[PDF] Entwicklung einer Methode zur Immobilisierung von Peroxidasen an

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Selektive biokatalytische Hydroxylierung

von Prolin und Prolinanaloga mittels Eisen(II)/Į-Ketoglutarat

INAUGURALDISSERTATION

zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von

Christian Peter Klein

aus Saarlouis 2011
Vorsitzender des Promotionsausschusses: Prof. Dr. Rolf Schubert

Referent: Prof. Dr. Michael Müller

Korreferent: Prof. Dr. Andreas Bechthold

Datum der Promotion: 10.10.2011

James Bond

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Juli 2008 bis April 2011 am Lehrstuhl für der Leitung von Herrn Dr. Wolfgang Hüttel und Herrn Prof. Dr. Michael Müller angefertigt.

Mein besonderer Dank gilt:

mich für die sehr gute Einführung in die Arbeitsmethodik, die stete Bereitschaft zu

ƒ Herrn Prof. Dr. Michael Müller für die Übernahme des Referates sowie für die

freundschaftliche Betreuung, viele hilfreiche Anregungen und die ausgezeichneten

Arbeitsbedingungen.

ƒ Herrn Prof. Dr. Andreas Bechthold für die Übernahme des Koreferats. ƒ Herrn Prof. Dr. Manfred Jung für die Mitwirkung bei der Promotionsprüfung. Laboralltag und bei den durchgeführten Synthesen. ƒ Herrn Volker Brecht für die hervorragende NMR-Analytik, insbesondere von schwierigen Proben, und die Unterstützung bei MS-MS Messungen. ƒ Herrn Dr. Philippe Bisel für die fachlichen Diskussionen. ƒ Den studentischen Hiwis Franziska Unger, Petko Apostolov, Julian Haas und Jose Luis

Romero für ihre Hilfe im Laboralltag.

des ChemBioTec P Nachhaltige Biokatalytische Oxidationsprozesse

13234).

ƒ Meinen Eltern und Großeltern für Ihre Unterstützung.

ƒ Judith.

Wissenschaftliche Publikationen:

C. Klein, W. Hüttel: A Simple Procedure for Selective Hydroxylation of L-Proline and L-Pipecolic Acid with Recombinantly Expressed Proline Hydroxylases, Adv. Synth. Catal.

2011, 353, 1375 1383.

C. Klein, W. Hüttel: Tertiary Alcohol Preferred Hydroxylation of trans-3-Methyl-L-proline with Prolinehydroxylases, Manuskript zur Einreichung im Beilstein J. Org. Chem. (angenommen 11/2011). M. Müller, C. Klein: Bookreview: Practical Biotransformations. A Beginner's Guide. Postgraduate Chemistry Series, von Gideon Grogan. Angewandte Chemie. 2009, 121, 8321-

8322; Angewandte Chemie Int. Ed. 2009, 48, 8175-8176.

Poster:

C. Klein, W. Hüttel, M. Müller: Converting free L-proline by heterologously overexpressed microbial prolinehydroxylases into hydroxylated derivatives, Tag der Wissenschaft der

Posterpreises für Pharmazeutische Chemie.

C. Klein, M. Müller, Wolfgang Hüttel: In vivo conversion of trans-3-hydroxy-L-proline by heterologously overexpressed microbial trans-4-prolinehydroxylase, Tag der Wissenschaft

Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung ............................................................................... 1

2. Einleitung ............................................................................................. 3

2.1. Enzyme .................................................................................................. 3

2.1.1. Enzyme in der Biotechnologie ................................................................................ 4

2.1.2. C-H aktivierende Enzyme ....................................................................................... 4

2.2. Oxidoreduktasen ................................................................................... 5

2.2.1. Oxygenasen ............................................................................................................. 5

2.2.2. Cytochrom P450 Enzyme ........................................................................................ 6

2.2.4. Eisen(III) Dioxygenasen .......................................................................................... 8

