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THESE DE DOCTORAT

ÉCOLE DOCTORALE N° 572

Ondes et matières

Spécialité de doctorat : Milieux dilués et optique fondamentale Par Microscopie de fluorescence rapide et optique adaptative pour l'étude fonctionnelle tridimensionnelle in vivo des réseaux neuronaux impliqués dans la mémoire chez Drosophila melanogaster

M. A. Dazzi, Professeur, Université Paris-Sud Président du Jury

M. J.-R. Martin Directeur de recherche, CNRS Rapporteur

Mme M.-C. Schanne-Klein Directrice de recherche, Ecole Polytechnique Rapporteur

M. J.-M. Dura Directeur de recherche, CNRS Examinateur

M. M. Tramier Ingénieur de recherche hors classe, CNRS Examinateur

Mme C. Ventalon Chargé de recherche, CNRS Examinateur

M. D. Nutarelli Maître de conférences, Université Paris-Sud Directeur de thèse

À Paul,

Table des matières

Remerciements

Introduction générale

1

1Drosophila melanogaster, un organisme modèle en neurobiologie5

1.1 De nombreux atouts confèrent àDrosophila melanogasterune place de choix en

tant qu"organisme modèle universel pour la biologie . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.1.1 Un génome relativement simple et entièrement séquencé

. . . . . . . . . 6

1.1.2 Des similitudes génomiques avec l"homme

. . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.1.3 Un cycle de reproduction court et un élevage aisé

. . . . . . . . . . . . . 8

1.2 La drosophile et la mémorisation

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.2.1 Un cerveau relativement simple mais des comportements complexes

. . . 8

1.2.2 Une capacité d"apprentissage

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.2.3 Les corps pédonculés : un centre de la mémoire olfactive

. . . . . . . . . 11

1.3 Les outils pour les études en neurobiologie chez la drosophile

. . . . . . . . . . . 13

1.3.1 Des outils génétiques extrêmement puissants

. . . . . . . . . . . . . . . . 13

1.3.1.1 Le système d"expression UAS/GAL4, un contrôle spatial précis

de l"expression d"un transgène. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

1.3.1.2 L"interférence ARN

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

1.3.1.3 Les banques de souches transgéniques

. . . . . . . . . . . . . . 14

1.3.1.4 Le système GAL80

ts, un raffinement du système UAS/GAL4 as- surant un contrôle spatio-temporel de l"expression d"un transgène 16

1.3.2 Les biosenseurs et l"imagerie cérébrale : observer et agir par voie optique

17

1.3.2.1 La visualisation des structures morphologiques du cerveau

. . . 17

1.3.2.2 Le suivi de l"activité neuronale

. . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

1.3.2.3 Perturbations pouvant être induites par l"expression des senseurs

24

1.3.2.4 Le photoblanchiment, une limitation inhérente à l"imagerie de

fluorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

1.3.2.5 Sondes fluorescentes encodées génétiquement pour l"étude de la

phototoxicité engendrée par effet photochimique . . . . . . . . . 25

1.3.2.6 Optogénétique : le contrôle par la lumière de l"activité neuronale

26

1.3.2.7 Thermogénétique : le contrôle de l"activité neuronale par la tem-

pérature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

1.4 La préparation microchirurgicale de la drosophile pour l"imageriein vivo. . . . 29

1.4.1 Le protocole de microchirurgie

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

Table des matières

1.4.2 La diminution des mouvements du cerveau

. . . . . . . . . . . . . . . . . 30

1.4.3 La dissection par laser

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

1.5 Conclusion

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2 Microscopie de fluorescence à illumination structurée HiLo pour l"imagerie

in vivodu cerveau de la drosophile33

2.1 Microscopies optiques de fluorescence limitées par la diffraction

. . . . . . . . . . 35

2.1.1 Principes physiques : limite de diffraction et notion de sectionnement

optique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

2.1.1.1 La limite de diffraction

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

2.1.1.2 Le sectionnement optique

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

2.1.2 La microscopie conventionnelle plein champ, rapide mais sans capacité

de coupe optique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

2.1.3 Les microscopies de sectionnement optique à balayage

. . . . . . . . . . . 38

2.1.3.1 La microscopie confocale, capable de sectionnement optique

mais à faible cadence d"acquisition . . . . . . . . . . . . . . . . 38

2.1.3.2 La microscopie multiconfocale, alliance de la résolution et de la

vitesse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

2.1.3.3 La microscopie non linéaire de type biphotonique, l"accès à la

profondeur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

2.1.4 Les microscopies de sectionnement optique plein champ

. . . . . . . . . . 41

2.1.4.1 La microscopie à feuille de lumière

. . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.1.4.2 La microscopie à illumination structurée

