[PDF] Régulation de lépissage alternatif de lexon 16 du pré-messager 4.1

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N¡ d"ordre : 29-2010 AnnŽe 2010

THESE DE L"UNIVERSITE DE LYON

DŽlivrŽe par

L"UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1

ƒCOLE DOCTORALE

Biologie MolŽculaire, IntŽgrative et Cellulaire

DIPLOME DE DOCTORAT

(arrtŽ du 7 aožt 2006) soutenue publiquement le (4 FŽvrier 2010) par

M. BREIG Osman

TITRE

Régulation de l"épissage alternatif de l"exon 16 du préRégulation de l"épissage alternatif de l"exon 16 du pré--

messager 4.1R au cours de la différenciation érythroïdemessager 4.1R au cours de la différenciation érythroïde::

Implication de la voie de signalisation PI3Implication de la voie de signalisation PI3--KinaseKinase

JURY :

M. Hubert PINON PrŽsident

Mme. Franoise Moreau-Gachelin Rapporteur

Mme. Joëlle MARIE Rapporteur

Mme. Marie-Christine LECOMTE Examinateur

M. Faouzi BAKLOUTI Examinateur

UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1

Président de l"Université

Vice-prŽsident du Conseil Scientifique

Vice-prŽsident du Conseil d"Administration

Vice-prŽsident du Conseil des Etudes et de la Vie Universitaire

SecrŽtaire GŽnŽral

M. le Professeur L. Collet

M. le Professeur J-F. Mornex

M. le Professeur G. Annat

M. le Professeur D. Simon

M. G. Gay

COMPOSANTES SANTE

FacultŽ de MŽdecine Lyon Est - Claude Bernard FacultŽ de MŽdecine Lyon Sud - Charles MŽrieux

UFR d"Odontologie

Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques Institut des Sciences et Techniques de RŽadaptation DŽpartement de Formation et Centre de Recherche en Biologie

Humaine

Directeur : M. le Professeur J. Etienne

Directeur : M. le Professeur F-N. Gilly

Directeur : M. le Professeur D. Bourgeois

Directeur : M. le Professeur F. Locher

Directeur : M. le Professeur Y. Matillon

Directeur : M. le Professeur P. Farge

COMPOSANTES SCIENCES ET TECHNOLOGIE

FacultŽ des Sciences et Technologies

UFR Sciences et Techniques des ActivitŽs Physiques et Sportives

Observatoire de Lyon

Institut des Sciences et des Techniques de l"IngŽnieur de Lyon

Institut Universitaire de Technologie A

Institut Universitaire de Technologie B

Institut Universitaire de Formation des Ma"tres

Directeur : M. Le Professeur F. Gieres

Directeur : M. C. Collignon

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Directeur : M. le Professeur J. Lieto

Directeur : M. le Professeur C. Coulet

Directeur : M. le Professeur R. Lamartine

Directeur : M. le Professeur J-C. Augros

Directeur : M R. Bernard

Remerciements

Je tiens ˆ remercier Monsieur Faouzi BAKLOUTI pour m"avoir donnŽ l"opportunitŽ de faire Je remercie Mme. Franoise Moreau-Gachelin et Mme. Joëlle MARIE pour avoir acceptŽe d"tre rapporteurs et de prendre du temps pour corriger mon manuscrit, et aux examinateurs M. Hubert PINON et Mme. Marie-Christine LECOMTE pour avoir acceptŽ de participer ˆ ce jury. Je remercie tous les membres de l"Žquipe, les anciens et les nouveaux, Madeleine MORINIERE pour sa sympathie, sa disponibilitŽ, ses encouragements et pour la correction de mon manuscrit, Alexandre DOUABLIN pour les discussions scientifiques, sa bonne humeur, Landry GAYET pour la bonne ambiance, sans oublier Zeina Bash- IMAM, Rand

BLAYBEL et Sandrine LARADI.