2.3.1. Struktur und Bindungsmodus ................................................................................ 11

2.3.2. Hydroxylierungsmechanismus .............................................................................. 14

2.4. Prolylhydroxylasen ............................................................................. 16

2.5. Prolinhydroxylasen ............................................................................. 17

2.5.1. Technische Produktion der Hydroxyproline ......................................................... 19

2.6. Aufgabenstellung ................................................................................ 22

3. Spezieller Teil .................................................................................... 24

3.1. Molekularbiologische Arbeiten........................................................... 24

3.1.1. Produktion der Prolinhydroxylasen ....................................................................... 24

3.2. Analytische Arbeiten ........................................................................... 29

3.2.1. Entwicklung eines HPLC- und kolorimetrischen Assays ..................................... 29

3.3. in vivo Herstellung von Hydroxy-L-prolinen ...................................... 36

3.4. Substratspektrum der Prolinhydroxylasen .......................................... 41

3.4.1. Nicht-physiologische Cosubstrate ......................................................................... 41

3.4.2. Prolinanaloga ......................................................................................................... 43

3.4.2.3. 3,4-Dehydro-L-prolin ............................................................................................. 48

3.4.3. Entwicklung eines in vivo Systems für die Produktion von hydroxylierten

Prolinanaloga ......................................................................................................... 50

3.4.3.1. Hydroxy-L-proline ................................................................................................. 53

3.4.3.2. trans-3-Methyl-L-prolin ........................................................................................ 56

3.4.3.3. alpha-Methyl-L-prolin ........................................................................................... 60

3.4.4. Weitere untersuchte Substrate ............................................................................... 63

3.5. Gerichtete Mutagenese ........................................................................ 66

cisP3H_II ............................................................................................................... 73

4. Diskussion und Ausblick .................................................................. 80

5. Experimenteller Teil ......................................................................... 84

5.1. Materialien und Methoden .................................................................. 84

5.1.1. Chemikalien und Reagenzien ................................................................................ 84

5.1.2. Analytik ................................................................................................................. 84

5.1.3. Kulturmedien, Wachstumsbedingungen und Stammhaltung ................................ 87

5.1.4. Molekularbiologische und Proteinbiochemische Methoden ................................. 89

Prolinhydroxylasen ............................................................................. 99

5.2.1. Proteinproduktion und Isolierung .......................................................................... 99

5.2.3. Cosubstratspektrum der Prolinhydroxylasen ....................................................... 101

5.2.4. Substratspektrum der Prolinhydroxylasen ........................................................... 102

5.3. Produkte der enzymatischen Synthese .............................................. 104

5.3.1. trans-4-Hydroxy-L-prolin ((2S,4R)-4-Hydroxyprolin) ........................................ 104

5.3.2. cis-3-Hydroxy-L-prolin ((2S,3R)-3-Hydroxyprolin) ........................................... 105

5.3.3. cis-4-Hydroxy-L-prolin ((2S,4S)-4-Hydroxyprolin) ............................................ 106

5.3.8. trans-3,4-Epoxy-L-prolin ((1R,2S,5S)-3,4-Epoxyprolin) .................................... 109

5.3.9. cis-3,4-Epoxy-L-prolin ((1S,2S,5R)-3,4-Epoxyprolin) ........................................ 110

5.3.10. trans-2,3-cis-3,4-Dihydroxy-L-prolin ((2S,3R,4S)-3,4-Dihydroxyprolin) .......... 110

5.3.11. trans-2,4-Hydroxy-trans-2,3-methyl-L-prolin ((2S,3R,4R)-4-Hydroxy-3-

methylprolin) ....................................................................................................... 111

5.3.12. cis-3-Hydroxy-trans-3-methyl-L-prolin ((2S,3R)-3-Hydroxy-3-methylprolin) .. 112

5.3.13. trans-4-Hydroxy-Į-methyl-L-prolin ((2S,4R)-4-Hydroxy-2-methylprolin) ........ 113

5.3.14. cis-3-Hydroxy-Į-methyl-L-prolin ((2S,3R)-3-Hydroxy-2-methylprolin) ............ 114

