[PDF] Destruction de cellules cancéreuses par vibrations magnéto

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2.14 Fonction de transfert de la traˆın´ee hydrodynamique. . . . . . . . . . 63

2.15 Facteur de correction b(h) en fonction de la hauteur. . . . . . . . . . 64

2.16 Comparaison entre pointes pyramidale et sph´erique. . . . . . . . . . 68

2.17 Comparaison entreEetG?. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

2.18 Superposition des mesures rh´eom`etriques et AFM. . . . . . . . . . . 70

2.19 Mod`ele rh´eologique. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

2.20 Rh´eologie des gels de polyacrylamide. . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

2.21 Param`etreG0

Nen fonction de la concentration en acrylamide. . . . . 73

2.22 Param`etrefTen fonction de la concentration en acrylamide. . . . . 74

3.1 Sch´ema des couches cellulaires de la vessie. . . . . . . . . . . . . . . 78

3.2 Mod`ele rh´eologique simplifi´e appliqu´e au gel de polyacrylamide. . . . 81

3.3G?etG??au dessus du noyau. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

3.4G?etG??`a diff´erentes positions de la cellule. . . . . . . . . . . . . . 84

3.5 Param`etresG0

N,aetb, et la fluorescence. . . . . . . . . . . . . . . . 84

3.6 Images confocales de T24 en pr´esence de drogues (LatrunculinA,

Y27632 et Jasplakinolide)

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

3.7 Intensit´e de fluorescence normalis´ee en pr´esence de drogues (Latrun-

culinA, Y27632 et Jasplakinolide) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

3.8 Cellule T24 :G?etG??avant et apr`es rajout de LatrunculinA. . . . . 88

3.9 Cellule T24 : param`etreG0

Net l"intensit´e de fluorescence en fonction

du temps. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

3.10 Cellule T24 :G?etG??avant et apr`es rajout de Y27632. . . . . . . . 90

3.11 Cellule T24 :G?etG??avant et apr`es rajout de Jasplakinolide. . . . 92

3.12 Images confocales de trois lign´ees cellulaires : RT112, T24 et J82. . . 94

3.13 Intensit´e de fluorescence en fonction de l"invasivit´e. . . . . . . . . . . 95

3.14 ModulesG?etG??des lign´ees RT112, T24 et J82. . . . . . . . . . . . 96

3.15 Param`etresG0

N,fT,a,bet fluorescence des lign´ees RT112, T24 et J8297

3.16 Param`etresG0

NetfTen fonction de la fluorescence des lign´ees RT112, T24 et J82. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98

4.1 Sch´ema du lien entre cellules et ECM. . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

4.2 Module d"Young des gels de polyacrylamide en fonction dela concen-

tration en r´eticulant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

4.3 Images en fluorescence de cellules T24 sur verre et sur gelde rigidit´e

diff´erente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104

4.4 ModulesG?etG??de trois lign´ees cellulaires sur un gel de 8kPa. . . 105

4.5 ModulesG?etG??de cellules HUVECs. . . . . . . . . . . . . . . . . 105

4.6 Image d"une cellule T24 sur une monocouche HUVEC. . . . . . . . . 106

4.7 Image d"une cellule J82 sur une monocouche HUVEC en fonction du

temps . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

4.8 ModulesG?etG??de trois lign´ees cellulaires sur une monocouche de

Huvec . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 xiv

Synthèse bibliographique

Chapitre 1 : Interactions cellules-microenvironnement 10 supramoléculaires constituant la MEC (Engel et Chiquet, 2011).

raisonnablement une liste complète des protéines matricielles. La diversité des protéines

comme des protéases, des facteurs de croissances ou des cytokines. Un sous-groupe,

formant le " noyau » du matrisome a été identifié avec des protéines qui ne sont pas

seulement en interactions avec la matrice mais sont vues comme des protéines matricielles

à part entière (Figure 1). Cette liste du " core » du matrisome contient environ 300 protéines

dont 43 de types collagèniques, au moins 35 protéoglycanes et environ 200 glycoprotéines (Hynes et Naba, 2012; Naba et al., 2012).