. . . . . . . . . . . . . 42

2.2 La microscopie à illumination structurée de type HiLo

. . . . . . . . . . . . . . . 43

2.2.1 Les fréquences spatiales

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.2.2 Le principe de la microscopie à illumination structurée

. . . . . . . . . . 43

2.2.3 Microscopie HiLo et algorithme de reconstruction des images.

. . . . . . 46

2.2.3.1 Principe de réalisation du sectionnement optique plein champ

HiLo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

2.2.3.2 L"algorithme de reconstruction de la section optique

. . . . . . 47

2.2.4 Le dispositif expérimental pour la microscopie HiLo

. . . . . . . . . . . 52

2.2.4.1 Le montage optique

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

2.2.4.2 La matrice de micro-miroirs

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

2.2.4.3 La synchronisation du dispositif et la réalisation de coupes op-

tiques HiLo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

2.2.5 Caractérisation du microscope à illumination structurée

. . . . . . . . . . 59

2.2.5.1 Évaluation de la réponse impulsionnelle

. . . . . . . . . . . . . 60

2.2.5.2 Réponse fréquentielle du microscope

. . . . . . . . . . . . . . . 63

2.2.5.3 Capacité de coupe optique

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

2.2.5.4 Réjection des basses fréquences spatiales hors mise au point

. . 67

2.3 Résultats : Microscopie Hilo pour l"imageriein vivodu cerveau de la drosophile. 68

2.3.1 Lignées transgéniques de drosophiles

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

2.3.2 La capacité de sectionnement optique de la microscopie HiLo

. . . . . . . 69

2.3.3 Microscopie plein champ HiLo et microscopie confocale à balayage

. . . . 71

Table des matières

2.3.4 Adaptation de la fréquence spatiale du motif d"illumination pour l"ima-

gerie HiLo tridimensionnelle. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

2.4 Discussion

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

2.4.1 La microscopie HiLo, une technique de coupe optique plein champ limitée

par diffraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

2.4.2 Choix du motif d"illumination et des paramètres de reconstruction de la

microscopie HiLo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

2.4.3 Le sectionnement optique de la microscopie HiLo en profondeur

. . . . . 80

2.5 Conclusion

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

3 Optique adaptative pour l"imagerie plein champ HiLo du cerveau de la

drosophile en profondeur 83

3.1 L"optique adaptative en microscopie optique de fluorescence

. . . . . . . . . . . 86

3.1.1 Introduction

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

3.1.2 Les aberrations optiques

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

3.1.2.1 La déformation du front d"onde

. . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

3.1.2.2 Origines des aberrations optiques

. . . . . . . . . . . . . . . . . 87

3.1.2.3 L"effet des aberrations optiques

. . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

3.1.3 La correction des aberrations par l"optique adaptative

. . . . . . . . . . . 89

3.1.3.1 L"analyseur de front d"onde

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

3.1.3.2 Le correcteur de front d"onde, élément optique actif

. . . . . . . 91

3.1.3.3 L"optique adaptative avec mesure de front d"onde

. . . . . . . . 92

3.1.3.4 L"optique adaptative sans mesure de front d"onde

. . . . . . . . 94

3.2 Matériel et méthodes : L"algorithme d"optimisation et le montage optique

. . . . 95

3.2.1 Le procédé d"optimisation des images

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

3.2.1.1 L"algorithme d"optimisation3N. . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

3.2.1.2 Le choix du facteur de mérite

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

3.2.2 La base de décomposition des aberrations

. . . . . . . . . . . . . . . . . 98

3.2.3 Le montage optique

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98

3.3 Résultats : Caractérisation et performances du système

. . . . . . . . . . . . . . 100

3.3.1 Évaluation des aberrations différentielles entre voies d"excitation et

d"émission . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

3.3.2 Évaluation de l"extension spatiale latérale de la correction

. . . . . . . . 103

3.3.3 Évaluation de l"extension spatiale axiale de la correction dans le cerveau

de la drosophile . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106

3.3.4 Stabilité temporelle de la correction pour l"imageriein vivo. . . . . . . . 108

3.3.5 Dépendance de la fréquence spatiale du motif d"excitation

. . . . . . . . 109

3.4 Résultats : Imagerie HiLoin vivoen profondeur dans le cerveau de la drosophile

avec correction des aberrations optiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

3.4.1 Amélioration du contraste de la grille

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

3.4.2 Reconstruction HiLo

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

3.5 Discussion et perspectives

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

3.5.1 Une "étoile guide" plein champ intrinsèquement liée à la microscopie à

illumination structurée . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

Table des matières

3.5.2 La base de projection des modes d"aberrations et les modes sélectionnés

pour l"optimisation du front d"onde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