5.4. Chemische Synthesen ....................................................................... 115

5.4.2. cis-4-Chlor-L-prolin und cis-4-Azid-L-prolin ...................................................... 117

5.4.2.1. N-tert-Butoxycarbonyl-trans-4-hydroxy-L-prolinethylester ............................... 117

5.4.2.2. cis-4-Chlor-L-prolin ((2S,4S)-4-Chloroprolin) .................................................... 119

5.4.2.3. cis-4-Azid-L-prolin ((2S,4S)-4-Azidoprolin) ....................................................... 121

5.4.3. Versuche zur Synthese von trans-3-Chlor-L-prolin und trans-3-Azid-L-

prolin ................................................................................................................... 124

6. Abkürzungsverzeichnis .................................................................. 130

7. Abbildungsverzeichnis .................................................................... 134

8. Tabellenverzeichnis ......................................................................... 139

9. Anhang ............................................................................................. 140

Dactylosporangium sp. RH1 ............................................................. 140 Sinorhizobium meliloti ...................................................................... 141 Streptomyces sp. TH1 ....................................................................... 142 Streptomyces sp. TH1 ....................................................................... 143

9.5. Alignments ........................................................................................ 144

9.5.1. Alignment transP4H und cisP4H ........................................................................ 144

9.5.2. Alignment transP4H und cisP3H_I ..................................................................... 144

9.5.3. Alignment transP4H und cisP3H_II ................................................................... 145

9.5.4. Alignment cisP3H_I und cisP3H_II .................................................................... 146

9.5.5. Alignment cisP3H_I und cisP4H ........................................................................ 146

9.5.6. Alignment cisP3H_II und cisP4H ....................................................................... 147

9.5.7. Alignment transP4H und Ectoinhydroxylase EctD aus Virgibacillus

salexigens ............................................................................................................ 147

9.5.8. Alignment transP4H und Halogenase SyrB2 aus Pseudomonas syringae

pv. syringae ......................................................................................................... 148

10. Literaturverzeichnis ........................................................................ 150

ZUSAMMENFASSUNG

1

1. Zusammenfassung

Die enzymkatalysierte selektive Oxidation von nicht-aktivierten Kohlenstoff-Wasserstoff Bindungen ist von großer Bedeutung für die Generierung von enantiomerenreinen Substanzen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem durch hydroxylierte Prolinanaloga regio- und stereoselektiv aufgebaut werden (Abb. 1). Abb. 1: Prolinhydroxylase katalysierte Oxidationen. trans-4-Prolinhydroxylase (transP4H), cis-4-Prolinhydroxylase (cisP4H), cis-3- Prolinhydroxylase Typ I (cis3PH_I) und cis-3-Prolinhydroxylase Typ II (cisP3H_II) wurden in Anwesenheit von Chaperonen durch das gleiche Expressionssystem heterolog in E. coli Prolinhydroxylasen durch HPLC-Analytik einfach und schnell nebeneinander zu identifizieren sind. Bei der Charakterisierung der isolierten Enzyme zeigte sich eine starke NHO OH NHO OH HN NHO OH NHO OH CH3 NHO OH CH3 NHO OH NHO OH NHO OH HO HO OH NHO OH NHO OH NHO OH OH HO HO NHO OH CH3 NHO OH CH3 HO HO NHO OH O NHO OH O NHO OH CH3 NHO OH CH3 HO OH NHO OH HO NHO OH OH OH cisP4H cisP3H_I transP4H cisP4H cisP4H transP4H transP4H transP4H transP4H transP4H cisP3H_I cisP3H_II cisP3H_II cisP3H_II cisP3H_I cisP4H cisP4H O OH HN O OH OH cisP3H_II cisP3H_II cisP3H_II

ZUSAMMENFASSUNG

2 gerichtete Mutagenese der Prolinhydroxylasen wurde neben Varianten mit deutlich Maßstab erhalten werden. Insbesondere die Isolierung der Hydroxyproline wurde hierbei gegenüber dem publizierten Verfahren stark vereinfacht. Für die Untersuchung von Prolinanaloga wurde ein in vitro Assay etabliert, der neue Produkte durch HPLC und Massenspektrometrie identifiziert. Diese werden ebenfalls durch Ganzzellbiotransformation Abb. 2: Fließschema für die Charakterisierung und Produktion hydroxylierter Produkte mit

Prolinhydroxylasen.