1.1.3. Les collagènes

Les collagènes sont les protéines les plus abondantes chez les mammifères représentant 30% de la masse des protéines totales. La famille des collagènes comprend 28

membres, nommés de I à XXVIII, qui sont caractérisés par au moins un domaine organisé en

hélices peuvent contenir des interruptions permettant une plasticité et une flexibilité

trois chaînes différentes (ex ͗;ɲϭɲϮɲϯ)). Les collagènes fibrillaires contiennent un domaine

majoritaire en triple hélices qui confère une rigidité à la molécule (I, II, III, V, XI, XXIV, XXVII).

organisés en triple hélices des domaines non collagéniques (NC). Ces domaines NC apportent

Figure 4 Rôles des protéoglycanes.

A) Les protéoglycanes peuvent servir de réservoir de facteurs de croissances libérables par dégradation sélective par des

héparanases. B) Les protéoglycanes membranaires peuvent coopérer avec des récepteurs cellulaires pour faciliter la liaison

Synthèse bibliographique

Chapitre 1 : Interactions cellules-microenvironnement 12 protéoglycanes de la matrice extracellulaire peuvent interagir avec des cytokines, des chimiokines, des facteurs de croissance les protégeant ainsi de la protéolyse. De par ces

interactions, les protéoglycanes peuvent aussi servir de réservoir de molécules délivrables

(Vlodavsky et al., 2007)(Figure 4). Les protéoglycanes peuvent agir comme récepteur de Les protéoglycanes membranaires peuvent coopérer avec les récepteurs aux facteurs de croissance et avec les intégrines en favorisant la reconnaissance des ligands. Ils peuvent ainsi migration cellulaire (Esko et al. , 2009). Au cours de la progression tumorale, les

1.1.5.

Les glycoprotéines adhésives

En plus des collagènes et des protéoglycanes apportant notamment les propriétés de glycoprotéines qui constituent la matrice extracellulaire. Leurs nombreuses capacités

cellulaire en induisant des signalisations. Les glycoprotéines sont capables de fixer les

facteurs de croissance pour moduler leur biodisponibilité. Les glycoprotéines peuvent être insolubles, incorporées dans la matrice, ou circulantes. Des analyses in silico et extracellulaire (Naba et al., 2012) . Les plus étudiées sont les laminines et la fibronectine. Par sont le composant majoritaire de la lame basale et possèdent de nombreuses fonctions biologiques (Greciano et al., 2012). Leurs rôles lors de la morphogenèse des poumons ou des reins et dans le développement de la plaque neuromusculaire ont notamment été démontrés. La formation de la lame basale requiert notamment la sécrétion laminine-511

Figure 7 Structure primaire de la vitronectine.

Le schéma représente la vitronectine composée par les sous-unités de 65 kDa et de 10 kDa liées par un pont di-sulfure. Les

Présentation des résultats

1. PRESENTATION DE L'ETUDE

la cavité péritonéale est une complication fréquente pour le traitement de cette pathologie.

En effet, la présence de cellules cancéreuses isolées ou organisées en sphéroïdes dans

En effet, le maintien des interactions entre la matrice extracellulaire et les récepteurs péritonéale.

Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires nécessaires à la résistance

thérapeutiques visant à réduire cette résistance afin de limiter la dissémination tumorale.

initiale de sphéroïdes cancéreuses ovariennes (Kellouche et al. , 2010). Ainsi, il nous est avec leurs ligands matriciels au sein des sphéroïdes pourrait entraîner une mort cellulaire

Dans ce cadre, les mécanismes moléculaires par lesquels ces intégrines participent à la

Présentation des résultats

2. RESULTATS 2.1. Formation et survie des sphéroïdes de cellules cancéreuses ovariennes

Les cellules IGROV1 et SKOV3 forment deux types de sphéroïdes différents

substrat non-adhésif nous a permis de disposer, à partir de lignées caractéristiques

environnement non-adhésif, elles forment spontanément des sphéroïdes (Casey et al. , 2001;

Kellouche et al.

, 2010). Ainsi, la capacité de survie des cellules cancéreuses ovariennes La Figure 42 montre que les cellules IGROV1 et SKOV3 forment des sphéroïdes cellules commencent à se regrouper en petits amas. Puis, au cours du temps, les agrégats IGROV1 et plus de 300 µm pour les cellules SKOV3 (Figure 42A). Les sphéroïdes de cellules IGROV1 conservent, pendant les 7 jours de culture, leur structure contenant de 6 à plus de

20 cellules. Certaines cellules IGROV1 restent isolées dans le milieu de culture. Il est à noter

que cette organisation en sphéroïdes obtenue in vitro est fortement comparable à celle

observée sur des sphéroïdes contenus dans les ascites (Figure 42B). Les sphéroïdes de

cellules SKOV3 sont organisés différemment. Le nombre de cellules par agrégats est

supérieur à 50 cellules dès 2 jours de culture et la compaction des cellules entre-elles semble

La viabilité des cellules IGROV1 en condition non adhérente est estimée en présence de calphostine C (A) un inhibiteur des

proportion de cellules IGROV1 dans le pic pré-G1 obtenue par cytométrie en flux, représentant les cellules mortes et les

débris cellulaires, est suivie au cours de la formation des sphéroïdes après un traitement avec 1 µM de PMA (C).

