[PDF] Strukturbasiertes computergestütztes Wirkstoffdesign an flexiblen

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Strukturbasiertes computergestütztes

Wirkstoffdesign an flexiblen Proteintargets:

Aldose Reduktase und Hsp70

Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der vorgelegt von

Ulrich Peinz

aus Peine

Würzburg 2016

Gutachter der schriftlichen Arbeit

1. Gutachter: _______________________________________________________________

2. Gutachter: _______________________________________________________________

1. Prüfer: __________________________________________________________________

2. Prüfer: __________________________________________________________________

3. Prüfer: __________________________________________________________________

Für Ina und meine Eltern

I

Vorwort

Publikationen

Die vorliegende Dissertation basiert auf computergestützten Untersuchungen, die im Zeitraum von Januar 2008 bis Juni 2011 am Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie Prof. Dr. Christoph A. Sotriffer durchgeführt wurden. Peinz, U., Sotriffer, C. A.: Considering protein flexibility in computational drug design: Aldose Reductase as test case. International Symposium SFB 630, Würzburg, 2009. Peinz, U., Sotriffer, C. A.: Targeting HSP70 Computational analyses and structure- based inhibitor design. 3rd EuCheMS Chemistry Congress, Nürnberg, 2010. Peinz, U., Sotriffer, C. A.: Targeting HSP70 Computational analyses and structure- based inhibitor design. GDCh Jungchemiker-Forum Chem-SyStM, Würzburg, 2010. II

Danksagung

wissenschaftlichen Fragen, für die zahlreichen konstruktiven Diskussionen sowie für die geschaffen wurde. angenehme Zusammenarbeit sowie für die Übernahme des Zweitgutachtens dieser Arbeit bedanken. Herrn Dr. Clemens Grimm bin ich ebenfalls für die spannende Kooperation und gute Zusammenarbeit, für sein Interesse an dieser Arbeit und die Übernahme der Aufgaben des Drittprüfers im mündlichen Promotionskolloquium dankbar. Der Klinischen Forschergruppe 216 (KFO 216) danke ich für die sehr gute und kollegiale Dank geht in diesem Zusammenhang an Frau Prof. Dr. Ulrike Holzgrabe und Dr. Andreas Hartung, an Herrn Prof. Dr. Ralf Bargou und Dr. Mannik Chatterjee sowie ihrer Mitarbeiterin

Elisabeth Müller.

Herrn Prof. Dr. Gerhard Klebe sowie seinen Mitarbeitern Dr. Cornelia Koch und Dr. Andreas Heine danke ich für die gute Zusammenarbeit und die Durchführung der experimentellen Untersuchungen an der Zielstruktur Aldose Reduktase. III Meinen Kollegen aus dem Arbeitskreis Sotriffer Dr. Martin Sippel, Dr. Daniel Cappel, Dr. Monika Nocker, Dr. Benjamin Schaefer, Dr. Armin Welker, Dr. Christine Topf, Dr. Constanze Waltenberger, Dr. David Zilian, Dr. Michael Hein, Steffen Wagner und Manuel Krug für das gute Arbeitsklima, viele interessante Diskussionen und die gegen- seitige Unterstützung. Dr. Bernd Reyer für seine Hilfe bei diversen Computerproblemen.

Abwicklung organisatorischer Angelegenheiten.

Der Gesellschaft Deutscher Chemiker (GDCh) für das Reisestipendium zur Teilnahme am

3rd EuCheMS Chemistry Congress in Nürnberg.

Kay für seine Hilfe bei technischen Fragestellungen und weiterführende Diskussionen. Meinen Eltern für ihre dauerhafte Unterstüzung. IV V

Inhaltsverzeichnis

I Einleitung ........................................................................................................................... 1

I.1 Strukturbasiertes computergestütztes Wirkstoffdesign .............................................. 1

I.3 Zielsetzungen .............................................................................................................. 9

II Methoden und Verfahren des computerbasierten Wirkstoffdesigns ....................... 11 II.2 Computergestützte Bindetaschenanalyse - Identifizierung von hot spots................ 14

II.3 Virtuelle Datenbanksuche ......................................................................................... 17

II.3.1 Datenbanksuche anhand von Pharmakophormodellen .................................... 17 II.3.2 Ligandbasierte Datenbanksuche mit FeatureTreesXL ...................................... 19

