[PDF] Repliement de lARN 10 jun. 2020 A la

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Délivré par l'Université de MONTPELLIER

Préparée au sein de l'école doctorale CBS2 - Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (ED 168) et de l'unité de recherche CPBS-CNRS

Spécialité : Biologie Santé

Présentée par Zakia BENABAD

Soutenue le 17 novembre 2016 devant le jury composé de Dr. Bianca SCLAVI, CR, CNRS, Cachan Rapporteur Dr. Rachid RAHMOUNI, DR, CNRS, Orléans Rapporteur Dr. Jean-Paul LEONETTI, DR, DEINOVE, Montpellier Examinateur Dr. Emmanuel CORNILLOT, Pr, UM, Montpellier Examinateur Dr. Konstantin BRODOLIN, CR, INSERM, Montpellier Directeur de thèse Rôle de la sous-unité sigma de l'ARN polymérase bactérienne dans la tolérance aux antibiotiques 2 3

REMERCIEMENTS

Une thèse de doctorat est l'aboutissement d'une longue formation au cours de laquelle interviennent plusieurs organismes et plusieurs personnalités.

Cette thèse représente une étape importante pour moi. Elle est une forme de consécration de

nombreuses années d'études et de recherches. Elle nécessite une forte motivation pour se lancer

dans cette aventure et surmonter tous les obstacles. Fort heureusement, le plaisir de voir les

résultats de son travail se concrétiser est un encouragement fort. Mais une thèse est aussi une

oeuvre collective.

Je tiens à exprimer ma gratitude à tous celles et ceux qui m'ont formé et guidé à travers ce long

parcours universitaire et professionnel jusqu'à son aboutissement.

Je tiens tout d'abord à remercier le Dr. Konstantin Brodolin d'avoir assuré la direction

scientifique de cette thèse. Ses compétences scientifiques, sa disponibilité et son soutien tout au

long de mon travail ont été mon meilleur appui. Je le remercie également de m'avoir fait faire

partager son enthousiasme. Les qualités humaines qu'il a manifestées tout au long de la

réalisation de cette thèse, la confiance qu'il a placée en moi, m'ont encouragée à poursuivre

dans cette voie. Je lui témoigne une profonde estime et une sincère reconnaissance. Je le remercie aussi pour

tout ce qu'il a apporté à ce travail par son recul scientifique et par ses précieux conseils. Il m'a

appris la rigueur de l'analyse scientifique et m'a accompagnée dans le monde de la recherche. Je lui souhaite le meilleur, tant d'un point de vue professionnel que personnel. Encore merci pour tout.

Je tiens également à exprimer mes remerciements aux membres du jury qui ont accepté

d'évaluer mon travail de thèse. Merci au Dr. Bianca Sclavi et au Dr. Rachid Rahmouni d'avoir

accepté d'être les rapporteurs de ce manuscrit. Merci également au Dr. Jean-Paul Léonetti et au

Professeur Emmanuel Cornillot d'avoir examiné mon mémoire. Je remercie le Directeur du CPBS Mr Jean-Michel Mesnard ainsi que le Directeur Adjoint Mr Je remercie la Déléguée Régionale Mme Ghislaine Gibello et Mme Gladys Maure responsable des Ressources Humaines ainsi que Anne -Marie Bergé et Fanny Latorre conseillères formation de leur aide pour la prise en charge du financement de mes formations et de mon inscription à l'Université. 4 Merci également à la Cellule Support : Pierre Diamante, Christine Gagnere, Sandrine Peired et Martine Michaud de m'avoir facilité toutes les démarches administratives.

Merci à Mr Christian Devaux et Mme Nathalie Pasqualini de leur appui auprès de la délégation

Languedoc Roussillon.

