments intermédiaires via la plectine et la nesprine 4 lie les microtubules par l'intermédiaire de la kinésine (Crisp M. ., et al., 2005; Haque F., et al., 2006, Wang N., et al., 2009; Ostlund C., et al., 2009). Les microtubules peuvent aussi être liés à la membrane externe du noyau en passant par la dynéine et une autre protéine comportant le domaine KASH, Zyg-

12b (FigI.4) (Burke B., et al., 2009).

Les protéines SUN sont intégrales à la membrane interne du noyau. Elles sont liées au domaine KASH du côté de la membrane externe du noyau et à la lamina nucléaire (via la lamine A) du côté interne (Ostlund C., et al., 2009). La torsine A aurait aussi un rôle à jouer dans la liaison du cytosquelette au nucléosquelette grâce à son affinité avec le domaine KASH (Nery F.C., et al., 2008).Ces protéines jouent un ???? ??: Schéma du complexe LINC: repris et simplifié de l'article de Burke B., et al., 2009. rôle dans le positionnement du noyau, la localisation du centromère, la position des télomères et l'apoptose (Hodzic D.M., et al., 2004; Tzur Y.B., et al., 2006). Le complexe LINC, de part sa liaison physique avec le cytosquelette constitue un acteur essentiel dans la mécanotransduction.

I.6 Mécanotransduction:

La mécanotransduction cellulaire correspond à la capacité de la cellule à identifier des propriétés physiques de son environnement, à les intégrer et à y répondre. Ces propriétés physiques peuvent être incarnées par la rigidité du substrat, la topographie mais aussi par des stress mécaniques. La mécanotransduction est impliquée dans de nombreuses fonctions cellulaires comme le changement de forme, la différenciation, la croissance, la prolifération et l'apoptose (Vogel V. et Sheetz M.,

2006; Dahl K.N., et al., 2008; Jaalouk D.E. et Lammerding J., 2009; Schwartz U.S. et

Gardel M.L., 2012). Cette mécanotransduction est caractérisée la plupart du temps par la conversion d'informations physiques en signaux chimiques qui en général influencent l'expression génique (Wang N., et al., 2009). Trois types de mécanotransduction sont actuellement décrites en fonction de la transduction qu'emploie la cellule pour adapter sa réponse aux facteurs environnementaux. La première est l'ouverture de canaux ioniques suite au stress mécanique, la seconde est l'initiation d'une cascade de signalisation et la troisième emprunte un pont physique entre les points focaux et la chromatine. La mécanotransduction impliquant les canaux ioniques a déjà été décrites dans de nombreux travaux. Dans ce cas, un stress mécanique entraine l'ouverture de canaux ioniques situés sur les membranes nucléaires (Tamada M., et al., 2004). Cettequotesdbs_dbs46.pdfusesText_46

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