[PDF] Dr. ZIANI Mouna Cours du module Les techniques de Biologie

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République Algérienne Démocratique et Populaire

Scientifique

Université Hassiba Benbouali de Chlef

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biologie

Dr. ZIANI Mouna

Destiné aux étudiants de 3eme année Licence de Biologie moléculaire

2020/2021

Cours du module

Les techniques de Biologie Moléculaire

Chapitre I

Introduction :

premières étapes dans la plupart des études de biologie moléculaire et dans toutes les

appliquées. de purification des ADN, le choix de la technique la plus adéquate repose généralement sur les critères suivants : Les résultats escomptés (rendement, pureté, temps de purification requis, etc.), -PCR, synthèse logique requiert la lyse cellulaire,

cellulaires. La procédure de lyse idéale est souvent un compromis de techniques et doit être

suffisamment rigoureuse pour briser le matériau de départ complexe (par exemple, le tissu), approximativement le même schéma de principe (Cseke et al., 2003; Ameziane et al., 2005): Lyse cellulaire ou rupture de la membrane : Les procédures de lyse courantes sont accomplies par des méthodes physiques (ex. : broyage ou lyse hypotonique), des méthodes chimique (ex.: lyse détergente, agents chaotropiques, réduction des thiols) et la digestion enzymatique (ex.: protéinase K). solubiliser les membranes cellulaires et des sels chaotropiques puissants pour inactiver les cellulaires peuvent être aisément retirés par filtrage ou par précipitation.

Élimination des lipides

(SDS) et par centrifugation. it cellulaire : La dénaturation des protéines est effectuée : e RNase qui le dégrade rapidement en ribonucléotides.

I.1. Extraction et purification de :

espèces eucaryote reposant sur le même principe, à la différence des sources considérées.

1) À partir d'un prélèvement sanguin humain (Méthode sans phénol/chloroforme) :

Le sang prélevé sur tube EDTA est traité le même jour ou conservé à -20°C jusqu'à

solution Tris EDTA (TE) 10 mM à pH 8. Le tube Falcon est mis dans un bac de glace pendant

30 minutes, puis centrifugé à 3000 tours/min pendant 15 minutes. Le culot est remis en

suspension dans la même solution de TE et recentrifugé à 3000 tours/min pendant 15 minutes. de ce Buffy coat par la technique de Miller (1988) selon le principe du salting out.

5 ml de tampon de lyse (TRIS/HCL 10Mm PH= 8, EDTA 1Mm, SDS 0,5%) sont additionnés

à 30 µL de protéinase K à 20mg/ml au Buffy coat. Après incubation 24 heures à 37°C sous

agitation, on ajoute 2 mL de NaCl 5 M. Le mélange est centrifugé 10 minutes à 4000 tours

/min. Les protéines sont ainsi précipitées. Le surnageant est transverse délicatement dans un

bes Eppendorfs contenant un volume de la solution du TE10/1 pH 8 sous agitation rotative à37°C pendant 24 à 48h (Miller,1988).

2) A partir d'extraits végétaux :

(cétyltriméthyl ammonium bromure).Etabli pour la première fois par Murray et Thompson en

1980 (Murray et Thompson, 1980), le protocole du test au cétyltriméthyl ammonium bromure

(CTAB) a été publié ultérieurement, et plus précisément en 1987, par Wagner et ses collègues

(Wagner et al., 1987). Cette méthode convient pour la suppression des polysaccharides et des composés méthode repose sur trois étapes lyse, extraction et précipitation.

Des cellules végétales peuvent être lysées en utilisant le détergent ionique cétyltriméthyl

ammonium bromure (CTAB), qui forme un complexe insoluble avec les acides nucléiques dans un environnement à faible teneur en sels. Dans ces conditions, les polysaccharides, les composés phénoliques et les autres contaminants restent dans le liquide surnageant et peuvent décris ultérieurement (Somma, 2004 ; Henry, 2008 ; Cseke et al., 2003 ; Cseke et al., 2011).

Lyse de la membrane cellulaire : comme il a été mentionné précédemment, la première

générale commune comprenant des molécules de lipide et de protéines maintenues ensemble par des interactions non covalentes (Somma, 2004 ; Henry, 2008 ; Cseke et al., 2003 ; Cseke et al., 2011).