Je remercie Žgalement les membres du CGMC pour les discussions, les conseils et pour le don de matŽriels, l"Žquipe de M. Guy MOUCHIROUD, l"Žquipe de M. Franois MORLE, M. Jean Jacques MADJAR et tous les jeunes du laboratoire. Un grand merci pour Guillaume GIRAUD pour toutes ses aides prŽcieuses, pour la bonne ambiance et pour les belles chansons de chaque matin. Merci beaucoup ˆ Samer KAYALI pour son humour, sa bonne humeur et pour toutes les pauses-cafŽ inoubliables. Merci ˆ tous les amis pour les bons moments et pour leurs encouragements : Hicham, Sawah, Walid, Jhony, Iyad, H.NAKHAL, M.ATIA et pour le groupe touristique (Mirna, Ghina, Rita,

Sandra, Salim, Samer et Aya).

l"Žducation, pour l"encouragement et pour leur soutien.

Merci a tous.

Tables des matières

Listes des abrŽviations............................................................................................................4

Listes des figures et tableaux..................................................................................................9

I- L"Žpissage......................................................................................................................16

1. La maturation de l"ARN prŽ-messager.......................................................................17

1.1. L"addition d"une coiffe en 5"...............................................................................17

1.2. Le clivage et la polyadŽnylation de l"extrŽmitŽ 3" ...............................................17

2. L"Žpissage .................................................................................................................18

2.1. Jonctions intron/exon : Les sites d"Žpissage.........................................................18

2.2. La rŽaction d"Žpissage.........................................................................................19

2.3. Le spliceosome : machinerie d"Žpissage..............................................................19

2.3.1. Assemblage du spliceosome............................................................................20

2.3.2. Composition du spliceosome............................................................................21

3. L"auto-Žpissage..........................................................................................................22

4. L"Žpissage alternatif...................................................................................................22

4.1. ConsŽquences de l'Žpissage alternatif..................................................................24

4.1.1. Introduction d"un codon stop............................................................................24

4.1.2. Modifications dans la structure de la protŽine...................................................25

5. RŽgulation de l"Žpissage............................................................................................25

5.1. Les ŽlŽments cis..................................................................................................26

5.1.1 Les sŽquences exoniques rŽgulatrices d"Žpissage (ESRs)...................................26

5.1.2. Les sŽquences introniques rŽgulatrices d"Žpissage (ISRs).................................27

5.2. Les facteurs agissant en trans..............................................................................28

5.2.1. La famille des protŽines SR..............................................................................29

5.2.1.1. GŽnŽralitŽs....................................................................................................29

5.2.1.2. CaractŽristiques gŽnŽrales .............................................................................29

5.2.1.3 R™le du domaine RS.......................................................................................31

5.2.1.4. R™le des protŽines SR dans la rŽgulation de l"Žpissage..................................31

5.2.1.5. MŽcanismes d"activation de l"Žpissage par les protŽines SR..........................32

5.2.1.6. MŽcanismes d"inhibition de l"Žpissage par les protŽines SR...........................33

5.2.1.7. RŽgulation des protŽines SR..........................................................................34

5.2.1.8 ProtŽines SR et transcription ..........................................................................36

5.2.1.9 R™le des protŽines SR dans le transport et la traduction de l"ARNm...............36

5.2.2. La famille des protŽines hnRNP.......................................................................37

5.2.2.1. hnRNP A1 et hnRNP A2...............................................................................38

5.2.2.2. PTB ou hnRNP I...........................................................................................38

5.2.2.3. Autres hnRNP...............................................................................................39

5.2.3. Antagonisme entre les protŽines SR et les hnRNP............................................39

5.2.4. Autres facteurs agissant en trans.......................................................................40

6. Epissage alternatif et maladies hŽrŽditaires................................................................41

7. Epissage alternatif et cancer.......................................................................................42

8. Epissage alternatif et signalisation.............................................................................43

3. Les ŽrythroleucŽmies murines de Friend....................................................................47

L'ŽrythropoïŽtine, rŽgulateur des derniers stades de la diffŽrenciation Žrythrocytaire.....49

