[PDF] Immunothérapie et métabolisme tumorale

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AVERTISSEMENT

Ce document est le fruit d'un long travail approuvŽ par le jury de soutenance et mis ˆ disposition de l'ensemble de la communautŽ universitaire Žlargie. Il est soumis ˆ la propriŽtŽ intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de rŽfŽrencement lors de lÕutilisation de ce document. D'autre part, toute contrefaon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pŽnale.

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LIENS Code de la PropriŽtŽ Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la PropriŽtŽ Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10

REMERCIEMENTS

" L'avenir appartient à ceux qui croient en la beauté de leurs rêves. »

Eleanor Roosevelt

Réaliser une thèse n'est pas facile. Certains moments sont teintés de joie, tandis que d'autres

sont plus difficiles. J'ai parfois douté de ne pas réussir à terminer cette thèse. Mais durant ces

quatre années, vous m'avez encadrée, accompagnée et soutenue. Et finalement, j'y suis arrivée.

Alors un grand merci à chacun d'entre vous

Je tiens tout d'abord à remercier Mme Corinne Abbadie, M. Jérôme Kluza et Mme Annie

Borgne-Sanchez d'avoir accepté de participer à ma soutenance de thèse et de juger mon travail.

Merci également à M. Jean-Yves Jouzeau qui a suivi l'avancée de mes travaux durant ces quatre

années et qui a accepté de faire partie de mon jury de thèse.

Je remercie

tout naturellement Stéphane Flament et Sabine Mazerbourg qui m'ont encadrée tout

au long de cette thèse et m'ont beaucoup apporté tant sur le plan scientifique qu'humain. Merci

pour vos conseils, votre enthousiasme et votre bienveillance à mon égard. Vous n'avez cessé

de m'encourager et de me conseiller. Je suis heureuse d'avoir été votre thésarde et je n'oublierai

pas ces nombreux moments de complicité et de rire partagés pendant quatre ans.

Je remercie également l'ensemble des personnes qui ont collaboré à la réalisation de cette

thèse - merci à Michel Boisbrun pour son enthousiasme, sa bonne humeur et sa disponibilité. Merci

d'avoir partagé ton expérience et ton savoir-faire. Nos discussions autour d'un thé ont toujours

été très enrichissantes.

- à Frédéric Bost d'avoir accepté de suivre mon travail durant cette thèse. Merci également pour

votre aide technique et vos conseils très précieux, qui m'ont beaucoup aid

ée lors de mes

premiers pas dans l'étude du métabolisme.

- à François Foulquier et Marine Houdou pour leur aide technique et scientifique. Merci d'avoir

consacré du te mps pour l'étude des effets du 2-désoxyglucose sur la N-glycosylation des protéines. Je remercie l'ensemble des membres du laboratoire CRAN, et en particulier ceux du département SBS, qui grâce à leurs remarques constructives pendant les séminaires, m'o nt

permis de prendre du recul sur mon travail et de mieux appréhender les résultats de cette thèse.

Je remercie tous les membres de l'équipe SticMo qui ont été à mes côtés pendant ces quatre

ans. Merci pour vos sourires, votre joie de vivre et les nombreux échanges que nous avons eus. Vos conseils et vos encouragements ont toujours été d'un grand réconfort. Merci à Sandra, Isabelle et Hélène qui m'ont toujours encouragée et soutenue.

Merci pour ces

moments passés autour d'un café (et parfois d'un gâteau) et nos nombreuses discussions. Je remercie également Stéphanie qui m'a accompagnée pour mes débuts dans l'enseignement et

n'a cessé de m'apporter son expérience. Merci d'avoir partagé mes galères de métabolisme et

de m'avoir soutenue dans les moments difficiles. Je remercie aussi Philippe, Nadège, Catherine, Lionel et Amand pour leur convivialité. Merci à Vanessa et Emilie pour leur aide technique et leur bonne humeur. Votre joie de vivre et vos encouragements m'ont beaucoup aidée. Je pense aussi à Guillaume, Claire, Charlène et Alexis, qui suivent le même chemin que moi.

Claire et Charlène, je vous souhaite bon vent pour votre thèse. Que la réussite soit à vos côtés !

