Isolierung Identifizierung und biochemische Charakterisierung PDF

Enzyme Technology der Firma Henkel KGaA Düsseldorf und für das mir entgegengebrachte. Vertrauen. spektroskopischen Aktivitätsmessungen verwendet.

Selektive biokatalytische Hydroxylierung von Prolin und

10 oct. 2011 Enzyme sind aus L-Aminosäuren aufgebaut die die Polypeptidkette bilden und die dreidimensionale Struktur der Enzyme bestimmen.

3 Ergebnisse und Diskussion

2.10 Optimierung der Biokatalyse in verschiedenen Systemen. vielfach enzymatische Verfahren mit isolierten Enzymen zur Cofaktor-Regenerierung einge-.

Identifizierung aktiver und enantioselektiver Hydrolasen für den

30 nov. 2001 Entwicklung eines biokatalytischen Prozesses. ... Zugabe weiterer Reagenzien gestartet. Dagegen sollte bei der Aktivitätsmessung von Enzymen.

Anwendung poröser Adsorbentien in der Biokatalyse

23 nov. 2012 Im Experiment wurde eine Aktivitätsmessung mit freiem Enzym durchge- führt und dieselbe Menge Enzym auf Trisopor-Trägern (200 mg optimale.

Biokatalyse

ohne Enzyme Tausende von Jahren dauern wäre Die Biokatalyse findet im aktiven Zentrum(acti- ... Die AChE-Aktivitätsmessung mit dem kineti-.

Einsatz von Magnettechnologie bei der Biokatalyse und

31 oct. 2004 Förderschwerpunkt Biotechnologie: InnovationsCentrum Biokatalyse ... Enzymen direkt aus feststoffhaltigen Medien über an magnetische ...

Projektkennblatt Deutschen Bundesstiftung Umwelt

30 juin 2015 Biokatalytische Modifikation von Polyesterfaseroberflächen zur ... mittels rationalem Proteindesign zur Gewinnung von Enzymen mit.

Anwendung von Feinblasentechnologie in der Biokatalyse

erhältliches industrielles Enzym weshalb leider keine Information zum Ursprungsorganismus vorliegt. In ersten Aktivitätsmessungen mit dem Substrat

Entwicklung einer Methode zur Immobilisierung von Peroxidasen an

12 déc. 2017 4.2 Analysen zur Charakterisierung der Enzyme . ... den Aktivitätsmessungen ergaben eine rasche Desorption von lediglich adsorptiv gebun-.

Isolierung, Identifizierung und

biochemische Charakterisierung

Dialkylphthalat spaltender Esterasen

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der

angefertigt am Institut für Molekulare Enzymtechnologie Henkel KGaA, Düsseldorf, Abteilung Enzyme Technology vorgelegt von

André Pütz

aus Salzgitter

November, 2006

Aus dem Institut für Molekulare Enzymtechnologie

Gedruckt mit der Genehmigung der

Korreferent: Prof. Dr. J. Pietruszka

Tag der mündlichen Prüfung: 15.01.2007

When you walk through a storm

Hold your head up high

And don't be afraid of the dark.

At the end of a storm

Is a golden sky

And the sweet, silver song of a lark.

Walk on, through the wind,

Walk on, through the rain,

Though your dreams be tossed and blown.

Walk on, walk on with hope in your heart,

And you'll never walk alone,

You'll never walk alone...

(Richard Rodgers and Oscar Hammerstein II, 1945)

Danksagungen

wissenschaftliche Unterstützung, die hervorragenden Arbeitsbedingungen und die mir Bei Herrn Prof. Dr. Pietruszka, Lehrstuhl für Bioorganische Chemie der Heinrich-Heine- Ich danke Herrn Dr. Karl-Heinz Maurer für die Bereitstellung eines Laborplatzes in der VTB Enzyme Technology der Firma Henkel KGaA, Düsseldorf und für das mir entgegengebrachte Vertrauen. Desweiteren danke ich Herrn Dr. Andreas Michels für die stetige Bereitschaft für Herrn Dr. Thorsten Eggert bin ich aufgrund anregender Diskussionen im Rahmen meiner

Arbeit überaus dankbar.