J'ai été très heureuse de l'accompagnement de toute l'équipe Transcription et Résistances aux

Antibiotiques lors de la préparation de cette thèse. Merci infiniment à Corinne Lionne, à

Laurent Chaloin, à Rahila et à Ayya pour leur bonne humeur, leur aide et pour tous nos

échanges au cours de nos réunions d'équipe. Enfin, il m'est donné ici l'occasion d'exprimer toute ma reconnaissance à ma famille pour leur présence et pour leur amour.

Je voudrais tout d'abord remercier mes parents et mes frères et soeurs à qui je dois tout et qui

ont toujours cru en moi. Leur soutien a toujours été généreux et chaleureux, ils m'ont toujours

encouragé et m'ont appris à ne jamais baisser les bras. Ils m'ont transmis le désir d'apprendre

et le plaisir de la recherche.

Je pense bien sûr à mes enfants Sarah et Julien en espérant ne pas avoir été trop absente

pendant ces longs mois de rédaction. Mais je ne suis pas trop inquiète sur cette question car ils

étaient probablement ravis d'être tranquilles. Mais je voudrais surtout dire toute ma compassion à celui qui a subi des mois et des mois d'explications interminables sur l'ARNP. Je parle bien sûr de mon mari qui a, par ignorance de la charge de travail, accepté mon choix.

Je le remercie infiniment pour son soutien quotidien et surtout pour sa patience pour me

réconforter et m'encourager pendant les moments d'angoisse, de doute et de faiblesse. Cette thèse est aussi la sienne. 5

TABLE DES MATIERES

REMERCIEMENTS ................................................................................................................................ 3

LISTES DES TABLEAUX ET FIGURES ............................................................................................. 8

ABREVIATIONS ..................................................................................................................................... 8

AVANT-PROPOS .................................................................................................................................. 10

CHAPITRE I : INTRODUCTION .................................................................................................................. 14

A. L'ARN polymérase cible potentielle de la recherche de nouveaux antibiotiques ........................ 15

A.I) Généralités sur les antibiotiques ............................................................................................... 15

A.II) Emergence de bactéries résistantes ......................................................................................... 17

A.III) Transmissions des résistances aux antibiotiques .................................................................... 18

A.III.1 Résistances naturelles ........................................................................................................ 18

A.III.2 Résistances acquises .......................................................................................................... 19

A.IV) Mécanismes des résistances aux antibiotiques ....................................................................... 20

A.IV.1 Altération de l'antibiotique................................................................................................ 20

A.IV.2 Modification de la cible ..................................................................................................... 21

A.IV.3 Réduction de la perméabilité ............................................................................................. 21

A.IV.4 Mécanisme d'expulsion des antibiotiques ........................................................................ 21

A.V) Recherche de nouvelle voies .................................................................................................... 22

A.VI) L'ARN polymérase est une cible des antibiotiques.................................................................. 23

B. L'ARN polymérase ........................................................................................................................... 25

B.I) Core de l'ARN polymerase (E) .................................................................................................... 25

B.II) L'holoenzyme (Eσ) ..................................................................................................................... 27

B.II.1 Facteurs de transcription sigma (σ) .................................................................................... 29

B.II.2 Les facteurs sigma peuvent être classés en deux familles : ............................................... 29

B.II.3 Principaux domaines structuraux des facteurs sigma ......................................................... 32

B.II.4 Différents types de promoteurs reconnus par le facteur σ. figure .................................... 40

C. Cycle de transcription ...................................................................................................................... 44

C.I) Initiation ..................................................................................................................................... 44

C.I.1 Formation du complexe fermé : RPc .................................................................................... 44

6

C.I.2 Etapes intermédiaires entre RPc et RPo .............................................................................. 46

C.I.3 Formation du complexe ouvert ............................................................................................ 48

C.II) Initiation abortive ...................................................................................................................... 50

C.III) Elongation ................................................................................................................................ 51

C.IV) Terminaison ............................................................................................................................. 53

C.IV.1 Terminaison intrinsèque .................................................................................................... 53

C.IV.2 Terminaison dépendante du facteur Rho .......................................................................... 54