Bonne continuation à toi aussi Alexis ! Et merci Guillaume, pour ton aide et ta bienveillance durant mes premiers pas dans l'enseignement. Je te souhaite bon courage pour la fin de ta thèse Je n'oublie pas non plus Claire Barbieux qui est maintenant docteure. Merci pour tes conseils, ton enthousiasme et tes encouragements. Je remercie Marie pour son aide, son et nos nombreuses discussions. Je n'oublierai pas tous ces moments de complicité que nous avons partagés et notre complémentarité dans les manips. Je te souhaite beaucoup de réussite Marie car tu le méri tes amplement

Je tiens à remercie

r mes deux " camarades de bureau » Marine et Alexandra, avec qui j'ai partagé tellement de bons moments. Merci Marine pour ta bonne humeur et tes encouragements.

Je n'oublierai pas nos virées à Strasbourg. Merci à toi Alex, qui m'a tant encouragée et

soutenue pendant ces quatre années. Merci de m'avoir redonné le goût du sport! Si j'avais une

baguette magique, je t'emmènerais avec moi dans e prochain .

Je remercie l'ensemble de ma famille, de ma belle-famille et mes amis qui ont toujours été à

mes c

ôtés, m'ont encouragée et n'ont cessé de me soutenir. Merci en particulier à mes parents

et mon frère qui ont été mon point de repère pendant toutes ces années. Les mots ne sont pas

suffisants pour exprimer ma gratitude envers vous.

Enfin, ces derniers mots sont pour toi, Raphaël. Tout ce que je pourrais écrire n'est rien à côté

de tout le bonheur et la joie que tu m'apportes chaque jour. Que la vie continue à m'offrir cette chance d'être à tes cotés.

SOMMAIRE

ABREVI

ATIONS ........................................................................ .................................. 1

INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE

I. LE CAN

CER DU SEIN ........................................................................ ...................... 7

1. Structure et développement du sein ........................................................................

......... 7

2. La carcinogenèse mammaire ........................................................................

.................... 8

3. Epidémiologie et facteurs de risque ........................................................................

....... 11

3.1 Epidémiologie du cancer du sein........................................................................

............ 11

3.2 Facteurs de risque associés au cancer du sein ................................................................ 12

4. Classification des tumeurs mammaires ........................................................................

.. 14 4.

La classification histologique ........................................................................

................. 14 4. L a classificati on anatomopathologique ......................................................................... 15 4. La classification moléculaire .................. 17

5. Les stratégies thérapeutiques dans le cancer du sein ..................................................... 18

5.1 La chirurgie ........................................................................

............................................ 18

5.2 La radiothérapie ........................................................................

...................................... 19

5.3 La chimiothérapie ........................................................................

................................... 20

5.4 L"hormonothérapie ........................................................................

................................. 22

5.5 Les thérapies ciblées ........................................................................

............................... 23

5.6 Limites des stratégies

thérapeutiques du cancer du sein ................................................ 24 II. METABOLISME ENERGETIQUE ET CANCER ................................................. 26

1. Le métabolisme énergétique d"une cellule non cancéreuse ........................................... 26

1.1 Présentation du métabolisme cellulaire et énergétique .................................................. 26

1.2 Les substrats du métabolisme énergétique ..................................................................... 27

1.3 Les transporteurs d"énergie dans le métabolisme énergétique ....................................... 27

1.4 La glycolyse ........................................................................

........................................... 28

1.4.1 Mécanisme et rendement de la glycolyse ................................................................ 28

1.4.2 Destin du pyruvate en conditions aérobies et anaérobies ....................................... 29

1.4.3 Contribution de la glycolyse aux processus de biosynthèse ................................... 30

1.4.4 Régulation de la glycolyse ........................................................................

............... 30

1.5 Le métabolisme mitochondrial ........................................................................

............... 31

1.5.1 La structure de la mitochondrie ........................................................................

...... 31

1.5.1.1 Les membranes externe et interne de la mitochondrie ..................................... 31

1.5.1.2 La matrice ........................................................................

................................ 32

1.5.2 Le cycle de Krebs ........................................................................

............................ 33

1.5.2.1 Mécanisme et rendemen

t du cycle de Krebs .................................................... 33

1.5.2.2 Régulation du cycle de Krebs ........................................................................

... 34

1.5.3 La phosphorylation oxydative ........................................................................

......... 35

1.5.3.1 T

ransport des électrons dans la chaîne respiratoire ....................................... 35