Ein großer Dank geht an alle Mitglieder des Institutes für Molekulare Enzymtechnologie der Düsseldorf. Im Besonderen gilt mein Dank Stefan Evers, der mich vor einem folgenschweren Gunnar Schmidt, Hauke Wulff und Andrea Tapalaga danke ich für ihr Engagement und ihre mich in den letzten Jahren immer wieder aufbaute und mir die Kraft gab, diese "Geschichte" durchzustehen.

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung ................................................................................................................. 1

1 Summary ................................................................................................................................ 2

2 Theoretische Grundlagen ..................................................................................................... 3

2.1 Esterasen und Lipasen: Gemeinsamkeiten und Unterschiede .......................................... 4

2.1.1 Nomenklatur lipolytischer Enzyme ........................................................................... 4

2.1.2 Strukturverwandtschaft und katalytischer Mechanismus .......................................... 4

2.1.3 Unterscheidung von Esterasen und Lipasen .............................................................. 7

2.2 Esterasen: Ein Überblick .................................................................................................. 8

2.2.1 Physiologische Funktion von Esterasen .................................................................... 8

2.2.2 Industrielle Bedeutung von Esterasen ....................................................................... 9

2.2.3 Quellen neuer Biokatalysatoren .............................................................................. 11

2.3 Esterasen aus Bacillus sp. ............................................................................................... 13

2.5 Enzymatische Hydrolyse von Polyethylenterephthalat (PET) und PET-Esterasen ...........

als Zusatz für neue Waschmittel .................................................................................... 17

2.6 Ziele dieser Arbeit .......................................................................................................... 19

3 Material und Methoden ...................................................................................................... 21

3.1 Chemikalien und Enzyme ............................................................................................... 21

3.3 Oligonukleotide .............................................................................................................. 23

3.4 Anzucht und Lagerung von Bakterien ............................................................................ 24

3.4.1 Kurzfristige Lagerung ............................................................................................. 25

3.4.2 Langfristige Lagerung ............................................................................................. 26

3.5.1 Isolierung genomischer DNA .................................................................................. 26

3.5.3 Konzentrationsbestimmung von DNA .................................................................... 27

3.6.1 DNA-Extraktion aus Agarose-Gelen ....................................................................... 28

3.7 In vitro Rekombination von DNA .................................................................................. 28

3.7.1 Standardprozeduren ................................................................................................. 28

3.7.2 Genombanken .......................................................................................................... 28

3.8 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA ......................................................... 29

3.9 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ................................................................................. 30

3.9.1 Standard-PCR-Reaktion .......................................................................................... 30

3.9.2 Ortspezifische Mutagenese ...................................................................................... 31

3.9.3 Sequenzierung von DNA ......................................................................................... 31

3.9.4 Zufallsmutagenese ................................................................................................... 31

3.14 Fast Protein Liquid Chromatographie (FPLC) ............................................................ 33

3.15 Bestimmung der Proteinkonzentration ......................................................................... 35

3.16 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) .................................................................. 35

Inhaltsverzeichnis

3.19 Herstellung von Polyethylenterephthalat-Nanopartikeln ............................................. 39

3.22 Gekoppelte Gaschromatographie/Massenspektroskopie (GC/MS) .............................. 41

3.23 Gekoppelte Flüssigchromatographie/Massenspektroskopie (LC/MS) ......................... 42

3.24 Dünnschichtchromatographie ....................................................................................... 42

3.25 Auftragsarbeiten ........................................................................................................... 42

3.25.1 R

IBOPRINT-Analyse von Bodenisolaten ................................................................ 42

3.25.2 Sequenzierung von DNA ....................................................................................... 43

3.25.3 MALDI-TOF-Analyse von Proteinen ................................................................... 43

3.25.4

H-NMR (Kernresonanzspektroskopie) ................................................................ 43

3.26 Computerprogramme und Online-Datenbanken .......................................................... 43

4 Ergebnisse ............................................................................................................................ 44

4.1 Mikrobiologisches screening, Isolierung und Identifizierung von Mikroorganismen ......

4.2 Biochemische Reinigung des Dialkylphthalat hydrolysierenden Enzyms aus dem

isolierten Stamm Bacillus subtilis 17A1 ........................................................................ 45