25. Activation de l"EPO-R et transduction du signal........................................................506. Les voies de signalisation Žrythrocytaires..................................................................51

6.1. La voie de JAK2-STAT5....................................................................................51

6.2. La voie Ras-Raf-MAP kinase..............................................................................51

6.3. La voie de la PI3K..............................................................................................52

6.4. Inhibition de la transduction du signal Žrythrocytaire.........................................52

7. Les voies de transduction du signal dans les cellules ŽrythroleucŽmiques de Friend

7.1. L"Epo-R est activŽ d"une faon constitutive dans les cellules ŽrythroleucŽmiques

de Friend......................................................................................................................53

7.2. Signalisation dans les cellules ŽrythroleucŽmiques de Friend (SFFV)..................53

8. Les facteurs de transcription Žrythrocytaires..............................................................55

8.1. GATA-1..............................................................................................................55

8.2. Fli-1....................................................................................................................56

8.3. TRIM10/HERF-1................................................................................................56

8.4. Spi-1/PU.1..........................................................................................................57

8.4.1. Structure de la protŽine ....................................................................................57

8.4.2. Expression de Spi-1/PU.1.................................................................................58

8.4.3. RŽgulation de l"expression de Spi-1/PU.1 ........................................................59

8.4.4. Cibles et partenaires de Spi-1/PU.1..................................................................59

8.4.6. Implication de Spi-1/PU.1 dans les ŽrythroleucŽmies de Friend........................61

8.4.7. Inhibition de la diffŽrenciation par Spi-1/PU.1.................................................62

8.4.8. Antagonisme fonctionnel entre Spi-1/PU.1 et GATA-1....................................62

8.4.9. Implication de Spi-1/PU.1 dans l"Žpissage........................................................64

8.4.10. La phosphorylation de Spi-1/PU.1..................................................................65

III- La protŽine 4.1R..........................................................................................................67

1. La protŽine 4.1R : Membre de la famille des protŽines 4.1.........................................68

1.1 La protŽine 4.1G..................................................................................................69

1.2. La protŽine 4.1N.................................................................................................69

1.3 La protŽine 4.1B..................................................................................................70

1.4 La protŽine 4.1O..................................................................................................70

1.5. La protŽine 4.1R.................................................................................................70

2. La protŽine 4.1R........................................................................................................71

2.2 L"Žpissage alternatif des ARNs prŽ-messager 4.1R et les diffŽrentes isoformes

3. L"isoforme Žrythrocytaire de la protŽine 4.1R : 4.1R80..............................................73

3.1 Structure de la protŽine........................................................................................73

3.1.1. Le domaine de 30kDa (FERM)........................................................................73

3.1.2. Le domaine 16kDa...........................................................................................74

3.1.3. Le domaine CTD..............................................................................................75

3.1.4. Le domaine SAB..............................................................................................75

3.2. R™le de l"isoforme Žrythrocytaire de la protŽine 4.1R : la protŽine 4.1R80..........76

3.2.1 Organisation structurale de la membrane Žrythrocytaire....................................76

3.2.2 R™le de la protŽine 4.1R80 dans le maintien de la membrane Žrythrocytaire......77

3.2.3. Les elliptocytoses hŽrŽditaires (HE) et la protŽine 4.1R....................................77

4. R™le de la protŽine 4.1R dans les cellules nuclŽŽes....................................................78

5. RŽgulation de l"Žpissage alternatif de l"exon 16 de la protŽine 4.1R 80 kDa au cours de

la diffŽrenciation Žrythroide..............................................................................................80

35.1. Les Žlements cis qui rŽgulent l"Žpissage de l"exon 16..........................................81

5.2. Les facteurs agissant en trans rŽgulant l"Žpissage de l"exon 16............................82

5.2.1. Fox-2/RBM9/HRNBP2....................................................................................82

5.2.2. SF2/ASF..........................................................................................................83

5.2.4. HERF-1 ...........................................................................................................84