Prolinhydroxylasen sind ein einfacher und umweltschonender Weg, synthetisch wertvolle Verbindungen zu generieren, deren chemische Synthese nicht oder nur mit sehr großem Systems sind neue Isoenzyme und Substrate leicht zu integrieren und zu charakterisieren

Produktion der

Enzyme

in vitro

Substrattestung

Charakterisierung

neuer Produkte in vivoKatalyse im

Maßstab

EINLEITUNG

3

2. Einleitung

2.1. Enzyme

Enzyme sind Biokatalysatoren. Nahezu alle chemischen Prozesse in Zellen werden durch sie Faktor 107 - 109, teilweise auch noch darüber.[1-3] Für die Beschleunigung sind verschiedene, synergistisch wirkende Faktoren verantwortlich, deren Beitrag von den Eigenschaften der zu katalysierenden Reaktion, beispielsweise den Substraten, Produkten und Intermediaten, Enzym [E] der Grundzustand (ES beziehungsweise EP) destabilisiert, der Übergangszustand [ES#] stabilisiert und die Aktivierungsenergie gegenüber der Reaktion ohne Interaktion zwischen Enzym und Substrat herab gesetzt (Abb. 3).[2] Hierdurch wird die Produktbildung Abb. 3: Änderung der freien Energie im Reaktionsverlauf.[2]

1. Oxidoreduktasen, 2. Transferasen, 3. Hydrolasen, 4. Lyasen, 5. Isomerasen, 6. Ligasen.[4]

Redoxreaktionen, aber auch komplexere Strukturen wie Vitamine, zum Beispiel Thiamindiphosphat (Phosphatester des Thiamins (Vitamin B1)) für C-C Enzyme zu den Biomakromolekülen, die im aktiven Zentrum eine chirale Umgebung E + S ES

E + S#

ES# EP E + P *Aktivierungsenergie mit Enzym

Freie Energie

*Aktivierungsenergie ohne Enzym*

EINLEITUNG

4 erzeugen, was einerseits in einer bevorzugten Umsetzung eines Enatiomers eines Racemates Racematspaltung sowie zur Desymmetrisierung oder chiralen Funktionalisierung von meso- oder prochiralen Verbindungen genutzt.[7] Andererseits werden Enzyme durch die Bevorzugung eines diastereomeren Übergangszustands für die stereoselektive Katalyse funktionalisieren.[8]

2.1.1. Enzyme in der Biotechnologie

Ein Beispiel für einen auf enzymatischen Prinzipien beruhenden Prozess, der seit dem Malz in Malzzucker, der anschließend von Hefekulturen zu Alkohol vergoren wird.[9] Enzyme kommen heute bei einer Vielzahl von Prozessen zur Anwendung. So werden beispielsweise Cellulasen bei der Papierherstellung und in Waschmitteln eingesetzt sowie Pilze eingesetzt.[8] Aufgrund ihrer Gewinnung aus erneuerbaren Quellen und ihrer biologischen Abbaubarkeit auf der einen Seite sowie ihrer Eigenschaft, Reaktionen in Wasser bei moderaten Temperaturen, Drücken und pH-Werten zu katalysieren, stellt der Einsatz von chemische Synthesen einzusparen.