3.5.3 Zone isoplanétique de correction des aberrations

. . . . . . . . . . . . . . 117

3.5.4 Perspectives : Correction avec "étoile guide" générée par excitation bi-

photonique et imagerie par microscopie HiLo à un photon . . . . . . . . 118

3.6 Conclusion

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

4 Microscopie multiconfocale pour l"imagerie massivein vivodu centre de

la mémorisation de la drosophile à l"échelle du neurone individuel 121

4.1 Introduction : Objectif du projet

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

4.2 Matériel et méthodes

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123

4.2.1 Le dispositif d"imagerie multiconfocale à deux couleurs

. . . . . . . . . . 123

4.2.1.1 L"imagerie multiconfocale "spinning disk"

. . . . . . . . . . . . 123

4.2.1.2 Résultats préliminaires de microscopie multiconfocale obtenus

à l"Institut Curie

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

4.2.1.3 Le dispositif de microscopie "spinning disk"

. . . . . . . . . . . 125

4.2.1.4 Le système DualView

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

4.2.1.5 Performances optiques du microscope

. . . . . . . . . . . . . . . 127

4.2.2 Le système de stimulation

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130

4.2.2.1 La cellule environnementale

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130

4.2.2.2 Le dispositif de stimulation olfactive

. . . . . . . . . . . . . . . 131

4.2.2.3 Le dispositif de stimulation électrique

. . . . . . . . . . . . . . . 132

4.2.2.4 La synchronisation de l"imagerie et des stimuli

. . . . . . . . . . 133

4.2.3 Les lignées de drosophiles

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 35

4.2.3.1 Le marquage bi-couleur

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

4.2.3.2 Préparation de la drosophile

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

4.2.3.3 Test pharmacologique de l"état de forme de la drosophile pour

les études fonctionnelles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136

4.3 Imagerie des corps cellulaires et difficultés rencontrées

. . . . . . . . . . . . . . . 138

4.3.1 Imagerie 5D (X,Y,Z,t,λ) des corps cellulaires. . . . . . . . . . . . . . 138

4.3.1.1 Imagerie "mCherry/ArcLight"

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138

4.3.1.2 Imagerie "mCherry/G-CaMP6f"

. . . . . . . . . . . . . . . . . 140

4.3.2 Anisotropie de résolution

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140

4.3.3 Imagerie bi-couleur et mouvement

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141

4.3.4 Extension axiale des corps cellulaires des cellules de Kenyon et imagerie

3D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142

4.3.5 Photoblanchiment des sondes fluorescentes

. . . . . . . . . . . . . . . . . 143

4.4 Imagerie fonctionnelle des corps cellulaires et analyse globale

. . . . . . . . . . . 145

4.4.1 Réponse à des stimulations électriques dans les corps cellulaires des cel-

lules de Kenyon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146

4.4.2 Réponse à des stimulations olfactives dans les corps cellulaires des cellules

de Kenyon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147

4.5 Analyse à l"échelle du neurone individuel par bioinformatique

. . . . . . . . . . . 149

4.5.1 Compensation du mouvement

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149

Table des matières

4.5.2 Procédé de détection des corps cellulaires individuels

. . . . . . . . . . . 150

4.5.2.1 Première version : Algorithme de seuillage sur l"intensité

. . . . 151

4.5.2.2 Deuxième version : Algorithme de détection de la forme

. . . . 152

4.5.3 Suivi temporel des noyaux

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154

4.5.4 Test de l"algorithme de détection sur image synthétique

. . . . . . . . . . 155

4.5.5 Perspectives : Quantification du signal du rapporteur fluorescent d"acti-

vité neuronale à l"échelle du neurone individuel . . . . . . . . . . . . . . 156

4.6 Discussion

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157

4.6.1 Imagerie tridimensionnellein vivod"un réseau neuronal entier, résolue à

l"échelle du neurone individuel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157

4.6.2 L"imagerie de fluorescence multiconfocale et la profondeur

. . . . . . . . 158

4.6.3 Algorithme de traitement des images dédié à l"imagerie du réseau mnésique

161

4.7 Conclusion

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162

5 Électrophysiologie optique alliant imagerie HiLo haute cadence et biosen-

seurs fluorescents ultra-rapides 163

5.1 Matériel et méthodes

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165

5.1.1 Imagerie optique synchronisée à haute cadence

. . . . . . . . . . . . . . . 165

5.1.1.1 Le dispositif de microscopie

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165

5.1.1.2 La synchronisation par générateur de fonction

. . . . . . . . . . 166quotesdbs_dbs46.pdfusesText_46

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