Figure 53 Caractérisation des métalloprotéases ascitiques.

La présence de différentes métalloprotéases et de leurs inhibiteurs (TIMP) est recherchée dans les ascites par

sains est analysée par zymographie en gel de gélatine (B).

Tableau 4 Dosage ELISA de la pro-MMP-2, de la Vn et de la Fn dans les ascites de patientes et dans les plasmas de

donneurs sains.

Figure 56 Importance des intégrines ɲv dans la formation de colonies par les cellules cancéreuses ovariennes.

La formation de colonies par les cellules IGROV1 (A) et SKOV3 (B) incubées en milieu de culture ou en ascite est suivie par

microscopie à contraste de phase pendant 10 jours. Les cellules en ascites sont traitées par le peptide cRGDfC ou cRADfK au

Présentation des résultats

constitue un réservoir dynamique de molécules pouvant influencer le comportement des cellules cancéreuses. De nombreuses molécules bioactives sont contenues dans les ascites comme des cytokines, des facteurs de croissance, des facteurs angiogéniques, des potentiels associés à la progression de la pathologie.

La Vitronectine et la Fibronectine ont précédemment été décrites comme des molécules

ayant un rôle majeur dans la progression tumorale (Carreiras et al., 2002; Hapke et al., 2003;

Heyman et al.

, 2010; Kenny et al., 2008). Leurs présences ont donc été recherchées dans du centre hospitalier R. Dubos de Pontoise. Dans un second temps, une méthode de ces deux protéines de la MEC sur le comportement des cellules cancéreuses ovariennes. Figure 60 Purification combinée de la Fn et de la Vn ascitiques.

(B) et Gélatine Sepharose (C) puis de la purification de la Vn par la colonne Héparine Sepharose (E). La ligne

-1

Chaque étape de la purification de la Fn et de la Vn est analysée par SDS-PAGE (D et F respectivement) et

en minuscules indiquent sur les chromatogrammes le début de chaque étape et sur les gels SDS-PAGE la

250mM; c) chargement de la fraction éluée de la gélatine; d) rinçage avec TE NaCl 75 mM; e) élution de la

de la seconde colonne gélatine sepharose par TE urée 3M NaCl 250 mM (Fn ascitique). Purification de la Vn (E-

F): a) chargement du non-retenu de la première colonne Gélatine sepharose; b) rinçage avec TE NaCl 150 mM

et récupération du non-retenu; c) décrochage des contaminants avec TE urée 6 M NaCl 1M et équilibration

ɴ-mercaptoéthanol; f) élution avec TE urée 6M NaCl 1 M (Vn ascitique).

Figure 65 Adhérence et migration des cellules cancéreuses ovariennes avec les protéines ascitiques purifiées.

cellulaires (IGROV1, OVCAR3 et SKOV3) est estimée sur des coating de Vn et de Fn (10 µg/mL) plasmatique et ascitiques

provenant de trois patientes différentes (C). La migration des cellules IGROV1 est analysée après 20h dans un milieu

supplémenté avec de la Vn ou de la Fn (10 µg/mL) de différentes origines (D).

Discussion et perspectives

formation des sphéroïdes. La formation des sphéroïdes est un évènement majeur de de la dissémination des

cellules cancéreuses dans la cavité péritonéale. La formation de ces amas multicellulaires

la cavité péritonéale. Les cellules IGROV1 et SKOV3 utilisées pour cette étude ont été établies selon une méthode précédemment décrite (Casey et al. , 2001; Kellouche et al., 2010), les cellules forment des sphéroïdes similaires à ceux observés in vivo

lignées cellulaires. Les agrégats multicellulaires de cellules SKOV3 sont de plus grandes tailles

et moins compactes que les sphéroïdes de cellules IGROV1. Néanmoins, au cours de

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