1.5.3.2 Couples redox et réactions d"oxydoréduction dans la chaîne respiratoire ..... 37

1.5.3.3 Gradient électrochimique à travers la membrane interne ............................... 37

1.5.3.4 Synthèse de l"ATP par l"ATP synthase ............................................................. 38

1.5.3.5 Rendement énergétique à l"issue de la phosphorylation oxydative ................. 39

1.5.3.6 Régulation de la phosphorylation oxydative .................................................... 40

1.5.3.6.1 Régulation du taux de synthèse d'ATP ..................................................... 40

1.5.3.6.2 Régulation de l'efficacité du couplage ...................................................... 41

1.5.3.6.3 Modifications post-traductionnelles des protéines des complexes

respiratoires ........................................................................ ...................................... 43

1.5.3.6.4 Fusion et fission mitochondriales .............................................................. 43

1.5.3.6.5 La biogenèse des mitochondries................................................................ 44

1.5.4 Autres processus cellulaires associés à la mitochondrie ........................................ 45

1.5.4.1 Production d"espèces réactives de l"oxygène ................................................... 45

1.5.4.2 L"apoptose ........................................................................

................................ 47

1.5.4.3 La signalisation calcique ........................................................................

......... 49

2. Le métabolisme énergétique d'une cellule cancéreuse .................................................. 50

2.1 Présentation de l'effet Warburg ........................................................................

............. 50

2.2 Les avantages de l'effet Warburg pour les cellules cancéreuses.................................... 52

2.3 Le métabolisme mitochondrial dans les cellules cancéreuses ........................................ 55

2.4 Le métabolisme énergétique comme cible thérapeutique .............................................. 58

III. LES THIAZOLIDINEDIONES ........................................................................ ..... 63

1. Présentation générale ........................................................................

............................. 63

2. Propriétés antidiabétiques ........................................................................

...................... 64

3. Propriétés anti-cancéreuses ........................................................................

.................... 65

4. Des mécanismes anti-Ȗ-indépendants (ARTICLE 1) .......................... 68

5. Altération du métabolisme énergétique par les TZDs.................................................... 73

ǻ-CGZ ......................... 73

5.2 Altération du métabolisme mitochondrial par les TZDs ................................................ 75

O BJECT

IFS DE THESE

..................................................................... 81

MATERIEL & METHODES

I. MOLECULES UTILISEES ........................................................................ .............. 82 II. CULTURE CELLULAIRE ET CONDITIONS DE TRAITEMENT ..................... 82

1. Lignées cellulaires ........................................................................

.................................. 82 2. C onditions de culture ........................................................................ ............................. 83

3. Ensemencement et condition

s de traitement .................................................................. 83 III. NUMERATION CELLULAIRE PAR COLORATION AU CRISTAL VIOLET 83 IV. CARACTERISTATION DE LA CROISSANCE CELLULAIRE ........................ 84

1. Evaluation de la prolifération cellulaire par le test d'incorporation de BrdU ................ 84

2. Etude du cycle cellulaire par cytométrie en flux ............................................................ 84

V. ETUDE DE L'EXPRESSION DES GENES ........................................................... 84

1. Au niveau transcriptionnel par RT-PCR conventionnelle ............................................. 84

2. Au niveau traductionnel ........................................................................

......................... 84

2.1 Par western blot ........................................................................

...................................... 84

2.2 Immunocytochimie ........................................................................

................................. 85 VI. ETUDE DE L'ACTIVITE METABOLIQUE DES CELLULES .......................... 85 1. Do sage de l'ATP ........................................................................ .................................... 85

2. Dosage du NAD

+ et du NADH ........................................................................ .............. 86

3. Etude de l'activité mitochondriale par oxygraphie ........................................................ 86

4. Analyse de l'activité glycolytique par mesure de la production de lactate et de la

consommation de glucose ........................................................................ .......................... 87 VII. DETERMINATION DE L'INDICE DE COMBINAISON (CI) SELON LA METHODE DE CHOU-TALALAY ........................................................................ .... 88 VIII. ANALYSE STATISTIQUE ........................................................................ ........ 89