5.2.5. hnRNPA/B.......................................................................................................84

5.2.6. Spi-1/PU.1.......................................................................................................85

IV- Objectifs........................................................................................................................86

V- RŽsultats et discussion.....................................................................................................88

I. Implication de la voie de signalisation PI3K dans la rŽgulation de l"Žpissage alternatif du

prŽ-messager 4.1R et dans la diffŽrenciation des cellules ŽrythroleucŽmiques MEL..........89

I.1. Introduction.........................................................................................................89

I.2. Article:................................................................................................................92

Subtle distinct regulations of late erythroid molecular events by PI3K/AKT-mediated

activation of Spi-1/PU.1 oncogene autoregulation loop.................................................92

I.3. Conclusion ........................................................................................................132

II. R™le de la protŽine SRP40 dans la rŽgulation de l"Žpissage de l"exon 16 du prŽ-

messager 4.1R................................................................................................................138

II.1.1. Analyse de l"expression protŽique des facteurs d"Žpissage SR .......................138

II.1.2. Surexpression de SRP40 dans les cellules MEL 745A......................................139 II.1.3. L"expression en ARNm de Srp40 augmente au cours de la diffŽrenciation.....140 II.1.4. CinŽtique de la diminution de l"expression de Srp40 au cours de la

II.1.5. Srp40 est localisŽe dans le noyau lors de la diffŽrenciation Žrythroïde...........142

II.1.6 Srp40 active l"inclusion de l"exon 16 dans les cellules MEL 745A

indŽpendamment de la diffŽrenciation.........................................................................144

II.2. Discussion........................................................................................................145

II.3. MatŽriels et mŽthodes.......................................................................................147

II.3.1. Culture cellulaire et induction de la diffŽrenciation........................................147

II.3.2. Transfection et Žtablissement des clones stables ............................................147

II.3.3. Construction du vecteur d"expression............................................................148

II.3.4. Extraction d"ARN et analyse par RT-PCR.....................................................148

II.3.5. Extraction des protŽines totales et Western blot.............................................149

II.3.6. Localisation cellulaire de la protŽine de fusion EGFP....................................149

VI- Conclusion gŽnŽrale et perspectives.............................................................................151

4Listes des abréviations

5•4.1B : 4.1 cerŽbrale

•4.1G : 4.1 GŽnŽrale

•4.1N : 4.1 Neuronale

•4.1R : 4.1 Žrythrocytaire

•4.1R135 : Isoforme de 135 kDa de la protŽine 4.1R •4.1R80 : Isoforme de 80 kDa de la protŽine 4.1R