II.4 Dockingsimulationen und Scoringfunktionen ............................................................ 20

II.5 Molekulardynamik Simulationen................................................................................ 28

III Gezielte Stabilisierung einer neuen MD-generierten Bindetaschenkonformation ....

der Aldose Reduktase .................................................................................................... 33

III.1 Das Modellsystem Aldose Reduktase....................................................................... 33

III.1.1 Klassifizierung .................................................................................................... 33

III.1.2 Struktureller Aufbau der Aldose Reduktase ...................................................... 33

III.1.3 Katalytischer Mechanismus ............................................................................... 35

III.1.4 Physiologische Bedeutung ................................................................................. 37

III.1.5 Pathophysiologie: Bedeutung der Aldose Reduktase bei der Entstehung ..........

diabetischer Folgeerkrankungen........................................................................ 39

III.1.6 Inhibitoren der Aldose Reduktase ...................................................................... 42

III.2 Aufgabenstellung ....................................................................................................... 48

III.3 Hintergrundinformationen .......................................................................................... 49

III.3.1 Charakterisierung der MD-generierten Bindetaschenkonformation .................. 52

III.4 Vorgehensweise, Ergebnisse und Diskussion .......................................................... 55

III.4.1 Vergleichende Dockingstudien von AR-Pyridazinon-Inhibitoren ....................... 55 III.4.2 Computergestützte Identifizierung neuer Inhibitoren der Aldose Reduktase ...... für eine gezielte Stabilisierung einer neuen Bindetaschenkonformation .......... 60 VI

III.4.2.1 Proteinbasierter Ansatz .............................................................................. 62

III.4.2.1.1 Vergleichende Strukturanalyse verschiedener AR-Ligand-Komplexe .. 62 III.4.2.1.2 Analyse der Bindetasche hinsichtlich günstiger Interaktionspunkte ...... 66 III.4.2.1.3 Pharmakophorhypothesen und virtuelle Datenbanksuchen .................. 71

III.4.2.2 Ligandbasierter Ansatz ............................................................................... 76

III.4.2.2.1 Aufbau einer Pyridazinon-Moleküldatenbank ........................................ 77 III.4.2.2.2 Ligandbasierte Datenbanksuchen mittels FeatureTreesXL ................... 77 III.4.2.3 Zusammenfassung der virtuellen Datenbanksuchen ................................. 79 III.4.3 Dockingsimulationen der virtuell identifizierten Verbindungen: ............................

III.4.5 Finale Molekülauswahl ....................................................................................... 89

III.4.6 Experimentelle Bestimmung des Inhibitionspotenzials und ..................................

III.4.7 Schlussfolgerung ................................................................................................ 99

IV Targeting Hsp70 Design einer neuen Inhibitorklasse ........................................... 100

IV.1 Hitzeschockprotein 70: Vorstellung der Zielstruktur ............................................... 100

IV.1.1 Klassifizierung .................................................................................................. 100

IV.1.2 Struktureller Aufbau von Hsp70 ....................................................................... 101

IV.1.3 Katalytischer Mechanismus ............................................................................. 107

IV.1.4 Physiologische Bedeutung ............................................................................... 111

IV.1.5 Pathophysiologie: Hsp 70 ein therapeutisches Target ................................. 113

IV.1.6 Hsp70-Inhibitoren ............................................................................................. 117

IV.2 Aufgabenstellung ..................................................................................................... 122

IV.3 Vorgehensweise, Ergebnisse und Diskussion ........................................................ 123

IV.3.1 Computergestützte Suche nach der Hsp70-Bindestelle von Apoptozol ..............

mittels Cross-Dockingverfahren ....................................................................... 123

Design neuartiger Hsp70-Inhibitoren ............................................................... 138

IV.3.2.1 Identifizierung von Kandidatenmolekülen durch virtuelles Screening ..... 138

IV.3.2.1.1 Proteinbasierter Ansatz ........................................................................ 138

VII

IV.3.2.1.2 Ligandbasierter Ansatz ........................................................................ 146

IV.3.2.1.4 Re- und Consensus-Scoring ................................................................ 147