Figure 01 : Représentation simplifiée des membranes cellulaires (http://gslc.genetics.utah.edu.).

Comme le montre la Figure 01, les molécules de lipides sont agencées sous forme de double

couche continue dans laquelle les molécules de protéine sont " dissoutes ». Les extrémités des

molécules de lipides se composent de " têtes » hydrophiles et de " queues » hydrophobes. Dans la méthode au CTAB, la lyse de la membrane est accomplie par le détergent (CTAB) lipides qui constituent la cellule et la membrane nucléique. Le mécanisme de solubilisation

des lipides en utilisant un détergent est illustré dans la Figure 02(Somma, 2004 ; Henry,

2008 ; Cseke et al., 2003 ; Cseke et al., 2011).

Figure 02 : Solubilisation des lipides (http://gslc.genetics.utah.edu.).

La Figure 03 montre comment le détergent piège les lipides et les protéines, autorisant ainsi la

lie le magnésium, entre autres métaux. Le magnésium est un cofacteur pour la DNAse. En vité de la DNAse présente est diminuée. La combinaison Tris/HCl

aisée des acides nucléiques à ce stade de la purification, le temps écoulé entre

(Somma, 2004 ; Henry, 2008 ; Cseke et al., 2003 ; Cseke et al., 2011).

Figure 03 :

(http://gslc.genetics.utah.edu.). : dans cette phase, les polysaccharides, les composés phénoliques, les protéines

et les autres lysats cellulaires dissous dans la solution aqueuse sont séparés du complexe acide

nucléique / CT

est particulièrement importante en raison de leur capacité à inhiber un grand nombre de

réactions enzymatiques. Dans une concentration à faible teneur en sels (< 0,5 M NaCl), les con protéines et facilite la séparation des phases aqueuses et organiques. Normalement, la phase aqueuse constitue la phase supérieure. Mais si la phase aqueuse est dense, en raison de sa en outre, tendance à se dissoudre dans la phase organiqu

pas été équilibré comme il se doit à une valeur de pH comprise entre 7,8 et 8,0. Au besoin,

impuretés de la couche aqueuse. Pour nucléique a ét précipitation (Somma, 2004 ; Henry, 2008 ; Cseke et al., 2003 ; Cseke et al., 2011).

Précipitation : la

préféré au NaCl pour sa capacité de tamponnage. Dans ces conditions, le détergent, qui est

supplémentaire des sels résiduels (Somma, 2004 ; Henry, 2008 ; Cseke et al., 2003 ; Cseke et al., 2011). de purifier l'ADN génomique de source procaryote tel que d'E.

coli. Les cellules sont d'abord concentrées après centrifugation puis lysées. On réalise ensuite

une extraction au phénol ce qui permet de se débarrasser des protéines cellulaires. Les

molécules d'ARN sont éliminées par des RNase. Pour concentrer l'ADN, la méthode utilisée

est la précipitation à l'éthanol.

1) Lyse cellulaire et dénaturation des protéines :

Dans un tube à centrifuger en polypropylène, 3mL de culture d'E.coli sont introduit puis Centrifugé 5minutes à 150 g, le culot est dissolu dans 2,5 mL de tampon S.E (saline-EDTA, pH=8). Une solution de lysozyme de 0,15 mL est ajouté et incuber 30 minutes à 37°C puis

ajouter 0,2mL de SDS. Le mélange est incubé 10 minutes à 60°C, puis refroidi dans la glace

jusqu'à température ambiante. 0,60mL de NaCIO4 sont ajouté lentement et mélangé par

agitation douce (Nicolas et Daniel, 2000).

2) Extraction au phénol :

Un volume de 3,5mL de phénol saturé est mélangé par retournements successifs pendant 5

minutes de manière à maintenir une émulsion. Le tube est ensuite centrifugé à 16000 x g

pendant 5 min à température ambiante pour séparer la phase aqueuse de la phase phénolique.

La phase aqueuse supérieure, qui contient l'ADN génomique est récupérée dans un nouveau

tube, puis traitée de la même façon avec un mélange phénol/chloroforme. Après ce dernier

traitement la seconde solution aqueuse obtenue est additionné avec 100µg de RNase par mL,

puis le mélange est incubé 15 minutes à 37°C. Une autre extraction par le mélange

phénol/chloroforme est nouvellement appliquée, la phase aqueuse récupérée est mélangé avec

le même volume de chloroforme afin d'éliminer toute trace de phénol. Le tube est ensuite

centrifugé à 16000 x g pendant 5 min à température ambiante pour sépare la phase aqueuse de

la phase organique (Nicolas et Daniel, 2000).