4.3 Massenspektrometrische Proteinanalytik des gereinigten Enzyms ................................ 47

4.4 Identifizierung der kodierenden DNA-Bereiche der para-Nitrobenzyl-Esterasen ............

pNB-Est17 und pNB-Est19 ............................................................................................ 48

und Bacillus licheniformis 19C5 und Isolierung esterolytisch aktiver Klone ......... 48

4.4.2 Identifizierung der open reading frames für die para-Nitrobenzyl-Esterasen ...........

pNB-Est17 und pNB-Est19 und Vergleich mit der pNB-Esterase aus Bacillus

licheniformis DSM13 .............................................................................................. 49

4.5 Subklonierung der pNB-Est17 und pNB-Est19, Klonierung der para-Nitrobenzyl-

Esterase aus genomischer DNA von B. licheniformis DSM13 (pNB-Est13),

Überexpression und Reingung ....................................................................................... 53

4.5.1 Spezifische Amplifizierung der pNB-Esterase-Gene mittels PCR ......................... 53

4.5.2 Heterologe Überexpression der pNB-Esterasen in E. coli und deren ........................

4.6 Analytischer Nachweis der Hydrolyseprodukte von verschiedenen .................................

Dialkylphthalaten nach Inkubation mit den para-Nitrobenzyl-Esterasen ........................

pNB-Est17, pNB-Est19 und pNB-Est13 ........................................................................ 56

4.7 Biochemische Charakterisierung der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten ..................

para-Nitrobenzyl-Esterasen ........................................................................................... 58

4.7.2 Temperatur-Optimum der pNB-Est13 ..................................................................... 59

4.7.4 pH-Optimum der pNB-Est13 .................................................................................. 61

4.7.7 Biochemische Charakterisierung der untersuchten para

-Nitrobenzyl-Esterasen gegenüber unterschiedlichen Phthalaten und Terephthalaten ................................. 64

Inhaltsverzeichnis

III

4.7.7.1 pNB-Est17, pNB-Est19 und pNB-Est13 zeigen divergierende Substrat-

der Seitenketten ................................................................................................ 64

des Substrates zum katalytischen Zentrum ....................................................... 66

4.7.7.3 Zusammenfassung aller kinetischen Daten der unersuchten para- ......................

Nitrobenzyl-Esterasen gegenüber den vermessenen Phthalaten .........................

und Terephthalaten ........................................................................................... 68

4.7.9 Einfluß von Detergenzien und Metallsalzen auf pNB-Est13 .................................. 72

4.7.11 Sekretierbarkeit der pNB-Est19 ............................................................................ 75

4.8.2 pNB-Est17, pNB-Est19 und pNB-Est13 hydrolysieren Bis-(p-methylbenzoe-

PET-Dimer; pNB-Est19 den kleinsten k

M -Wert ..................................................... 78

4.8.4 Einbettung von PET-Dimer in eine Agarmatrix ...................................................... 79

4.8.5 epPCR der pNB-Est13 ............................................................................................. 81

4.8.6 Rationales Proteindesign ......................................................................................... 82

4.9 Enzymatische Hydrolyse von PET-Nanopartikeln durch pNB-Est13 ............................ 83

5 Diskussion ............................................................................................................................. 85

B. licheniformis 19C5 sind para-Nitrobenzyl-Esterasen ............................................... 86

5.3 Die para-Nitrobenzyl-Esterase aus Bacillus licheniformis DSM13............................... 88

5.5 Biochemische Charakterisierung der para-Nitrobenzyl-Esterasen pNB-Est17, ...............

pNB-Est19 und pNB-Est13 ............................................................................................ 89

5.5.1 Die untersuchten p-Nitrobenzyl-Esterasen zeigen gegenüber ....................................

M -Wert .................. 94

5.5.3 Hydrolyseprodukt nach Inkubation der pNB-Esterasen mit Dialkylphthalaten .........

ist jeweils der korrespondierende Monoester .......................................................... 95