IV.3.2.1.5 Auswahl der Kandidatenmoleküle für experimentelle Analysen ......... 148 IV.3.2.1.6 Experimentelle Untersuchungen der Kandidatenmoleküle ................. 157 mit Hilfe eines Homologiemodelansatzes ........................................................ 167 IV.3.4 Molekulardynamische Untersuchungen von Hsp70 ........................................ 172

IV.3.4.1 Rationale und Zielsetzung ........................................................................ 172

IV.3.4.2 Durchführung der Molekulardynamik Simulationen ................................. 173

IV.3.4.3 Ergebnisse und Diskussion ...................................................................... 175

IV.3.4.3.1 Molekulardynamik Simulation von Hsc70 ............................................ 175 IV.3.4.3.2 Molekulardynamik Simulation von HM-Hsc70 ..................................... 185 IV.3.4.3.3 Molekulardynamik Simulation einer Hsc70-Az-Komplexstruktur ........ 192

IV.3.4.4 Zusammenfassung ................................................................................... 199

V Zusammenfassung und Ausblick / Summary and Outlook ..................................... 201

V.1 Zusammenfassung und Ausblick ............................................................................ 201

V.2 Summary and Outlook ............................................................................................. 205

VI Anhang ........................................................................................................................... 209

VI.2 Multisequenzanalyse ............................................................................................... 212

VI.4 Ergebnisse der computergestützten Suche nach der Hsp70-Bindestelle ...................

von Apoptozol mittels Cross-Dockingverfahren ...................................................... 217

VI.4.1 Ergebnisse des Dockingverfahrens von Apoptozol an der Nukleotid- ..................

bindetasche von Hsc70 .................................................................................... 217

VI.4.2 Ergebnisse des Dockingverfahrens von Apoptozol an der Substrat- ...................

bindetasche von Hsc70 .................................................................................... 219

interface von Hsc70.......................................................................................... 220

VIII

struktur von Hsc70 ........................................................................................... 221

VI.4.5 Ergebnisse des Dockingverfahrens von Apoptozol an einer erweiterten ............. VI.6 Ergebnisse der RMSD-Wert Analysen der MD Simulationen ................................ 231

VI.6.1 Molekulardynamik Simulation von Hsc70 ........................................................ 231

VI.6.2 Molekulardynamik Simulation von HM-Hsc70 ................................................. 232

VI.6.3 Molekulardynamik Simulation einer Hsc70-Az-Komplexstruktur .................... 233

VI.7 Abkürzungsverzeichnis............................................................................................ 234

VII Literaturverzeichnis ...................................................................................................... 238

1

I Einleitung

I.1 Strukturbasiertes computergestütztes Wirkstoffdesign Die Entwicklung neuer Wirkstoffe zur Behandlung verschiedenster Krankheiten und die kontinuierliche Verbesserung bekannter Arzneistoffe sind die zentralen Aufgaben der Verfahren bei der Suche nach neuen, biologisch aktiven Verbindungen, sogenannten hits, gegenüber therapeutisch relevanten makromolekularen Zielstrukturen (Targets) zur Identifizierung von neuen Leitstrukturen ist das High Throughput Screening (HTS).1 Das HTS besteht in der automatisierten Analyse von Substanzen umfangreicher Molekülbibliotheken mittels biochemischer in vitro Assays. Erfüllen die biologisch aktiven Verbindungen bestim- pharmakologischen Eigenschaften, wie Bioverfügbarkeit und Pharmakokinetik, schließlich quoten, einem hohen Kosten- und Zeitaufwand sowie der Limitierung auf vorab synthetisierte

Verbindungen.

HTS für die Identifizierung und Entwicklung neuer Arzneistoffe stellt das strukturbasierte computergestützte Wirkstoffdesign in Form des virtuellen Screenings (VS) dar.2,3 Das VS ist ein Verfahren, bei dem große Moleküldatenbanken computergestützt nach geeigneten niedermolekularen Liganden für therapeutische Targets durchsucht werden. Allerdings

bezieht sich der Begriff in der Regel nicht ausschließlich auf die reine Datenbanksuche,