RESULTATS

I. CARA

CTERISATION D

-TGZ EN MILIEU DE CULTURE CONTENANT 10% DE SERUM DE VEAU FOETAL (ARTICLE 2) ........................ 90

1. Objectifs ........................................................................

................................................. 90

2. Résultats ........................................................................

................................................. 90

3. Conclusions ........................................................................

............................................ 92

4. Résultats complémentaires ........................................................................

..................... 93

4.1 Etude du senseur énergétique AMPK dans des conditions de culture restrictives en

sérum ........................................................................ ............................................................ 93 ǻ-TGZ sur le nombre de cellules au cours d'une cinétique de traitement ...................................................... 93 II. ETUDE DES EFFETS ǻ-TGZ SUR LE METABOLISME ENERGETIQUE

DES CELLULES CANCERE

USES

MAMMAIRES MDA-

MB-231 ......................... 94

1. Etude du métabolisme énergétique dans sa globalité ..................................................... 94

2. E

tude de la respiration mitochondriale ........................................................................

.. 94

3. Etude de la glycolyse ........................................................................

............................. 96

4. La glycolyse : un mécanisme compensateur en réponse à l'atteinte mitochondriale ?.. 97

4.1 Dosage de l'ATP intracellulaire ........................................................................

............. 97

4.2 Etude des senseurs énergétiques AMPK et Sirt1 ........................................................... 97

ǻ-TGZ + 2-DG sur le nombre de cellules ........... 98

5. Conclusion ........................................................................

.............................................. 99

III. CARACTERISATION

DU MODE D'ACTION DU 2-DG DANS LES CELLULES

CANCEREUSES MAMMAIRES (ARTICLE 3) ...................................................... 100

1. Contexte ........................................................................

............................................... 100

2. Résultats ........................................................................

............................................... 100

3. Conclusion ........................................................................

............................................ 102

4. Résultats complémentaires ........................................................................

................... 103

4.1 Etude des effets du 2-DG sur le niveau d'ATP intracellulaire en présence ou non de

mannose ........................................................................ ...................................................... 103

4.2 Etude des effets du 2-DG sur le nombre de cellules lors d'une cinétique de traitement en

présence ou non de mannose ........................................................................

...................... 103

IV. ETUDE PRELIMINAIRE SUR L'UTILISATION

ǻ-TGZ EN THERAPIE

COMBINATOIRE ........................................................................ .............................. 104

DISCUSSION & PERSPECTIVES

TGZ ALTERE LE METABOLISME ENERGETIQUE DES CELLULES CANCEREUSES MAMMAIRES ........................................................................ ...... 106 ǻ-TGZ ? .................................................... 107 ǻ-TGZ dans la mitochondrie ? ....................... 109

3. Quel est l'impact de

la perturbation du métabolisme énergétique dans les effets anti- ǻ-TGZ ? ........................................................................ ....................... 111

II. INTERET THERAPEUTIQUE DE LA

ǻ-TGZ .................................................. 111

ǻ-TGZ ? ............................... 112

ǻ-TGZ peut-elle être potentialisée ? ................................................... 113

-TGZ peut-elle potentialiser l'action d'agents de chimiothérapie ? ................... 117

III. DE NOUVEAUX DER

-TGZ .................................................... 119

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

1

ABREVI

ATIONS [Ca

2+]c, [Ca

2+] Concentration de calcium cytosolique et intracellulaire 15d-P

GJ 2 15-désoxy-ǻ-prostaglandine J2 2-DG 2-désoxyglucose

5-FU 5-fluorouracile

Į ǹ-cét

o glutarate déshydrogénase ǻ-TG Z Delta-2- troglitazone ǻ Gradient de pH ǻǻȌ Potentiel de membrane mitochondrial

ABC ATP-

bi nding cassette Acétyl-

C oA Acétyl-coen zyme A ADNmt ADN m

i tochondrial ADP Adénosine diphosphate AJCC American Joint Committee on Cancer Akt Protein kinase B

AMP Adénosine monophosphate

AMPc AMP cyclique ANT Adenosine nucleotide translocase

APAF1 Apoptotic protease-activating factor 1 AR Récepteur aux androgènes (ou androgen receptor) ARE Androgen response elements

ATF6 Activating transcription factor 6 ATP Adénosine triphosphate

ATP5E ATP synthase subunit epsilon

ATP5O

ATP synthase subunit O

ATR Atractyloside Bad Bcl-

2- associated death promoter Bak Bcl-

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