2.1.2. C-H aktivierende Enzyme

Die gezielte Oxidation von nicht-aktivierten Kohlenstoff-Wasserstoff Bindungen stellt für die nicht-enzymatische Katalyse eine große Herausforderung dar.[13,14] Daher ist das Gebiet der Biotransformation mit Oxidoreduktasen von großem Interesse für die Forschung; nicht nur von der biotechnologischen Anwendung her sondern auch zur Erforschung, wie enzymatische

EINLEITUNG

5

2.2. Oxidoreduktasen

Oxidoreduktasen (EC-Nummer: 1.) stellen eine weitumfassende Gruppe von Enzymen dar, Hydroxylierungsreaktionen, die Reduktion von Kohlenstoff-Kohlenstoff Doppelbindungen oftmals komplexe Cofaktoren wie Nicotinamide (NAD+ / NADH,

2.2.1. Oxygenasen

Klassen unterteilt werden; in Dioxygenasen (EC-Nummer: 1.13.) und in Monooxygenasen (EC-Nummer: 1.14.). Bei den Dioxygenasen werden beide Atome des Sauerstoffs auf das Substrat übertragen. Bei den Monooxygenasen hingegen wird nur ein Sauerstoffatom auf das Substrat übertragen und das Zweite in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie beispielsweise NAD(P)H zu Wasser reduziert.[15] Oxygenasen haben sehr unterschiedliche katalytische spalten aromatische Ringe, oxidieren deren Substituenten und demethylieren O- oder N- insbesondere für die industrielle Anwendung bei der Herstellung von Wirkstoffen für Arzneimittel geeignet, bei denen die Enantiomerenreinheit eine entscheidende Bedeutung einnimmt, um unerwünschte Wirkungen zu vermeiden.[17] Ein Beispiel für einen solchen enzymatischen Prozess ist die gezielte 11-Į-Hydroxylierung von Progesteron durch den Pilz Rhizopus arrhizus, die bereits 1952 entdeckt wurde (Abb. 4).[18]

EINLEITUNG

6 Abb. 4: Regio- und stereoselektive Hydroxylierung von Progesteron durch Rhizopus arrhizus.[8] Durch diesen Schritt konnte die Synthese von Cortison von vormals 37 Schritten auf 11 gesenkt werden.[15,19]

2.2.2. Cytochrom P450 Enzyme

Cytochrom P450 Enzyme sind unspezifische Monooxygenasen, welche die Oxidation von zahlreichen Verbindungen katalysieren.[20] Das Substratspektrum umfasst sowohl Verbindungen mit sehr kleinen Molekülmassen wie Ethylen als auch solche mit einer Molekülmasse >1000 Da wie beispielsweise Cyclosporin A.[21,22] Als Prosthetische Gruppe Protoporphyrin Ring mit vier Pyrrolringen, die über die Stickstoffatome an ein zentrales O HH O O HH O HO

Rhizopus arrhizus

ProgesteronHydroxyprogesteron

EINLEITUNG

7

Abb. 5: Struktur von Protoporphyrin IX.[23]

Abb. 6 dargestellt. Zwei Elektronen aus NADH werden durch ein Flavoprotein (oder ein Flavoprotein/Eisen-Schwefel-Protein) in Gegenwart des Substrates (R-H) und molekularem

Substrat überführt und dieses oxidiert.[23]

NADPH + O2 + R-H + H+ NADP+ + R-OH + H2O

N COOH N Fe N COOH N

EINLEITUNG

8

2.2.4. Eisen(III) Dioxygenasen

Catechol Dioxygenasen (EC-Nummer: 1.13.11.) aus Bakterien katalysieren die oxidative Familien unterschieden werden: Die Intradiol-spaltenden Dioxygenasen, die ein Eisen(III) im aktiven Zentrum besitzen (Abb. 7) und die Extradiol-spaltenden Dioxygenasen, die Eisen(II) oder auch Mangan(II) verwenden.[25] Abb. 7: Vermuteter Reaktionsmechanismus für Intradiol-spaltende Catechol Dioxygenasen.[25] Wie bei den Intradiol-spaltenden Catechol Dioxygenasen ist bei den Lipoxygenasen die Eisen(III) Form ebenfalls die katalytisch aktive. Lipoxygenasen kommen in Tieren und Pflanzen vor und katalysieren die regio- und stereoselektive Oxidation von 1,4-Dien- O