C.V) Rôle du couple Dksa/ppGpp dans la régulation de la transcription ......................................... 55

C.V.1 DksA .................................................................................................................................... 55

C.V.2 ppGpp .................................................................................................................................. 56

C.V.3 Effet synergique de Dksa et de ppGpp ................................................................................ 57

D. Inhibiteurs de l'ARN polymérase .................................................................................................... 59

D.I) Antibiotiques ciblant l'extension de l'ARN (Figure 19) .............................................................. 60

D.I.1 Ansamycines (rifamycines) .................................................................................................. 60

D.I.2 Sorangicine ........................................................................................................................... 62

D.II) Antibiotiques ciblant le site catalytique de l'ARN polymérase ................................................. 63

D.II.1 Streptolydigine .................................................................................................................... 63

D.II.2 Microcine J25 ...................................................................................................................... 65

D.II.3 Série CBR703 ....................................................................................................................... 66

D.II.4 Salinamide ........................................................................................................................... 68

D.II.5 Peptide GE23077 ................................................................................................................. 69

D.II.6 Tagetitoxine ........................................................................................................................ 71

D.III) Les inhibiteurs bloquent la formation du complexe ouvert (Figure 22) .................................. 73

D.III.1 Myxopyronine .................................................................................................................... 73

D.III.2 Corallopyronine.................................................................................................................. 74

D.III.3 Ripostatine ......................................................................................................................... 75

D.III.4 Lipiarmycine ....................................................................................................................... 76

D.III.5 Ureidothiophène ................................................................................................................ 78

D.IV) Les inhibiteurs de l'interaction entre le core de l'ARNP et la sous-unité σ ............................. 80

7

D.IV.1 Composés SB ...................................................................................................................... 81

D.IV.2 Composés GKL ................................................................................................................... 82

D.IV.3 Composé DSHS00507 ........................................................................................................ 82

Article n°1 ............................................................................................................................................... 84

CHAPITRE II : RESULTATS ......................................................................................................................... 89

A. Introduction ..................................................................................................................................... 90

B. Résultats ........................................................................................................................................... 91

B.I) Sigma S (σ

S) possède les mêmes propriétés que les mutants au niveau de la région 3.2 ......... 97

B.II) Effet des mutations sur l'inhibition par la lipiarmycine ............................................................ 99

B.III) La substitution E116G dans la région 1.2 de σ

70 augmente la sensibilité de l'ARNP à Lpm. ... 99

B.IV) L'hétéroduplex de l'ADN dans le promoteur lac UV5 abolit l'action de la Lpm .................... 100

B.V) La délétion de la région 3.2 et la lipiarmycine déstabilisent les interactions entre l'ARNP et

l'ADN aval. ...................................................................................................................................... 103

B.VI) Les régions 1.2 et 3.2 de σ

70 modulent la sensibilité au froid au cours de la fusion du

promoteur ...................................................................................................................................... 106

C. Simulations de dynamique moléculaire (DM) et le Docking .......................................................... 112

C.I) Simulations de dynamique moléculaire ................................................................................... 112

C.II) Docking .................................................................................................................................... 117

D. Conclusions .................................................................................................................................... 120

Article n°2 ............................................................................................................................................. 121

CHAPITRE III : DISCUSSION ET PERSPECTIVES ....................................................................................... 135

A. Discussion ....................................................................................................................................... 136

B. Perspectives ................................................................................................................................... 141

MATERIELS ET METHODES ..................................................................................................................... 142

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES .......................................................................................................... 145

8

LISTES DES FIGURES ET TABLEAUX

F Figure 1. Historique de la découverte des antibiotiques 16 Figure 2. Dissémination des antibiotiques dans l'environnement, 18

Figure 3. Les trois mécanismes de transfert génétique horizontal (HGT) chez les bactéries 20

Figure 4. Les différents mécanismes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries 21

Figure 5. Structure globale du core de l'ARNP de T. thermophilus avec l'ADN 27 Figure 6. Structure de l'holoenzyme de T. thermophilus avec le facteur sigma 28