3) Concentration de l'ADN par précipitation à l'éthanol

2,5 volumes d'éthanol à 95% et un volume V d'acétate de sodium à une concentration finale

de 0,3 M sont ajouté à un volume de la phase aqueuse, le mélange est incubé 30 minutes à -

20°C, puis centrifugé 15 minutes à 12000 g. Le culot obtenu est lavé par une solution

d'éthanol à 70%. Centrifuger à nouveau 5 minutes à 12000 g et éliminer le surnageant, le culot

est séché afin d'éliminer les traces d'éthanol. Le précipité est dissout dans 0,5mL de SSC

(sodium saline citrate) (Nicolas et Daniel, 2000).

II.1. Les plasmides : Rappel

¾ Existant in

¾ Présents chez nombreuses bactéries (quelques levures et mycètes) ¾ réplication autonome (=réplicons) indépendamment des chromosomes ¾ A information génétique non-essentielle po

¾ En nombre variable:

Plasmide à copie unique (1 seul/cellule hôte) Plasmides à copies multiples (40 ou + /cellule hôte)

II.2. Purification par Lyse alcaline :

à une

préparation sélective de l'ADN du plasmide contenu dans les bactéries, tout en éliminant l'ADN du chromosome bactérien selon les étapes suivantes (Turner et al., 2000; Cseke et al.,

2003 ; Cseke et al., 2011) :

9 Lyse des cellules par le détergent (SDS) en présence de soude (pH 13) donnant une

Dénaturation de l'ADN total,

9 Neutralisation rapide par acétate de potassium (pH 5,5) donnant une renaturation de

9 Concentration de l'ADN plasmidique par précipitation à l'alcool et récupération de

9 ribonucléases (hydrolyse sélective des ARN/ ADN intact). II.3. Purification par Gradient de chlorure de césium :

Les acides nucléiques sont séparés par ultracentrifugation isopycnique en chlorure de césium

(CsCl). Ce sel peut atteindre une densité très élevée, de l'ordre de 1.9 g/mL à 7.5mol/L. Cette

possibilité d'atteindre des densités si élevées en solution aqueuse est son principal avantage.

de leur densité indépendamment de leur taille ou de leur masse : elles se stabilisent en cours

de centrifugation au point où leur densité est égale à celle du milieu environnant. Cette

purification en grande quantité les plasmides bactériens (Figures 04) (Cseke et al., 2003 ;

Cseke et al., 2011).

Figure 04 : Purification de plasmide sur gradient de Chlorure de Césium (Cseke et al., 2011).

Chapitre II

Introduction :

cipe: Lyse cellulaire mécanique (congélation, billes de céramique ou détergents) ou enzymatique (lysozyme ou la lyticase), de

propriétés physico- chimiques entre les différents acides nucléiques et les protéines ; 2)

Parmi les acides ribonucléiques extraits des cellules les ARN messagers (ARNm) représente la

classe la plus étudié. Se caractérisent par la présence du côté 3'terminal d'une une longue

queue poly(A) synthétisée à la phase post-transcriptionnelle. s nucléases est préalablement chaque cellule.

avant toute lyse, lyse et homogénéisation seront menées en parallèle dans tous les autres

cas. Différentes méthodes de lyse cellulaire mécaniques ou enzymatiques existe selon les

types cellulaires. Les méthodes mécaniques sont destinées aux cellules et aux tissus par

contre les méthodes enzymatiques sont réservées aux bactéries, aux levures et aux virus afin

de dissoudre des structures (capsides, membranes bactériennes...) inaccessibles à la rupture

mécanique. Dans la plupart des cas, la lyse est réalisée dans des conditions dénaturantes pour

casser les cellules. En outre, la plupart des agents dénaturants utilisés sont de puissants

inhibiteurs des RNAses.