sondern umfasst generell alle angewandten computerbasierten Analysenmethoden bis hin zur abschließenden Molekülauswahl. (dreidimensionale Proteinstrukturen oder Strukturen biologisch aktiver Liganden) dem VS aktiven Liganden bekannt sind, so erfolgt ein de novo-Design, die Entwicklung neuer 2 Wirkstoffe ohne signifikante Ähnlichkeiten zu bereits existierenden Leitstrukturen. Dabei werden die gesuchten Liganden entweder Schritt für Schritt in der Bindetasche eines verknüpft (Linking).4 Damit sowohl eine starke, als auch selektive Bindung resultiert, ist eine Zielprotein erforderlich. Fehlen dreidimensionale Strukturen des Zielproteins, ist es dennoch Computerprogrammen als Homologiemodelle konstruiert werden. Versuche, mit Hilfe von Ligandenserien Struktur-Wirkungsbeziehungen (Structure-Activity Relationships) abzuleiten, das Mittel der Wahl. Im Idealfall existieren bereits Strukturen entsprechender Protein-Ligand-Komplexe, die als Ausgangspunkte für eine rationale, erleichtert die Suche nach neuen Liganden erheblich, da hierbei neben den einseitigen Neben den Templatstrukturen an sich, sind darüber hinaus für ein erfolgreiches Screening einbezogen werden. Eine wichtige Methode für die Entwicklung neuer Liganden durch de novo-Designstudien, als auch bei der Optimierung bekannter Wirkstoffe, stellt die Identifizierung günstiger Wechselwirkungsbereiche innerhalb der zu adressierenden Rezeptorbindetasche dar, die mit Hilfe spezieller Computerprogramme berechnet werden chemischen Konstitution potenzieller Leitstrukturen ableiten, die als Suchanfragen, z.B. in Im Anschluss an die Identifizierung potenziell geeigneter Liganden erfolgen im Rahmen des Kandidatenmoleküle am jeweiligen Zielprotein durch Dockingsimulationen. Weiterhin ist für den Erfolg eines virtuellen Screeningverfahrens eine valide Vorhersage der zu erwartenden 3 Nach der Auswahl der vielversprechendsten Kandidatenmoleküle erfolgt die Synthese oder Bestellung der in silico identifizierten Verbindungen bei kommerziellen Anbietern für die mittels in vitro bzw. in vivo Assays, die in der Regel den Abschluss eines VS bildet. Die resultierenden Erkenntnisse der experimentellen Analysen, idealerweise einhergehend mit zur Verbesserung der erstellten Computermodelle und andererseits als Startpunkte für nachfolgende Screeningzyklen dienen. Zahlreiche Beispiele der letzten Jahre über die erfolgreiche Anwendung virtueller Aufgrund der unverzichtbaren abschließenden experimentellen Überprüfung der durch das VS kein alleiniger Ersatz für ein HTS. Vielmehr rückt seit einigen Jahren die komplemen- Synergien für eine Zeitersparnis und Kostensenkung zu nutzen. So ist ein Einsatz des VS targetspezifischer Molekülbibliotheken mit Hilfe computerbasierter Methoden sinnvoll.10 Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden virtuelle Screeningverfahren zur Identifizierung neuer Inhibitoren der Enzyme Aldose Reduktase und Hitzeschockprotein 70 durchgeführt. Ein Überblick über das dabei verwendete Methodenspektrum des computergestützten

Wirkstoffdesigns erfolgt in Kapitel II.

Identifizierung und Entwicklung niedermolekularer Verbindungen, die die Funktionen biologischer Zielstrukturen (Targets) gezielt beeinflussen. Bei diesen Targets handelt es sich 4 Geschwindigkeiten biochemischer Reaktionen durch Absenkung der freien Aktivierungs- Damit die im Rahmen von Wirkstoffdesignstudien entwickelten Moleküle ihre pharma- entsprechenden Rezeptoren binden. Somit ist es bei der Liganden- bzw. Wirkstoff- das jeweilige Proteinverhalten bei der Bindung eines Liganden, wie z.B. der jeweilige den ersten Hypothesen, haben mittlerweile zahlreiche experimentelle Untersuchungen ungebundenen Proteinstrukturen und Protein-Ligand-Komplexstrukturen durchgeführt umfassen.12,13 Weiterhin konnten Eisenmesser et al.14 mittels NMR-spektroskopischenquotesdbs_dbs31.pdfusesText_37

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