5.6 PET-Dimer als neues Modellsubstrat ............................................................................. 96

5.7 Enzymatische Hydrolyse von PET-Nanopartikeln ......................................................... 98

5.8 Sekretion der pNB-Est19 durch Bacillus subtilis TEB1030 .......................................... 99

6 Ausblick .............................................................................................................................. 101

7 Literaturverzeichnis .......................................................................................................... 103

8 Anhang ................................................................................................................................ 124

8.1 DNA-Sequenz des inserts vom isolierten Genombank-Klon 17A1-A8 ....................... 124

8.2 DNA-Sequenz des inserts vom isolierten Genombank-Klon 19C5-A4 ....................... 125

B. subtilis 17A1, B. licheniformis 19C5 und B. licheniformis DSM13 ....................... 126 8.4 M

ICHAELIS-MENTEN-Kinetiken der pNB-Est17 ........................................................... 127

8.5 M

ICHAELIS-MENTEN-Kinetiken der pNB-Est19 ........................................................... 128

8.6 M

ICHAELIS-MENTEN-Kinetiken der pNB-Est13 ........................................................... 129

Abkürzungsverzeichnis

Im Folgenden sind die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Abkürzungen aufgelistet.

°C Grad Celsius

Abb. Abbildung

B. Bacillus

BBP Butylbenzylphthalat

(bi)dest. (zweifach) destilliert

BLAST basic local alignment search tool

bp Basenpaar(e)

BSA Rinderserumalbumin

bzw. beziehungsweise

C Cytosin / Kohlenstoff

c Konzentration ca. circa cm Zentimeter 560nm

Differenz der Molaren Extink-

tionskoeffizienten bei 560 nm d.h. das heißt

Da Dalton

DBP Dibutylphthalat

ddNTP Didesoxy-Nukleotidtriphosphate der Zeit

DEHP Diethylhexylphthalat

DEP Diethylphthalat

Dest. destilliert

DET Diethylterephthalat

DMIP Dimethylisophthalat

DMP Dimethylphthalat

DMSO Dimethylsulfoxid

DMT Dimethylterephthalat

dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat

DSMZ Deutsche Stammsammlung für

Mikroorganismen & Zellkulturen

DTE Dithiorythrol

DTT Dithiothreitol

E. Escherichia

E Extinktion

EC Enzymklasse

EK Endkonzentration

ep error-prone

EPPS 4-(2-Hydroxyehtyl)-piperazin-1-

et al. et aliteri, und andere

Fa. Firma

g Gramm; bei Zentrifugation

GC/MS Gaschromatographie /

Massenspektroskopie

Haftung

h Stunde

HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-piperazin-2-

IPTG Isopropyl-ȕ-thiogalactopyranosid

k Kilo (10 3 l Lichtweg

L Liter

L. Lactobacillus

LB L

URIA-BERTANI

LC/MS Flüssigchromatographie /

Massenspektroskopie

ln logarithmus naturalis, natürlicher Logarithmus

µ Mikro (10

-6 m Meter; Milli (10 -3

M Molar (mol / Liter), Mega (10

MALDI matrix assisted laser

desorption ionisation

MEP Monoethylphthalat

min Minute mol Mol

MW Molekulargewicht

MWCO molecular weight cut-off

n Nano (10 -9

N Norm, Formel 3.1: Anzahl der

n.b. nicht bestimmt

OD Optische Dichte

ORF open reading frame, offener

Leserasterrahmen

p Pico (10 -12

P gewünschte Wahrscheinlichkeit

P T7

T7-Promotor

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PCR polymerase chain reaction,

