[PDF] THESE DE DOCTORAT Mme Meryem SARI HASSOUN

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NNT : 2015SACLE006

THESE DE DOCTORAT

DE

NIVERSITE PARIS-SACLAY

PREPAREE A

NIVERSITE DVRY VAL DSSONNE

ECOLE DOCTORALE N° 577

Structure et Dynamique des Systèmes Vivants (SDSV) Spécialité de doctorat : Biologie Cellulaire et Moléculaire Par

Mme Meryem SARI HASSOUN

et la Division Cellulaire Thèse présentée et soutenue à " Evry », le " 23 novembre 25 » :

Composition du Jury :

Mme Fanny ROUSSI Chercheur, CNRS Rapporteur

Mr Christophe Le CLAINCHE Chercheur, CNRS Rapporteur Mme Nassima MOKHTARI Professeur des Universités Examinateur Mr Patrick A. CURMI Directeur de Recherche Directeur de thèse Mr Daoudi CHABANE SARI Professeur des Universités Co-directeur de thèse 22

Figure 3 : Dynamique de

polymérisation des microtubules (Valiron etal., 2001).

A : Les microtubules sont des polymères polarisés. Ils présentent une extrémité " + » où les

phénomènes de croissance et de décroissance sont plus fréquents et une extrémité " - » moins

dynamique. B : s correspond à une oscillation entre des où peut survenir un événement dit

" catastrophe » qui correspond à une bascule à partir de laquelle le microtubule dépolymérise

rapidement. Cette dépolyméri inverse appelée " sauvetage » (Valiron et al., 2001). P63267 MCEEET-TALVCDNGSGLCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQGVMVGMGQKDSYVGDEA 59 P62736 MCEEEDSTALVCDNGSGLCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQGVMVGMGQKDSYVGDEA 60 P68133 MCDEDETTALVCDNGSGLVKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQGVMVGMGQKDSYVGDEA 60
P68032 MCDDEETTALVCDNGSGLVKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQGVMVGMGQKDSYVGDEA 60
P60709 --MDDDIAALVVDNGSGMCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQGVMVGMGQKDSYVGDEA 58
P63261 --MEEEIAALVIDNGSGMCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQGVMVGMGQKDSYVGDEA 58
P63267 QSKRGILTLKYPIEHGIITNWDDMEKIWHHSFYNELRVAPEEHPTLLTEAPLNPKANREK 119
P62736 QSKRGILTLKYPIEHGIITNWDDMEKIWHHSFYNELRVAPEEHPTLLTEAPLNPKANREK 120
P68133 QSKRGILTLKYPIEHGIITNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPTLLTEAPLNPKANREK 120
P68032 QSKRGILTLKYPIEHGIITNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPTLLTEAPLNPKANREK 120
P60709 QSKRGILTLKYPIEHGIVTNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPVLLTEAPLNPKANREK 118
P63261 QSKRGILTLKYPIEHGIVTNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPVLLTEAPLNPKANREK 118
P63267 MTQIMFETFNVPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVLDSGDGVTHNVPIYEGYALPHAIMRL 179 P62736 MTQIMFETFNVPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVLDSGDGVTHNVPIYEGYALPHAIMRL 180
P68133 MTQIMFETFNVPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVLDSGDGVTHNVPIYEGYALPHAIMRL 180
P68032 MTQIMFETFNVPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVLDSGDGVTHNVPIYEGYALPHAIMRL 180 P60709 MTQIMFETFNTPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVMDSGDGVTHTVPIYEGYALPHAILRL 178
P63261 MTQIMFETFNTPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVMDSGDGVTHTVPIYEGYALPHAILRL 178
P63267 DLAGRDLTDYLMKILTERGYSFVTTAEREIVRDIKEKLCYVALDFENEMATAASSSSLEK 239 P62736 DLAGRDLTDYLMKILTERGYSFVTTAEREIVRDIKEKLCYVALDFENEMATAASSSSLEK 240
P68133 DLAGRDLTDYLMKILTERGYSFVTTAEREIVRDIKEKLCYVALDFENEMATAASSSSLEK 240
P68032 DLAGRDLTDYLMKILTERGYSFVTTAEREIVRDIKEKLCYVALDFENEMATAASSSSLEK 240 P60709 DLAGRDLTDYLMKILTERGYSFTTTAEREIVRDIKEKLCYVALDFEQEMATAASSSSLEK 238
P63261 DLAGRDLTDYLMKILTERGYSFTTTAEREIVRDIKEKLCYVALDFEQEMATAASSSSLEK 238
P63267 SYELPDGQVITIGNERFRCPETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSIMKCDIDIRKDLYANNV 299 P62736 SYELPDGQVITIGNERFRCPETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSIMKCDIDIRKDLYANNV 300
P68133 SYELPDGQVITIGNERFRCPETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSIMKCDIDIRKDLYANNV 300
P68032 SYELPDGQVITIGNERFRCPETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSIMKCDIDIRKDLYANNV 300
P60709 SYELPDGQVITIGNERFRCPEALFQPSFLGMESCGIHETTFNSIMKCDVDIRKDLYANTV 298 P63261 SYELPDGQVITIGNERFRCPEALFQPSFLGMESCGIHETTFNSIMKCDVDIRKDLYANTV 298
P63267 LSGGTTMYPGIADRMQKEITALAPSTMKIKIIAPPERKYSVWIGGSILASLSTFQQMWIS 359
P62736 LSGGTTMYPGIADRMQKEITALAPSTMKIKIIAPPERKYSVWIGGSILASLSTFQQMWIS 360
P68133 MSGGTTMYPGIADRMQKEITALAPSTMKIKIIAPPERKYSVWIGGSILASLSTFQQMWIT 360
P68032 LSGGTTMYPGIADRMQKEITALAPSTMKIKIIAPPERKYSVWIGGSILASLSTFQQMWIS 360
P60709 LSGGTTMYPGIADRMQKEITALAPSTMKIKIIAPPERKYSVWIGGSILASLSTFQQMWIS 358
P63261 LSGGTTMYPGIADRMQKEITALAPSTMKIKIIAPPERKYSVWIGGSILASLSTFQQMWIS 358