•ADN : Acide dŽsoxyribonuclŽique

•ADNc : Acide DŽsoxyriboNuclŽique complŽmentaire

•AML1 : Acute myeloid leukemia 1

•ARN : Acide ribonuclŽique

•ARNi : ARN interfŽrence

•ARNm : ARN messager

•ASF/SF2 : Alternative splicing factor/Splicing Factor 2

•ATP : AdŽnine Tri-Phosphate

•ATPase : AdŽnine Tri-Phosphatase

•BFU-E: Burst- Forming-Unit Erythroid

•BFU-Meg : Burst-forming unit-megakaryocyte

•CaM : Calmoduline

•CBP : CREB-binding protein

•CELF : CUG-BP and ETR3-like factors

•CFTR : Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

•CFU-E : Colony-Forming Unit-Erythroid

•CFU-G : Colony-Forming Unit-Granulocyte

•CFU-M : Colony-Forming Unit-Macrophage

•Cis : cytokine inductible SH2 domain

•Clk/Sty : Cdc2-like kinases

•CLP : Common Lymphoid Progenitors

•CMP : Common Myeloid Progenitors

•CPAP : Centrosomal P4.1-associated protein

•CSH : Cellules Souche HŽmatopoïŽtique

•CTD: Carboxy-Terminal Domain

•DMSO : Dimethyl sulfoxide

•dNTP : deoxynuclŽotide triphosphates

•EDA : extra domain A

6•EGFP : Enhanced Green Fluorescent Protein

•EKLF : Erythroid Kruppel-Like Factor

•elF3 : facteur de traduction eucaryote 3

•Epo : ErythropoïŽtine

•EpoR : Erythropoietin-Receptor

•ERK : Extracellular-Regulated Kinase

•ERM : talin related proteins

•ESE : Exonic Splicing Enhancer

•ESR : Exonic Splicing Regulator

•ESS : Exonic Splicing Silencer

•Ets : E-twenty six

•FERM : Four.one protein, Ezrin, Radixin, Moesin

•Fli-1 : F-MuLV integration site 1

•F-MuLV : Friend Murine Leukemia Virus

•FOG-1 : Friend of GATA-1

•GAM : Goat Anti-Mouse

•GEMM : Colony Forming Unit Granulocyte/ Erythrocyte/ Megacaryocyte/

Macrophage

•GFP : Green Fluorescent Protein

•GM-CSF : Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor

•GMP : Granulocyte/ Macrophage progenitor

•GMP : Guanine Mono-Phosphate

•GPC : Glycophorine C

•Grb2 : growth factor receptor-bound 2

•GTP : Guanine Tri-Phosphate

•GTPase : Guanine Tri-Phosphatase

•HE : Elliptocytose HŽrŽditaire

•HERF-1 : Hematopoietic Ring Finger-1

•HMBA : Hexamethylene bisacetamide

•HMT : Histone MŽthyl TransfŽrase

•hnRNP : heterogeneous nuclear RiboNucleoProtein

•IgG : Immunoglobulin G

•IL3 : Interleukine 3

•IMDM : Iscove's Modified Dulbecco"s Medium

7•ISE : Intronic Splicing Enhancer

•ISS : Intronic Splicing Silencer

•JAK2 : Janus-Activated Kinase 2

•STAT5 : Signal Transducer and Activator of Transcription 5

•PKC : Protein Kinase C

•Ras : Receiver Adjacent Signal

•KCC2 : co-transporteur cation-chlorure

•kDa : kilo Dalton

•KSRP : KH-type Splicing Regulatory Protein

•LMO2 : LIM domain only 2

•LSm : Like Sm

•LTR-CSH: Long Term Repopulating CSH

•MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase

•MBD: Membrane Binding Domain

•M-CSF : Macrohage Colony Stimulating Factor

•MDCK : Madin-Darby canine kidney

•MEK1 : MAP Kinase/ERK Kinase 1

•MEL : Mouse erythroleukemia

•MEP : Megacaryocyte/ Erythroid Progenitor

•MHC : Major Histocompatibility Complex

•NCAM : MolŽcule d"AdhŽsion des Cellules Neuronales

•NF-E2 : Nuclear Factor-Erythroid 2

•NMD: Nonsense-Mediated mRNA Decay

•Nova : Neuro-oncological ventral antigen

•NuMA: Nuclear mitotic apparatus

•ORF : Open Reading Frame

•PCR : Polymerase Chain Reaction

•PEST : Domaine riche en proline, acide glutamique, sŽrine et thrŽonine •PI-(3,4,5)-P3 : phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate

•PI3K : Phosphatidylinositol-3-Kinase

•PI-(4,5)-P2 : phosphatidylinositol 4,5-biphosphate •Pip/IRF4 : PU.1 interacting partner/ interferon regulatory factor 4