Polymerasekettenreaktion

PET Polyethylenterephthalat

pH negativer dekadischer Logarith- mus der Protonenkonzentration

PLE pig liver esterase, Scheineleber-

Esterase

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

pNB-Est para-Nitrobenzyl-Esterase pNPA para-Nitrophenyl-Acetat

Q Pufferfaktor

Abkürzungsverzeichnis

V R F ratio of fronts; Substanz- rpm Umdrehungen pro Minute; rounds per minute

RT Raumtemperatur

s. siehe

SDS Natriumdodecylsulfat

s.o. siehe oben sp. Spezies s.u. siehe unten

T Thymin, Temperatur

T T7

T7-Terminator

Tab. Tabelle

TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer

TB T

ERRIFIC-BROTH

TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer

TMS Tetramethylsilan TOF time of flight

Tris Tris(hydroxymethyl)-

aminomethan

UV Ultaviolettes Licht

V Volt

Reaktion

Reaktionsvolumen

Vol. Volumen

v/v Volumeneinheit pro

Volumeneinheit

v/vm vom Reaktorvolumen

Vol. Volumen

WT Wildtyp

w/v Masseneinheit pro

Volumeneinheit

z.B. zum Beispiel

Alanin Ala A

Arginin Arg R

Asparagin Asn N

Aspartat Asp D

Cystein Cys C

Glutamat Glu E

Glutamin Gln Q

Glycin Gly G

Histidin His H

Isoleucin Ile I Leucin Leu L

Lysin Lys K

Methionin Met M

Phenylalanin Phe F

Prolin Pro P

Serin Ser S

Threonin Thr T

Tryptophan Trp W

Tyrosin Tyr Y

Valin Val V

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

Abb. 2.1: Schematische Darstellung der Hydrolyse von Triglyceriden durch Esterasen und Lipasen. .. 4

Abb. 2.2: Schemtische Darstellung des Į/ȕ-Hydrolase-Faltungsmotivs nach OLLIS et al. (1992). ......... 5

Abb. 2.3: Reaktionsmechanismus von Esterasen und Lipasen................................................................ 6

Abb. 2.4: Schematische Darstellung der MICHAELIS-MENTEN-Kinetiken von Esterasen und .................

Lipasen im Vergleich nach S

ARDA & DESNUELLE (1958). ..................................................... 7

Abb. 3.1: Schematischer Aufbau zur Herstellung von Polyethylenterephthalat-Nanopartikeln. .......... 40

EIM & POE (1944). ............................. 41

Agarplatten. ........................................................................................................................... 44

Abb. 4.2: SDS-PAGE aller durchgeführten Reinigungsschritte ausgehend vom Rohextrakt. .............. 47

Abb. 4.3: Titrationskurve des biochemisch gereinigten Enzyms aus B. subtilis 17A1. ........................ 47

Abb. 4.4: Dünnschichtchromatographische Analyse von Diethylterephthalat nach Inkubation ..............

mit Rohextrakten esterolytisch aktiver Genombank-Klone................................................... 49

Abb. 4.5: ORF - Analyse der genomischen Fragmente der isolierten, esterolytisch aktiven ...................

Genombank-Klone. ............................................................................................................... 50

DSM13, B. subtilis 168, B. licheniformis 19C5 und B. subtilis 17A1. ................................. 52

Abb. 4.7: Schematische Darstellung zur Klonierung der para-Nitrobenzyl-Esterasen. ........................ 53

Abb. 4.8: SDS-PAGE-Analyse der untersuchten para-Nitrobenzyl-Esterasen. .................................... 54

gegenüber p-Nitrophenyl-Acetat als Substrat nach der Methode von C

HEN et al. (1995b). . 55

Abb. 4.10: Schematische Darstellung der durch die in der vorliegenden Arbeit charakterisierten ............

para-Nitrobenzyl-Esterasen katalysierten Reaktionen von Dimethylphthalat, ........................ Diethylphthalat, Dimethylphthalat, Diethylphthalat, Dibutylphthalat, Dimethylisophthalat ...

und Phenylbenzoat. ............................................................................................................... 57

Abb. 4.11: Temperaturverlaufskurve der enzymatischen Reaktion von pNB-Est13 und pNP-Acetat. ... 59quotesdbs_dbs25.pdfusesText_31

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[PDF] Isolierung Identifizierung und biochemische Charakterisierung

Isolierung, Identifizierung und

Dialkylphthalat spaltender Esterasen

Inaugural-Dissertation

Erlangung des Doktorgrades der

André Pütz

November, 2006

Gedruckt mit der Genehmigung der

Korreferent: Prof. Dr. J. Pietruszka

Tag der mündlichen Prüfung: 15.01.2007

When you walk through a storm

Hold your head up high

And don't be afraid of the dark.

At the end of a storm

Is a golden sky

And the sweet, silver song of a lark.

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Walk on, through the rain,

Though your dreams be tossed and blown.