Figure 7. Représentation schématique de la structure des différents groupes de facteurs σ 30

Figure 8. Interactions entre les régions conservées du σ70 32 Figure 9. Structure de l'holoenzyme d'E.coli comportant σ

70 33

Figure 10. Structure du facteur sigma 70 34

Figure 11. Différents types de promoteurs bactériens 43 Figure 12. Différentes étapes du cycle de transcription procaryote 44 Figure 13. Représentation schématique du complexe fermé 45 Figure 14. Représentation schématique du complexe intermédiaire 47 Figure 15. Représentation schématique du positionnement de l'ADN 50 Figure 16. Modèle de terminaison intrinsèque 54 Figure17. Représentation du mouvement du facteur Rho: (PBS) 55 Figure 18. Les inhibiteurs des différentes étapes du cycle de transcription 59 Figure 19. Structure chimique des inhibiteurs ciblant l'extension de l'ARN 63 Figure 20. Représentation schématique des contacts entre l'ARNP et l'inhibiteur CBR 67

Figure 21. Structure chimique des inhibiteurs ciblant le site catalytique de l'ARN polymérase 72

Figure 22. Structure chimique des inhibiteurs de l'ARNP ciblant le domaine switch-2 79 Figure 23. Structure chimique des inhibiteurs ciblant l'interaction 83 Figure 24. Positionnement des mutations de la sous-unité σ dans la structure de l'ARNP 93 Figure 25. Alignement de la séquence de la région 3.2 selon les groupes de sigma 94 Figure 26. Structure des promoteurs lacUV5 et T7A1 94 Figure 27. Effet des mutations dans la sous-unité σ

70 95

Figure 28. Effet des mutations dans la sous-unité σ sur la synthèse de l'ARN abortif 96 Figure 29. Synthèse des run-off par différents sigma 98 Figure 30. Influence de la structure de l'ADN sur la sensibilité de l'ARNP à Lpm 102

Figure 31. Sensibilité du RPo de Eσ

70, EσS, EσΔ3.2 à Lpm 105

Figure 32. Effets des variations de la structure de la sous-unité σ sur la formation du RPo 108

Figure 33. Effet des mutations de la sous-unité σ sur la formation du RPo 109 Figure 34. Dépendance à la température de l'ouverture du promoteur lacUV5 110 Figure 35. Formation du RPo sur le promoteur lacUV5 par Eσ

H518A et EσS 111

Figure 36. Fluctuations des atomes Cα des résidus 504 à 530 de la région 3.2 113 Figure 37. Interaction de la région 3.2 (vert) avec le résidu Q1256 du β-SW3 113 Figure 38. Déviation spatiale au cours de la simulation des atomes C de '-SW2 et de la région 3.2 114 Figure 39. Changements de distance D(t) entre les atomes C du résidu D514 dans la région 3.2 114

Figure 40. Fluctuations des atomes C

de '-SW2 et de la région 3.2 du facteur sigma 115 Figure 41. Mécanisme de compétition au cours de l'inhibition par la Lpm 116 Figure 42. Docking de la Lpm dans la structure de l'ARNP d'E.coli avec le programme GOLD 118 Figure 43. Modélisations structurales des interactions entre E 70, E

S, Lpm 119

Figure 44. Modèle du mécanisme d'action de la lipiarmycine 137 T Tableau 1. Résistances naturelles des bactéries aux antibiotiques 19

Tableau 2. Facteur σ

70 chez E. col 30

9

ABREVIATIONS

ADN acide desoxyribonucleique

ARN acide ribonucleique

ARNP ARN polymerase

CMI concentration minima inhibitrice

Da Dalton

DM dynamique moléculaire

dNTP desoxynucleoside triphosphate

E core enzyme

Eσ Holoenzyme

FDA Food and Drug Administration

gp glycoproteine

HPLC high performance liquid chromatography

HTS high-throughput screening

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