•PS : PhosphatidylSŽrine

•PTB : Polypyrimidine Tract Binding Protein

8•PTC : codon stop prŽmaturŽ

•RB : Retinoblastoma

•RNPs : RiboNucleoProteins

•RRM : RNA Recognition Motif

•RRMH : RNA Recognition Motif Homologous

•RS : Arginine-Serine-Rich domain

•RT : Reverse Transcriptase

•SAB: Spectrin Actin Binding Domain

•SC35 : Spliceosome Component of 35 kDa

•SCF : Stem Cell Factor

•SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

•SFFV : Spleen Focus Forming Virus

•shRNA : small hairpin RNA

•siRNA : small interfering RNA

•snRNA : small nuclear RNA

•snRNPs : small nuclear RiboNucleoprotein Particles

•Spi-1 : SFFV integration site-1

•SR : serine-Arginine-rich

•SRPK : SR protein Kinase

•STR-CSH : Short Term Repopulating CSH

•TAD : Transactivation domain

•TLS : Translocated in liposarcoma

•U2AF : U2 snRNP auxiliary factor

•UsnRNPs: Uridine-rich small nuclear RiboNucleoProtŽins

•UTR : UnTranslated Region

9Listes des figures et tableaux

10Figure 1: L"addition d"une coiffe en 5".

Figure 2: La polyadŽnylation.

Figure 3: Structure de l"intron.

Figure 4: Les deux rŽactions de transŽstŽrification de l"Žpissage.

Figure 5: RŽprŽsentation shŽmatique des diffŽrentes Žtapes de l"assemblage du spliceosome.

Figure 6: Auto-Žpissage des introns du groupe II. Figure 7: Auto-Žpissage des introns du groupe I.

Figure 8: L"Žpissage alternatif.

Figure 9: Les diffŽrents types d"Žpissage alternatif. Figure 10: ElŽments rŽgulateurs de l"Žpissage de l"ARN prŽ-messager. Figure 11: Activation de l"Žpissage par un ESE. Figure 12: Inhibition de l"Žpissage par un ESS. Figure 13 :Inhibition de l"Žpissage par un ISS. Figure 14: ReprŽsentation schŽmatique des protŽines SR. Figure 15 : ReprŽsentation schŽmatique des protŽines relatives aux SR. Figure 16: ReprŽsentation schŽmatique des protŽines SR additionnelles. Figure 17: ReprŽsentation schŽmatique des autres protŽines a domaine RS. Figure 18 : Activation de l"Žpissage par liaison directe des protŽines SR sur un ESE. Figure 19 : Les protŽines SR antagonisent l"effet des rŽpresseurs pour activer l"Žpissage. Figure 20: Activation du site 5" d"Žpissage par les protŽines SR. Figure 21: Intervention des protŽines SR dans la rŽgulation de l"Žpissage constitutif. Figure 22: RŽgulation de l"Žpissage par les protŽines SR indŽpendamment de l"exon. Figure 23 : Inhibition de l"Žpissage par compŽtition entre deux protŽines SR. messager CFTR par les protŽines SR. Figure 27: DŽveloppement de l"ŽrythroleucŽmie de Friend.

Figure 28: ReprŽsentation schŽmatique de la structure d"un rŽcepteur de l"ŽrythropoïŽtine.

Figure 29: ReprŽsentation schŽmatique de la voie de transduction de signal JAK-STAT. Figure 30: Cascades des MAP Kinases activŽes par l"Epo. Figure 31: Activation de la voie PI3K par l"Epo-R. Figure 33 : ƒvŽnements caractŽrisant les ŽrythroleucŽmie de Friend

11Figure 34: ReprŽsentation schŽmatique de la structure primaire de Spi-1/PU.1.

Figure 35: Organisation des domaines des protŽines de la famille 4.1. Figure 37: Structure des isoformes 4.1R135 et 4.1R80. Figure 38: ReprŽsentation schŽmatique des domaines structuraux de la protŽine 4.1R. Figure 39: ReprŽsentation schŽmatique de la membrane du globule rouge. Figure 40: Morphologie du globule rouge normale et pathologique. Figure 41: L"Žpissage de l'exon 16 est hautement rŽgulŽ en fonction du tissu et du stade de diffŽrenciation.

Figure 42: ReprŽsentation schŽmatique des ŽlŽments cis et des facteurs trans impliquŽs dans

la rŽgulation de l"Žpissage de l"exon 16 de 4.1R.

Figure 43: Induction des cellules MEL.

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