P63267 KPEYDEAGPSIVHRKCF 376

P62736 KQEYDEAGPSIVHRKCF 377

P68133 KQEYDEAGPSIVHRKCF 377

P68032 KQEYDEAGPSIVHRKCF 377

P60709 KQEYDESGPSIVHRKCF 375

P63261 KQEYDESGPSIVHRKCF 375

P60709 MDDDIAALVVDNGSGMCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQGVMVGMGQKDSYVGDEAQS 60
P60010 MDSEVAALVIDNGSGMCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQGIMVGMGQKDSYVGDEAQS 60
P60709 KRGILTLKYPIEHGIVTNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPVLLTEAPLNPKANREKMT 120
P60010 KRGILTLRYPIEHGIVTNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPVLLTEAPMNPKSNREKMT 120 P60709 QIMFETFNTPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVMDSGDGVTHTVPIYEGYALPHAILRLDL 180
P60010 QIMFETFNVPAFYVSIQAVLSLYSSGRTTGIVLDSGDGVTHVVPIYAGFSLPHAILRIDL 180
P60709 AGRDLTDYLMKILTERGYSFTTTAEREIVRDIKEKLCYVALDFEQEMATAASSSSLEKSY 240
P60010 AGRDLTDYLMKILSERGYSFSTTAEREIVRDIKEKLCYVALDFEQEMQTAAQSSSIEKSY 240 P60709 ELPDGQVITIGNERFRCPEALFQPSFLGMESCGIHETTFNSIMKCDVDIRKDLYANTVLS 300
P60010 ELPDGQVITIGNERFRAPEALFHPSVLGLESAGIDQTTYNSIMKCDVDVRKELYGNIVMS 300 P60709 GGTTMYPGIADRMQKEITALAPSTMKIKIIAPPERKYSVWIGGSILASLSTFQQMWISKQ 360
P60010 GGTTMFPGIAERMQKEITALAPSSMKVKIIAPPERKYSVWIGGSILASLTTFQQMWISKQ 360

P60709 EYDESGPSIVHRKCF 375

P60010 EYDESGPSIVHHKCF 375

29
A B

Figure 7 : Polymérisation

in vitro . A : -

filament. Au cours de la nucléation, il y a assemblage d'un noyau de trois monomères d'actine qui

formeront la structure de départ nécessaire à l'élongation d'un nouveau filament. Le filament atteint

B : Les

pointue barbée , ce qui induit un mouvement global du filament, selon le principe du tapis roulant (ou

retrouve ainsi les complexes ATP-actine au bout barbé (jaune), et les complexes ADP-actine au bout

pointu (bleu). 30
fluorescente, le (l N-(1-pyrene)iodoacetamide) (Cooper et al., 1983; Kouyama and Mihashi,

1981; Lin and Dowben, 1982) (f

forme monomérique, et au cours d changement de conformation qui expose cette sonde fluorescente. La réaction de polymérisation peut donc être suivie quantitativement en mesurant le signal de fluorescence du pyrène au cours du temps. Cette augmentation de fluorescence est directement

Figure 8(Lodish et al.,

2000).