OFeIII

O OFeII O2 O OFeII O O O

OFeIII

O

OFeIII

O O OHO

COO-COO-

EINLEITUNG

9 katalysieren eine Vielzahl von Reaktionen wie Modifizierungen von Proteinseitenketten, die Reparatur von alkylierter DNA und RNA, sie spielen eine wichtige Rolle in der Biosynthese von Antibiotika und Pflanzenprodukten, im Metabolismus von Lipiden und beim biologischen Abbau verschiedenster Verbindungen, unter anderem Herbiziden.[31,32] Wie in Abb. 9 dargestellt, koppeln die meisten Vertreter dieser Enzymgruppe die Hydroxylierung eines Substrates, zumeist an einer nicht-aktivierten C-H Bindung, an die oxidative Decarboxylierung des Cosubstrates Į-Ketoglutarat, aus dem dann CO2 und Succinat entsteht. Ein Sauerstoffatom wird dabei auf das Substrat, das andere Sauerstoffatom auf das Cosubstrat

übertragen.[25,31]

auch als Monooxygenasen bezeichnet, da das zweite Sauerstoffatom auf das Į-Ketoglutarat und nicht auf das

COOH COOH OOH

Kaninchen Lipoxygenase

EINLEITUNG

10 Neben Hydroxylierungen katalysieren manche Enzyme dieser Gruppe auch Eliminierungen, Oxygenasen sind in der Lage, an einem Substrat verschiedene Reaktionen durchzuführen. So katalysiert die Carbapenem Synthase (CarC) die Bildung einer Doppelbindung und darüber Abb. 10: Einbringen einer Doppelbindung/Epimerisierung durch das Enzym CarC.[31] die 4-Hydroxymandelat Synthase (HMS), die das gleiche Substrat verwenden aber unterschiedliche Umsetzungen katalysieren (Abb. 11). [25,31,35,36] OH O O OH O

R-H + O2 +R-OH + CO2 +

HO O OH O N

O2 CO2D-KG Succinat

H2O O COOH N O COOH N O COOH

EINLEITUNG

11 Abb. 11: Umsetzung von 4-Hydroxyphenylpyruvat mit den Enzymen HPPD und HMS.[31]

2.3.1. Struktur und Bindungsmodus

aus als durch ein gemeinsames Motiv für die Bindung von Eisen(II), welches an drei ergibt sich das typische His1 - X - Asp/Glu - Xn - His2 Motiv (X steht für eine andere OH O O HPPD HMS HO OH OH HO OH O O OH

4-Hydroxyphenylpyruvat

O2 CO2 O2 CO2 His His OH2 OH2 OH2

Asp/Glu

EINLEITUNG

12 am N-Terminus, innerhalb der Biskuitrollen-Faltung und am C-Terminus. Hierdurch wird die Substratbindetasche wird angepasst (Abb. 13).[31,39,40] rechts: Kristallstruktur der Isopenicillin N Synthase.[31,39]

Į-Ketoglutarates, sich innerhalb des

Gruppen bindet das C-1 Carboxylat und die C-2 Ketogruppe an das Metallion. Das C-5 Carboxylat wird durch eine Wasserstoffbindung zu einem Argininrest oder durch ionische Wechselwirkungen mit einem Lysin aus der Seitenkette stabilisiert. Bei Enzymen der ersten Kategorie befindet sich das Histidin1 (His1) und der Carboxylatligand etwa in der gleichen Į-Ketoglutarat. Das C-1 Carboxylat befindet sich gegenüber dem Histidin1 und

das C-2 Keton gegenüber dem sauren Rest. Das eigentliche Substrat bindet nicht an das

Metallion sondern es befindet sich über dieser Ebene. Eine offene Metallbindungsstelle bleibt die Taurin Dioxygenase (TauD), die Clavaminat Synthase (CAS) und die Alkylsulfatase (AtsK).[41-43]

EINLEITUNG

13

Abb. 14: "in-line" Bindemodus.[31]

--Į-Ketoglutarats gegenüber dem Histidin2. Die Ketogruppe ist erneut trans zu dem sauren Rest positioniert. Daraus resultiert, dass sich die offene Metallbindungsstelle gegenüber Histidin1 befindet undquotesdbs_dbs25.pdfusesText_31

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