Walk on, walk on with hope in your heart,

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You'll never walk alone...

Danksagungen

Arbeit überaus dankbar.

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung ................................................................................................................. 1

1 Summary ................................................................................................................................ 2

2 Theoretische Grundlagen ..................................................................................................... 3

2.1 Esterasen und Lipasen: Gemeinsamkeiten und Unterschiede .......................................... 4

2.1.1 Nomenklatur lipolytischer Enzyme ........................................................................... 4

2.1.2 Strukturverwandtschaft und katalytischer Mechanismus .......................................... 4

2.1.3 Unterscheidung von Esterasen und Lipasen .............................................................. 7

2.2 Esterasen: Ein Überblick .................................................................................................. 8

2.2.1 Physiologische Funktion von Esterasen .................................................................... 8

2.2.2 Industrielle Bedeutung von Esterasen ....................................................................... 9

2.2.3 Quellen neuer Biokatalysatoren .............................................................................. 11

2.3 Esterasen aus Bacillus sp. ............................................................................................... 13

2.5 Enzymatische Hydrolyse von Polyethylenterephthalat (PET) und PET-Esterasen ...........

2.6 Ziele dieser Arbeit .......................................................................................................... 19

3 Material und Methoden ...................................................................................................... 21

3.1 Chemikalien und Enzyme ............................................................................................... 21

3.3 Oligonukleotide .............................................................................................................. 23

3.4 Anzucht und Lagerung von Bakterien ............................................................................ 24

3.4.1 Kurzfristige Lagerung ............................................................................................. 25

3.4.2 Langfristige Lagerung ............................................................................................. 26

3.5.1 Isolierung genomischer DNA .................................................................................. 26

3.5.3 Konzentrationsbestimmung von DNA .................................................................... 27

3.6.1 DNA-Extraktion aus Agarose-Gelen ....................................................................... 28

3.7 In vitro Rekombination von DNA .................................................................................. 28

3.7.1 Standardprozeduren ................................................................................................. 28

3.7.2 Genombanken .......................................................................................................... 28

3.8 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA ......................................................... 29

3.9 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ................................................................................. 30

3.9.1 Standard-PCR-Reaktion .......................................................................................... 30

3.9.2 Ortspezifische Mutagenese ...................................................................................... 31

3.9.3 Sequenzierung von DNA ......................................................................................... 31

3.9.4 Zufallsmutagenese ................................................................................................... 31

3.14 Fast Protein Liquid Chromatographie (FPLC) ............................................................ 33

3.15 Bestimmung der Proteinkonzentration ......................................................................... 35

3.16 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) .................................................................. 35

Inhaltsverzeichnis

3.19 Herstellung von Polyethylenterephthalat-Nanopartikeln ............................................. 39

3.22 Gekoppelte Gaschromatographie/Massenspektroskopie (GC/MS) .............................. 41

3.23 Gekoppelte Flüssigchromatographie/Massenspektroskopie (LC/MS) ......................... 42

3.24 Dünnschichtchromatographie ....................................................................................... 42

3.25 Auftragsarbeiten ........................................................................................................... 42

3.25.1 R

3.25.2 Sequenzierung von DNA ....................................................................................... 43

3.25.3 MALDI-TOF-Analyse von Proteinen ................................................................... 43

3.25.4

3.26 Computerprogramme und Online-Datenbanken .......................................................... 43

4 Ergebnisse ............................................................................................................................ 44

4.1 Mikrobiologisches screening, Isolierung und Identifizierung von Mikroorganismen ......

4.2 Biochemische Reinigung des Dialkylphthalat hydrolysierenden Enzyms aus dem

4.3 Massenspektrometrische Proteinanalytik des gereinigten Enzyms ................................ 47

4.4 Identifizierung der kodierenden DNA-Bereiche der para-Nitrobenzyl-Esterasen ............

4.4.2 Identifizierung der open reading frames für die para-Nitrobenzyl-Esterasen ...........

4.5 Subklonierung der pNB-Est17 und pNB-Est19, Klonierung der para-Nitrobenzyl-

4.5.1 Spezifische Amplifizierung der pNB-Esterase-Gene mittels PCR ......................... 53