La réaction chimique se décompose en 3 phases. La phase de nucléation, avec une polymérisation

ionnaire dès lors 46
protéines régulatrices de la famille Rho GTPase. Les plus connues sont Rho (RhoA), Rac

(Rac1) et Cdc42. Ces protéines ont été largement étudiées et se sont révélées avoir des rôles

pivots majeurs dans de nombreux processus cellulaires comme la motilité, la prolifération, la morphologie (Riento and Ridley, 2003). kinases ROCK comme on le verra plus loin, augmente de ce fait la contraction cellulaire et favorise Rac1 et Cdc42, induit la formation de lamellipodes et de filopodes respectivement (Manser et al., 1994; Sells, 1999) (figure 13) niveau de l myosine puisque cette dernière phosphoryle et inactive la MLCK. Ceci a pour conséquence une diminution de la phosphorylation de la

MLCR ontraction des filaments

myosine (Sanders et al., 1999).

Figure 13

: Représentation schématique du rôle des GTPases Rho, Rac et Cdc42 dans la formation des extensions membranaires. Cdc42, cell division control protein 42; LIMK, LIM (Lin11, Isl1 and Mec3) kinase; MyoII, myosin II ;; MRCK, myotonic dystrophy kinase-related Cdc42-binding kinase; PAK, p21-activated kinase. Les hibition. 54

Figure 15

: Deux processus de la formation des blebs (Charras and Paluch, 2008)

La formation des blebs peut résulter de la

membrane ou de la rupture locale divisé en quatre phases : (a) initiation, (b) expansion, (c) assemblage du cortex et (d) rétraction 55
En résumé, la formation des blebs dépend emyosine et de sa liaison avec la membrane ; cela a été qui conduisent à une suractivation des myosines et favorisent la formation de blebs. En effet, ces derniers sont

II : RhoA (en

ajoutant l, LPA, un activateur de Rho), ou sur la MLCK, myosin light chain kinase (en ajoutant de la calyculine A qui augmente la phosphorylation de la (Hagmann et al., 1999). myosine II ine (Kovacs et al., 2004) ou le Y27632 (Ishizaki et al., 2000), inhibiteur de ROCK, activatrice de myosine II (Charras et al., 2005) (figure 16). En conclusion, les traitements qui favorisent la formation des blebs.

Figure 16

. Figure modifiée à partir de (Fabian et al., 2007)

Pour que la myosine II soit active, la chaîne légère régulatrice (MLCR) doit être phosphorylée par la

MLCK (myosin light chain kinase) ou par la ROCK (Rho associated kinase). La déphosphorylation de

la MLCR se fait par la phosphatase de la chaîne légère de la myosine qui est un hétérotrimère composé

-unité de liaison aux MLCR (M20 protein phosphatase ( PP1) et une petite sous unité MYPT1 (myosin phosphatase targeting subunit 1) (Ito et

al., 2004). Divers inhibiteurs interfèrent avec l'activité de la myosine II: ROCK est inhibée par le

Y27632, la phosphatase de la chaîne légère de la myosine est inhibée par la calyculine A et la myosine

II est inhibée directement par la blebbistatine (la blebbistatine inhibe chaînes lourdes de myosine II MHC). 66

Figure 20

: Schéma représentatif de biosynthèse de cucurbitacines catalysée par les (Gry et al., 2006). 84

Figure 23

: Démarche expérimentale pour 97

Figure 24

: Spectre RMN 1

C. colocynthis enregistré dans du

D 2 O. La formule plane de la cucurbitacine I glycosylée est présentée sous les spectres. II .1.2 Quantification des cucurbitacines par RMN 1 H Pour la quantification des cucurbitacines, nous avons utilisé une méthode par

étalonnage externe. La référence est la cucurbitacine I non glycosylée commerciale (Sigma

Aldrich, pureté 97%).

1

H est le choix du

signal. A partir du spectre de RMN 1 H de la cucurbitacine I commerciale nous devions choisir -1 (6,08 ppm), et H-6 (5,91 ppm). Ainsi, la comparaison des aires des signaux des composés et de la référence permet de calculer la concentration des constituants du mélange. Il en ressort que dans la concentration des cucurbitacines 100

Figure 26

: Chromatogramme de séparation par HPLC (C18, gradient eau/méthanol [B %]) C. colocynthis. Détection à 238 nm. II .1.5 Identification des cucurbitacines (Etape 2) RMN 1 H Les fractions (1) à (4) ont été analysées par RMN 1

H (figure 27) dans du D

2

O. Les

déplacements chimiques et les attributions des signaux sont présentés dans les tableaux dans

la section annexes. Les données de la RMN 1 H associées à celles de la RMN bidimensionnelle comparaison aux résultats de Seger et al. (Seger et al., 2005) obtenues de C. colocynthis.quotesdbs_dbs25.pdfusesText_31

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