La méthode de référence décrite par Chirgwin et al. en 1979 homogénéisait les prélèvements

dans une solution 4 M de thiocyanate de guanidinium, agent puissant de dénaturation des protéines, additionné de beta2-mercaptoéthanol qui permet de rompre les ponts disulfures

protéiques (Chirgwin et al., 1979). Chomczynski et Sacchi ont ensuite amélioré cette méthode

on en combinant lyse au thiocyanate de guanidinium à la -chloroforme (Chomczynski et Sacchi ,1987).Cette modification ou lorsque actuelle, la plupart des coffrets disponibles sur le marché reposent sur ces deux principes avec des proportions de thiocyanate de guanidinium et phénol-chloroforme qui leur sont propres (SFBC, 2002). et de purification des ARN totaux : Initialement, toutes les préparations d'ARN impliquaient la lyse totale des cellules avec des

détergents forts et/ou du phénol et du tampon. Cela provoque une lyse immédiate des cellules

mais également une inactivation des RNases cellulaires en raison de l'action dénaturante du

détergent et du phénol. des sels dénaturants puissants sont utilisés tels que le guanidinium HCl

ou le thiocyanate de guanidinium (Chirgwin et al., 1979; Ullrich et al., 1977). La figure 9 montre un procédé couramment utilisé pour l'isolement de l'ARN cellulaire total (Greene,

1998).

Les cellules ou tissus cultivés sont lysés dans une solution de guanidinium. Le lysat est ensuite appliqué sur un gradient graduel avec une couche inférieure contenant 5,7 M de CsCl,

qui dépasse la densité de l'ADN mais pas celle de l'ARN. Lorsque ceci est centrifugé pendant

18h, l'ADN contaminant est piégé à l'interface entre le lysat et le CsCl haute densité, l'ARN

traversant la couche de CsCl et les granulés au fond. Ceci est simplement une étape de

fraction qui réalise une purification initiale de l'ARN. Le culot d'ARN est ensuite récupéré,

extrait avec du phénol chloroforme pour éliminer les protéines résiduelles, puis précipité. Si

une petite quantité de CsCl est dissoute dans le lysat (1 g / 1,5 ml de lysat), ceci ajoute une densité suffisante au lysat pour que les protéines s'accumulent sous la forme d'une bande

dénaturée au sommet. Cette procédure peut également être utilisée pour préparer un ADN

(Greene, 1998).

Figure 05 : (Greene, 1998).

III. Mé et de purification des ARN messagers :

(A+)) et non les ARN totaux (Tableau 01). En effet, dans une cellule de mammifère, les ARN messagers cod moins de 10 % des ARN totaux produits. Les 90 % restants correspondent aux ARN impliqués dans les étapes transcriptionnelles ou traductionnelles (ARN ribosomaux (28S, 18S et 5S), ARN de transfert, ARN nucléaires et ARN mitochondrial. Cette approche permet ainsi

transfert les plus abondants, notamment pour les transcrits faiblement exprimés. Elle est

utilisée pour : 1) le northern blot lorsque les ARNm sont présents en faible quantité; 2) la

réalisation de la technique de RNA mapping

réalisation de la technique de mRNA différentiel display; 5) la réalisation de traduction in

vitro; 6) la réalisation de la technique de Rnase protection assay consistant à utiliser une sonde

-à-vis des

1982 ;SFBC, 2002). Il se fixe sélectivement par complémentarité de séquence sur des

purifiés à partir des ARN totaux préalablement extraits, soit directement à partir du

Figure 06 :

1998).

Différents procédés sont utilisés : 1) par exemple, les Coffrets Sigma utilisent des oligo (dT)

30 liés de façon covalente à des billes de polystyrène de un micromètre pour capter par

hybridation des ARN polyadénylés. Les polystyrènes donnent moins de liaisons non billes de latex coatées par des oligo (dT). Dans des conditions très salines, les ARN poly(A) se lient aux particules de latex à 68oC. Les billes latex-ARNm sont remises en suspension dans un tampon de lavage et transférées sur un filtre permettant de recueillir facilement les billes de latex. Après deux lavages, les ARNm sont élués dans un tampon peu salin ou de -free ; 3) les coffrets Roche Diagnostics et Promega (PolyA Tract System 1 000®)

utilisent des sondes oligo (dT) 20 marquées à la biotine et des billes magnétiques coatées à la

streptavidi biologie. Les hybrides sont ainsi capturés grâce aux billes magnétiques (SFBC, 2002)..

Tableau 01 : tions

(SFBC, 2002).

Application ARN totaux ARN poly (A)

Northern blot ++ +++

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